Desarrollo y caracterización de un material celular de alta porosidad con base cementicia activada mediante agentes inorgánicos

Esta tesis ha estudiado los morteros celulares, centrándose en la experimentación con pastas de cemento aireadas (PCA) con polvo de aluminio como agente expansor. El objetivo es el desarrollo de un material cementicio con una baja conductividad térmica que sirva como aislamiento térmico. La naturaleza inorgánica del material lo hace incombustible, en contraste con las espumas poliméricas existentes en el mercado, cuya aplicación en cámaras ventiladas ha sido prohibida por normativas de construcción tanto a nivel nacional como internacional. Las posibles aplicaciones son con proyección neumática o en paneles prefabricados. Se han ensayado dos series de pastas de cemento con polvo de aluminio: - Serie WPC/CAC/CH. Mezcla de referencia con cemento blanco (WPC), cemento de aluminato cálcico (CAC) y cal aérea (CH) en proporción 5:1:4. - Serie OPC/CH. Mezcla de referencia con cemento portland con cenizas volantes (OPC) y cal aérea (CH) en proporción OPC/CH de 4:1 A las mezclas de referencia se le han añadido adiciones de metacaolín (MK) (10 y 20%) o sepiolita (SP) (1 y 2%) para observar el efecto que producen tanto en el mortero fresco como en el mortero endurecido. Se ha estudiado la reología de las pastas en estado fresco, analizando el proceso de expansión de las pastas, registrando los valores de tensión de fluencia, aire ocluido y temperatura durante la expansión. Con los valores obtenidos se ha discutido la influencia de las adiciones utilizadas en la cinética de corrosión del polvo de aluminio que genera la expansión, concluyendo que las adiciones puzolánicas (CV y MK) y la SP reducen mucho el periodo de inducción, lo que provoca poros más grandes y mayor cantidad de aire ocluido. Asimismo se ha analizado la relación entre la tensión de fluencia y el contenido de aire ocluido, deduciendo que a mayor tensión de fluencia en el momento de iniciarse la expansión, menor tamaño de poros y contenido de aire ocluido. Finalmente, se han obtenido las densidades y capacidades de retención de agua de los morteros frescos. Para caracterizar la red porosa de las pastas aireadas endurecidas, se obtuvieron tanto las densidades reales, netas, aparentes y relativas como las porosidades abiertas, cerradas y totales con ensayos hídricos. Finalmente se obtuvieron imágenes de los poros con tomografía axial computerizada para obtener las porosimetrías de las muestras. La caracterización de la red porosa ha servido para terminar de analizar lo observado en la evolución de la expansión del mortero fresco. Se ha analizado la influencia de la red porosa en la conductividad térmica, obtenida con caja caliente, comparándola con la existente en la literatura existente tanto de morteros celulares como de espumas poliméricas. Se concluye que los valores de conductividad térmica conseguida están en el mínimo posible para un material celular de base cementicia. La microestructura se ha estudiado con microscopía electrónica de barrido, difracción de rayos X y ensayos térmicos TG/ATD, observando que los productos de hidratación encontrados coinciden con los que se producen en morteros sin airear. Las imágenes SEM y los resultados de ultrasonidos han servido para analizar la presencia de microfisuras de retracción en las pastas aireadas, observando que en las muestras con adiciones de MK y SP, se reduce la presencia de microfisuras. ABSTRACT This thesis has studied cellular mortars, focusing in testing aerated cement pastes with aluminum powder as expansive agent. The purpose is the development of a cementitious material with low thermal conductivity that can be used as thermal isolation. Inorganic nature of this material makes it non-combustible, in contrast with polymeric foams in market, whose application in ventilated double skin façade systems has been banned by building standards, both domestically and internationally. Possible uses for this material are pneumatically sprayed applications and precast panels. Two series of batches with aluminum powder have been tested: - WPC/CAC/CH series. Reference paste with white portland cement (WPC), calcium aluminate cement (CAC) and lime (CH) with 5:1:4 ratio. - OPC/CH series. Reference paste with portland cement with fly ash (OPC) and lime (CH) with 4:1 ratio. Metakaolin (MK) (10 and 20%) or sepiolite (SP) (1 and 2%) additions were used in reference pastes to characterize the effect in fresh and hardened mortar. Rheology in fresh pastes was studied, expansion process of pastes was analyzed, recording yield stress, entrained air and temperature values during expansion. Recorded values were used to discuss influence of additions on reaction kinetics of aluminum powder corrosion, that produces expansion.. Conclusion is that pozzolanic additions (FA and MK) and SP greatly reduce induction period, producing bigger pores and more entrained air. Relation between yield stress and entrained air has been also analyzed, observing that the bigger yield stress at beginning of expansion, the smaller pores size and the lower entrained air values. Finally density and water retention of fresh mortars were obtained. Pore network in hardened aerated cement pastes was characterized by imbibition methods providing true, bulk and relative density, and providing also open, closed and total porosity. Finally, pore system imaging were obtained with computerized axial tomography to study porosimetry of specimens. Pore network characterization was useful to complete facts analysis observed in expansion of fresh mortars. Influence of pore network in thermal conductivity, checked in hot box, was analyzed comparing with those existing values in cellular mortar and polymeric foams researches. It was concluded that thermal conductivity values achieved are close to minimum possible in a cementitious cellular material. Microstructure was studied with Scanning Electron Microscopy, X-Ray Diffractometry and TG-DTA analysis, observing that hydration phases found, are those produced in non aerated mortar. SEM imaging and ultrasound results were useful to analyze shrinkage microcracks in aerated cement pastes, concluding that microcrack presence in specimens with MK and SP additions were reduced.

Sensitization profiles and cross-reactivity among plant allergens. Molecular mechanisms of food allergy development and the role of enhancers

La prevalencia de las alergias está aumentando desde mediados del siglo XX, y se estima que actualmente afectan a alrededor del 2-8 % de la población, pero las causas de este aumento aún no están claras. Encontrar el origen del mecanismo por el cual una proteína inofensiva se convierte en capaz de inducir una respuesta alérgica es de vital importancia para prevenir y tratar estas enfermedades. Aunque la caracterización de alérgenos relevantes ha ayudado a mejorar el manejo clínico y a aclarar los mecanismos básicos de las reacciones alérgicas, todavía queda un largo camino para establecer el origen de la alergenicidad y reactividad cruzada. El objetivo de esta tesis ha sido caracterizar las bases moleculares de la alergenicidad tomando como modelo dos familias de panalergenos (proteínas de transferencia de lípidos –LTPs- y taumatinas –TLPs-) y estudiando los mecanismos que median la sensibilización y la reactividad cruzada para mejorar tanto el diagnóstico como el tratamiento de la alergia. Para ello, se llevaron a cabo dos estrategias: estudiar la reactividad cruzada de miembros de familias de panalérgenos; y estudiar moléculas-co-adyuvantes que pudieran favorecer la capacidad alergénica de dichas proteínas. Para estudiar la reactividad cruzada entre miembros de la misma familia de proteínas, se seleccionaron LTPs y TLPs, descritas como alergenos, tomando como modelo la alergia a frutas. Por otra parte, se estudiaron los perfiles de sensibilización a alérgenos de trigo relacionados con el asma del panadero, la enfermedad ocupacional más relevante de origen alérgico. Estos estudios se llevaron a cabo estandarizando ensayos tipo microarrays con alérgenos y analizando los resultados por la teoría de grafos. En relación al estudiar moléculas-co-adyuvantes que pudieran favorecer la capacidad alergénica de dichas proteínas, se llevaron a cabo estudios sobre la interacción de los alérgenos alimentarios con células del sistema inmune humano y murino y el epitelio de las mucosas, analizando la importancia de moléculas co-transportadas con los alérgenos en el desarrollo de una respuesta Th2. Para ello, Pru p 3(LTP y alérgeno principal del melocotón) se selección como modelo para llevarlo a cabo. Por otra parte, se analizó el papel de moléculas activadoras del sistema inmune producidas por patógenos en la inducción de alergias alimentarias seleccionando el modelo kiwi-alternaria, y el papel de Alt a 1, alérgeno mayor de dicho hongo, en la sensibilización a Act d 2, alérgeno mayor de kiwi. En resumen, el presente trabajo presenta una investigación innovadora aportando resultados de gran utilidad tanto para la mejora del diagnóstico como para nuevas investigaciones sobre la alergia y el esclarecimiento final de los mecanismos que caracterizan esta enfermedad. ABSTRACT Allergies are increasing their prevalence from mid twentieth century, and they are currently estimated to affect around 2-8% of the population but the underlying causes of this increase remain still elusive. The understanding of the mechanism by which a harmless protein becomes capable of inducing an allergic response provides us the basis to prevent and treat these diseases. Although the characterization of relevant allergens has led to improved clinical management and has helped to clarify the basic mechanisms of allergic reactions, it seems justified in aspiring to molecularly dissecting these allergens to establish the structural basis of their allergenicity and cross-reactivity. The aim of this thesis was to characterize the molecular basis of the allergenicity of model proteins belonging to different families (Lipid Transfer Proteins –LTPs-, and Thaumatin-like Proteins –TLPs-) in order to identify mechanisms that mediate sensitization and cross reactivity for developing new strategies in the management of allergy, both diagnosis and treatment, in the near future. With this purpose, two strategies have been conducted: studies of cross-reactivity among panallergen families and molecular studies of the contribution of cofactors in the induction of the allergic response by these panallergens. Following the first strategy, we studied the cross-reactivity among members of two plant panallergens (LTPs , Lipid Transfer Proteins , and TLPs , Thaumatin-like Proteins) using the peach allergy as a model. Similarly, we characterized the sensitization profiles to wheat allergens in baker's asthma development, the most relevant occupational disease. These studies were performed using allergen microarrays and the graph theory for analyzing the results. Regarding the second approach, we analyzed the interaction of plant allergens with immune and epithelial cells. To perform these studies , we examined the importance of ligands and co-transported molecules of plant allergens in the development of Th2 responses. To this end, Pru p 3, nsLTP (non-specific Lipid Transfer Protein) and peach major allergen, was selected as a model to investigate its interaction with cells of the human and murine immune systems as well as with the intestinal epithelium and the contribution of its ligand in inducing an allergic response was studied. Moreover, we analyzed the role of pathogen associated molecules in the induction of food allergy. For that, we selected the kiwi- alternaria system as a model and the role of Alt a 1 , major allergen of the fungus, in the development of Act d 2-sensitization was studied. In summary, this work presents an innovative research providing useful results for improving diagnosis and leading to further research on allergy and the final clarification of the mechanisms that characterize this disease.

Respuesta hipofisaria y ovulatoria de conejas nulíparas alimentadas con dietas suplementadas con ácidos grasos poliinsaturados n-3.

Veinte conejas nulíparas se alimentaron ad libitum desde las 10 a las 16 semanas de edad con dos piensos isofibrosos, isoenergéticos e isoproteicos suplementados con dos fuentes de grasa diferentes: 0,75% de manteca para la dieta control (grupo C; n=10) ó 1,5% de un suplemento (Optomega-50; Optivite International Ltd., España) que contenía un 50% de extracto etérero y 38% de ácidos grasos poli-insaturados n-3 (AG n-3) para la dieta experimental (grupo P; n=10). A las 16 semanas de edad se determinó el consumo de pienso, así como la tasa de ovulación y las concentraciones plasmáticas de progesterona y LH a 0, 60 min, 5, 7 y 9 días post-inducción de ovulación con 20 μg de Gonadorelina (Inducel-GnRH, Lab. Ovejero). El consumo de pienso (150,5 g/d), el pico preovulatorio de LH (149,7±10,9 ng/ml), la tasa de ovulación (95%) y el número de cuerpos lúteos (9,8±0,7) fueron similares entre tratamientos. Las concentraciones plasmáticas de progesterona aumentaron a los 60 minutos (7,13±19 ng/ml) y 5 días (13,3±1,9 ng/ml) con respecto al día 0 (0,7±1,9 ng/ml; P<0.05), permaneciendo elevadas el día 9 en ambos grupos (19,4±1,9 ng/ml). Además, el día 5 y 7 post-inducción, las hembras alimentadas con la dieta P tendieron a tener niveles más elevados de progesterona en sangre que las alimentadas con la dieta C (16,6±1,9 vs.12,6±1,8 y 19,0±1,8 vs. 15,5±2,1 ng/ml, P=0,068 y P=0,082; respectivamente) que coinciden con el momento de la implantación embrionaria en esta especie. Por lo tanto, la suplementación con AG n-3 podría mejorar los niveles de progesterona en sangre y por lo tanto reducir la mortalidad embrionaria en este punto.

Desarrollo de métodos para la caracterización predictiva acoplada de tensiones y deformaciones en procesos de tratamiento superficial mediante ondas de choque generadas por láser

En ingeniería los materiales están sujetos a un proceso de degradación desde el mismo momento en el que concluye su proceso de fabricación. Cargas mecánicas, térmicas y agresiones químicas dañan las piezas a lo largo de su vida útil. El daño generado por procesos de fatiga, corrosión y desgaste son unos pocos ejemplos de posible deterioro. Este deterioro de las piezas se combate mediante la prevención en la etapa de diseño, a través de reparaciones periódicas y mediante la sustitución de piezas en servicio. La mayor parte de los tipos de daño que pueden sufrir los materiales durante su vida útil se originan en la superficie. Por esta razón, el objetivo de los tratamientos superficiales es inhibir el daño a través de la mejora de las propiedades superficiales del material, intentando no generar sobrecostes inasumibles en el proceso productivo ni efectos colaterales notablemente perjudiciales. En general, se ha de llegar a una solución óptima entre el coste del tratamiento superficial y el beneficio generado por el aumento de la vida útil del material. En esta tesis se estudian los efectos del tratamiento superficial de aleaciones metálicas mediante ondas de choque generadas por láser. Su denominación internacional más empleada "Láser Shock Processing" hace que se emplee la denominación de procesos de LSP para referirse a los mismos. También se emplea la denominación de "Láser Peening" por semejanza al tratamiento superficial conocido como "Shot Peening", aunque su uso sólo está generalizado en el ámbito industrial. El tratamiento LSP es una alternativa eficaz a los tratamientos tradicionales de mejora de propiedades superficiales, mejorando la resistencia a la fatiga, a la corrosión y al desgaste. El tratamiento LSP se basa en la aplicación de uno o varios pulsos láser de elevada intensidad (superior a 1 GW/cm2) y con duración en el dominio de los nanosegundos sobre la superficie de la pieza metálica a tratar. Esta, bien se recubre con una fina capa de medio confinante (generalmente una fina capa de agua) transparente a la radiación láser, bien se sumerge en el medio confinante (también se usa agua). El pulso láser atraviesa el medio confinante hasta llegar a la superficie de la pieza. Es entonces cuando la superficie inmediatamente se vaporiza y se ioniza, pasando a estado de plasma. Como el plasma generado es confinado por el medio confinante, su expansión se limita y su presión crece. De este modo, el plasma alcanza presiones de varios GPa y crea dos ondas de choque: una de las cuales se dirige hacia el medio confinante y la otra se dirige hacia la pieza. Esta última produce un cráter microscópico por aplastamiento mecánico, generándose deformación plástica y un campo de tensiones residuales de compresión que mejoran las propiedades superficiales del material. La capacidad de los procesos LSP para mejorar las propiedades de materiales metálicos es indiscutible. En la bibliografía está reflejado el trabajo experimental y de simulación que se ha llevado a cabo a lo largo de los años en orden a optimizar el proceso. Sin embargo, hay pocos estudios que hayan tratado exhaustivamente la física del proceso. Esto es debido a la gran complejidad de la fenomenología física involucrada en los procesos LSP, con comportamientos no lineales tanto en la generación y dinámica del plasma como en la propagación de las ondas de choque en el material. Además, el elevado coste de los experimentos y su duración, así como el gran coste computacional que debían asumir los antiguos modelos numéricos, dificultó el proceso de optimización. No obstante, los nuevos sistemas de cálculo son cada vez más rápidos y, además, los programas de análisis de problemas no lineales por elementos finitos son cada vez más sofisticados, por lo que a día de hoy es posible desarrollar un modelo exhaustivo que no solo permita simular el proceso en situaciones simplificadas, sino que pueda ser empleado para optimizar los parámetros del tratamiento en casos reales y sobre áreas extensas. Por esta razón, en esta tesis se desarrolla y se valida un modelo numérico capaz de simular de manera sistemática tratamientos LSP en piezas reales, teniendo en cuenta la física involucrada en los mismos. En este sentido, cabe destacar la problemática del tratamiento LSP en placas delgadas. La capacidad del LSP para inducir tensiones residuales de compresión bajo la superficie de materiales con un espesor relativamente grueso (> 6 mm) con objeto de mejorar la vida en fatiga ha sido ampliamente demostrada. Sin embargo, el tratamiento LSP en especímenes delgados (típicamente < 6 mm, pero también mayores si es muy alta la intensidad del tratamiento) conlleva el efecto adicional del doblado de la pieza tratada, un hecho que puede ser aprovechado para procesos de conformado láser. Este efecto de doblado trae consigo una nueva clase de problemas en lo referente a los perfiles específicos de tensiones residuales en las piezas tratadas, ya que al equilibrarse las tensiones tras la retirada de su sujeción puede afectar considerablemente el perfil de tensiones residuales obtenido, lo que posiblemente puede derivar en la obtención de un perfil de tensiones residuales no deseado y, lo que puede ser aún más crítico, una deformación indeseable de la pieza en cuestión. Haciendo uso del modelo numérico desarrollado en esta Tesis, el análisis del problema del tratamiento LSP para la inducción de campos de tensiones residuales y la consecuente mejora de la vida en fatiga en piezas de pequeño espesor en un modo compatible con una deformación asumible se aborda de forma específica. La tesis está estructurada del siguiente modo: i) El capítulo 1 contiene una introducción al LSP, en la que se definen los procesos de tratamiento de materiales mediante ondas de choque generadas por láser. A continuación se expone una visión panorámica de las aplicaciones industriales de la tecnología LSP y, por último, se realiza una comparativa entre la tecnología LSP y otras tecnologías en competencia en el ámbito industrial: Shot Peening, Low Plasticity Burnishing y Waterjet Peening. ii) El capítulo 2 se divide en dos partes: fundamentos físicos característicos del tratamiento LSP y estado del arte de la modelización de procesos LSP. En cuanto a la primera parte, fundamentos físicos característicos del tratamiento LSP, en primer lugar se describe la física del tratamiento y los principales fenómenos que tienen lugar. A continuación se detalla la física de la interacción confinada en agua y la generación del pulso de presión asociado a la onda de choque. También se describe el proceso de saturación de la presión máxima por ruptura dieléctrica del agua y, por último, se describe la propagación de las ondas de choque y sus efectos en el material. En cuanto a la segunda parte, el estado del arte de la modelización de procesos LSP, recoge el conocimiento preexistente al desarrollo de la propia Tesis en los siguientes campos: modelización de la generación del plasma y su expansión, modelización de la ruptura dieléctrica del medio confinante, modelización del pulso de presión aplicado al material y la respuesta del mismo: inducción de tensiones residuales y deformaciones. iii) El capítulo 3 describe el desarrollo de un modelo propio para la simulación de las tensiones residuales y las deformaciones generadas por procesos LSP. En él se detalla la simulación de la propagación del pulso de presión en el material, los pormenores de su puesta en práctica mediante el método de los elementos finitos, la determinación de parámetros realistas de aplicación y se establece un procedimiento de validación de los resultados. iv) El capítulo 4 contiene los resultados de la aplicación del modelo a distintas configuraciones de interés en tratamientos LSP. En él se recoge un estudio del tratamiento LSP sobre áreas extensas que incluye un análisis de las tensiones residuales inducidas y un análisis sobre la influencia de la secuencia de barrido de los pulsos en las tensiones residuales y en las deformaciones. También se presenta un estudio específico de la problemática del tratamiento LSP en piezas de pequeño espesor y se detallan dos casos prácticos abordados en el CLUPM de gran interés tecnológico en función de las aplicaciones reales en las que se ha venido trabajando en los últimos años. v) En el capítulo 5 se presentan las conclusiones derivadas de los resultados obtenidos en la tesis. Concretamente, se destaca que el modelo desarrollado permite reproducir las condiciones experimentales de los procesos de LSP reales y predecir los efectos mecánicos inducidos por los mismos. Los anexos incluidos como parte accesoria contienen información importante que se ha utilizado en el desarrollo de la Tesis y que se desea incluir para hacer el volumen autoconsistente: i) En el anexo A se presenta una revisión de conceptos básicos sobre el comportamiento de los sólidos sometidos a ondas de choque [Morales04]. ii) El anexo B contiene la resolución analítica de la ecuación de ritmo utilizada en el código DRUPT [Morales04]. iii) El anexo C contiene la descripción de los procedimientos de uso del modelo de simulación desarrollado en la Tesis y el código fuente de la subrutina OVERLAP desarrollada para programar el solapamiento de pulsos en tratamientos LSP sobre áreas extensas. iv) El anexo D contiene un resumen de las principales técnicas para la medición de las tensiones residuales en los materiales [PorrolO] y [Gill2]. v) El anexo E contiene una descripción de las instalaciones experimentales del CLUPM en el que se han desarrollado los procesos LSP utilizados en la validación del modelo desarrollado [PorrolO].

Expresión de la resistencia en plantas de tomate a nematodos formadores de nódulos (Meloidogyne javanica)

La resistencia genética mediada por los genes R es uno de los sistemas de defensa de las plantas frente a patógenos y se activa una vez que los patógenos han superado la defensa basal que otorgan la cutícula y pared celular. Los mecanismos de resistencia genética se inician a su vez, por el reconocimiento de productos derivados de genes de avirulencia de los patógenos (avr) por parte de las proteínas R. Tanto la respuesta de defensa basal como la respuesta de defensa por genes R están influenciadas por patrones de regulación hormonal, que incluye a las principales hormonas vegetales ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA) y etileno (ET). En tomate (Solanum lycopersicum) uno de los genes R es el gen MiG1, que confiere resistencia a nematodos formadores de nódulos (Meloidogyne javanica, M. incognita y M. arenaria). Uno de los eventos más importantes que caracterizan a la respuesta de resistencia es la reacción hipersensible (HR), que está mediada por la activación temprana de una serie de sistemas enzimáticos, entre los que destaca el de las peroxidasas (PRXs) Clase III. Su función es importante tanto para limitar el establecimiento y expansión del nematodo, al generar ambientes altamente tóxicos por su contribución en la producción masiva de ROS, como por su implicación en la síntesis y depósito de lignina generando barreras estructurales en el sitio de infección. Además de estos mecanismos de defensa asociados a la resistencia constitutiva, las plantas pueden desarrollar resistencia sistémica adquirida (SAR) que en la naturaleza ocurre, en ocasiones, en una fase posterior a que la planta haya sufrido el ataque de un patógeno. Así mismo hay diferentes productos de origen químico como el benzotiadiazol o BTH (ácido S-metil benzol-(1,2,3)-tiadiozole-7-carbónico ester) que pueden generar esta misma respuesta SAR. Como resultado, la planta adquiere resistencia sistémica frente a nuevos ataques de patógenos. En este contexto, el presente trabajo aborda en primer lugar el análisis comparativo, mediante microarrays de oligonucleótidos, de los transcriptomas de los sistemas radicales de plantas de tomate de 8 semanas de edad de dos variedades, una portadora del gen de resistencia MiG1 (Motelle) y otra carente del mismo y, por tanto, susceptible (Moneymaker), antes y después de la infección por M. javanica. Previo a la infección se observó que la expresión de un gran número de transcritos era más acusada en la variedad resistente que en la susceptible, entre ellos el propio gen MiG1 o los genes PrG1 (o P4), LEJA1 y ER24, lo que indica que, en ausencia de infección, las rutas hormonales del SA, JA y ET están más activas en la raíz de la variedad resistente. Por el contrario, un número mucho menor de transcritos presentaban su expresión más reducida en Motelle que en Moneymaker, destacando un gen de señalización para sintetizar la hormona giberelina (GA). La infección por M. javanica causa importantes cambios transcripcionales en todo el sistema radical que modifican sustancialmente las diferencias basales entre plantas Motelle y Moneymaker, incluida la sobreexpresión en la variedad resistente de los transcritos de MiG1, que se reduce parcialmente, mientras que las rutas hormonales del SA y el JA continuan más activas que en la susceptible (evidente por los genes PrG1 y LEJA1). Además, los cambios asociados a la infección del nematodo se evidencian por las grandes diferencias entre los dos tiempos post-infección considerados, de tal forma que en la fase temprana (2 dpi) de la interacción compatible predomina la sobreexpresión de genes de pared celular y en la tardía (12 dpi) los relacionados con el ARN. En el análisis de la interacción incompatible, aunque también hay muchas diferencias entre ambas fases, hay que destacar la expresión diferencial común de los genes loxA y mcpi (sobrexpresados) y del gen loxD (reprimido) por su implicación en defensa en otras interacciones planta-patógeno. Cabe destacar que entre las interacciones compatible e incompatible hubo muy pocos genes en común. En la etapa temprana de la interacción compatible destacó la activación de genes de pared celular y la represión de la señalización; en cambio, en la interacción incompatible hubo proteínas principalmente implicadas en defensa. A los 12 días, en la interacción compatible los genes relacionados con el ARN y la pared celular se sobreexpresaban principalmente, y se reprimían los de proteínas y transporte, mientras que en la incompatible se sobreexpresaron los relacionados con el estrés, el metabolismo secundario y el de hormonas y se reprimieron los de ARN, señalización, metabolismo de hormonas y proteínas. Por otra parte, la técnica de silenciamiento génico VIGS reveló que el gen TGA 1a está implicado en la resistencia mediada por el gen MiG1a M. javanica. Así mismo se evaluó el transcriptoma de todo el sistema radical de la variedad susceptible tras la aplicación del inductor BTH, y se comparó con el transcriptoma de la resistente. Los resultados obtenidos revelan que el tratamiento con BTH en hojas de Moneymaker ejerce notables cambios transcripcionales en la raíz; entre otros, la activación de factores de transcripción Myb (THM16 y THM 27) y del gen ACC oxidasa. Las respuestas inducidas por el BTH parecen ser de corta duración ya que no hubo transcritos diferenciales comunes a las dos fases temporales de la infección comparadas (2 y 12 dpi). El transcriptoma de Moneymaker tratada con BTH resultó ser muy diferente al de la variedad resistente Motelle, ambas sin infectar, destacando la mayor expresión en el primero del gen LeEXP2, una expansina relacionada con defensa frente a nematodos. Las respuestas inducidas por los nematodos en Moneymaker-BTH también fueron muy distintas a las observadas previamente en la interacción incompatible mediada por MiG1, pues sólo se detectaron 2 genes sobreexpresados comunes a ambos eventos. Finalmente, se abordó el estudio de la expresión diferencial de genes que codifican PRXs y su relación con la resistencia en la interacción tomate/M. javanica. Para ello, se realizó en primer lugar el estudio del análisis del transcriptoma de tomate de la interacción compatible, obtenido en un estudio previo a partir de tejido radical infectado en distintos tiempos de infección. Se han identificado 16 unigenes de PRXs con expresión diferencial de los cuales 15 se relacionan por primera vez con la respuesta a la infección de nematodos. La mayoría de los genes de PRXs identificados, 11, aparecen fuertemente reprimidos en el sitio de alimentación, en las células gigantes (CG). Dada la implicación directa de las PRXs en la activación del mecanismo de producción de ROS, la supresión de la expresión génica local de genes de PRXs en el sitio de establecimiento y alimentación pone de manifiesto la capacidad del nematodo para modular y superar la respuesta de defensa de la planta de tomate en la interacción compatible. Posteriormente, de estos genes identificados se han elegido 4: SGN-U143455, SGN-U143841 y SGN-U144042 reprimidos en el sitio de infección y SGN-U144671 inducido, cuyos cambios de expresión se han determinado mediante análisis por qRT-PCR y de hibridación in situ en dos tiempos de infección (2 dpi y 4 dpi) y en distintos tejidos radicales de tomate resistente y susceptible. Los patrones de expresión obtenidos demuestran que en la interacción incompatible la transcripción global de los 4 genes estudiados se dispara en la etapa más temprana en el sitio de infección, detectándose la localización in situ de transcritos en el citoplasma de las células corticales de la zona meristemática afectadas por el nematodo. A 4 dpi se observó que los niveles de expresión en el sitio de infección cambian de tendencia y los genes SGN-U144671 y SGN-U144042 se reprimen significativamente. Los diferentes perfiles de expresión de los genes PRXs en los dos tiempos de infección sugieren que su inducción en las primeras 48 horas es crucial para la respuesta de defensa relacionada con la resistencia frente a la invasión del nematodo. Por último, al analizar el tejido radical sistémico, se detectó una inducción significativa de la expresión en la fase más tardía de la infección del gen SGN-U144042 en el genotipo susceptible y del SGN-U143841 en ambos genotipos. En este estudio se describe por primera vez la inducción de la expresión sistémica de genes de PRXs en tomate durante la interacción compatible e incompatible con M. javanica lo que sugiere su posible implicación funcional en la respuesta de defensa SAR activada por la infección previa del nematodo. ABSTRACT Plants defend themselves from pathogens by constitutive and/or induced defenses. A common type of induced defense involves plant resistance genes (R), which are normally activated in response to attack by specific pathogen species. Typically, a specific plant R protein recognizes a specific pathogen avirulence (avr) compound. This initiates a complex biochemical cascade inside the plant that results in synthesis of antipathogen compounds. This response can involve chemical signaling, transcription, translation, enzymes and metabolism, and numerous plant hormones such as salicylic acid (SA), jasmonates (JA) and ethylene (ET). Induced plant defense can also activate Class III peroxidases (PRXs), which produce reactive oxygen species (ROS), regulate extracellular H2O2, and play additional roles in plant defense. R-gene activation and the resulting induced defense often remain localized in the specific tissues invaded by the plant pathogen. In other cases, the plant responds by signaling the entire plant to produce defense compounds (systemic induction). Plant defense can also be induced by the exogenous application of natural or synthetic elicitors, such as benzol-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothionic acid. There is much current scientific interest in R-genes and elicitors, because they might be manipulated to increase agricultural yield. Scientists also are interested in systemic induction, because this allows the entire plant to be defended. In this context, one of the aims of this investigation was the transcriptoma analysis of the root systems of two varieties of tomato, the resistant variety (Motelle) that carrier MiG1 and the susceptible (Moneymaker) without MiG1, before and after infection with M. javanica. The overexpression was more pronounced in the transcriptoma of the resistant variety compared with susceptible, before infection, including the MiG1 gene, PrG1 (or P4) genes, LEJA1 and ER24, indicating that hormone SA, JA and ET are active in the resistant variety. Moreover, GA hormone presents an opposite behavior. M. javanica infection causes significant transcriptional changes in both compatible (Moneymaker-M. javanica) and incompatible (Motelle-M. javanica) interaction. In the incompatible transcriptome root system, was notably reduced the expression of the MiG1 gene, and a continuity in the expression of the hormonal pathways of SA and JA. In other hand, transcriptional profile changes during compatible interaction were associated with nematode infection. The large differences between the two times point infection considered (2 dpi and 12 dpi) indicates an overexpression of cell wall related genes in the first phase, and conversely an overexpression of RNA genes in the late phase. Transcriptoma analysis of incompatible interaction, although there were differences between the two phases, should be highlighted the common differential gene expression: loxA and mcpi (overexpressed) and loxD gene (suppressed), as they are involved in defenses in other plant-pathogen interactions. The VIGS tool has provided evidence that TGA 1a is involved in MiG1 mediated resistance to M. javanica. Likewise, the systemic application of BTH was assessed and compared with susceptible and resistant variety. Root system transcriptoma of BTH treatment on leaves showed the activation of Myb transcription factors (THM16 and THM27), the ACC oxidase gene. and the LeEXP2 gene, encoding for an expansin enzyme, related with defense against nematodes. The activation appears to be reduced by subsequent infection and establishment of nematodes. To assist in elucidate the role of tomato PRXs in plant defence against M. javanica, the transcriptome obtained previously from isolated giant cells (GC) and galls at 3 and 7 dpi from the compatible interaction was analysed. A total of 18 different probes corresponding to 16 PRX encoding genes were differentially expressed in infection site compared to the control uninfected root tissues. Most part of them (11) was down-regulated. These results yielded a first insight on 15 of the PRX genes responding to tomato–Meloidogyne interaction and confirm that repression of PRX genes might be crucial for feeding site formation at the initial stages of infection. To study the involvement of PRX genes in resistance response, four genes have been selected: SGN-U143455, SGN-U143841 and SGN-U144042 consistently down-regulated and SGN-U144671 consistently up-regulated at infection site in compatible interaction. The expression changes were determined by qRT-PCR and in situ location at 2 dpi and 4 dpi, and in different root tissues of resistant and susceptible plants. Early upon infection (2 dpi), the transcripts levels of the four genes were strongly increased in infected tissue of resistant genotype. In situ hybridization showed transcript accumulation of them in meristem cortical cells, where the nematode made injury. The results obtained provide strong evidence that early induction of PRX genes is important for defence response of the resistance against nematode invasion. Moreover, the induction patterns of SGN-U144042 gene observed at 4 dpi in distal noninfected root tissue into the susceptible genotype and of SGN-U143841 gene in both genotypes suggest a potential involvement of PRX in the systemic defence response.

Derivación deductiva de programas funcionales con patrones

Una de las dificultades principales en el desarrollo de software es la ausencia de un marco conceptual adecuado para su estudio. Una propuesta la constituye el modelo transformativo, que entiende el desarrollo de software como un proceso iterativo de transformación de especificaciones: se parte de una especificación inicial que va transformándose sucesivamente hasta obtener una especificación final que se toma como programa. Este modelo básico puede llevarse a la práctica de varias maneras. En concreto, la aproximación deductiva toma una sentencia lógica como especificación inicial y su proceso transformador consiste en la demostración de la sentencia; como producto secundario de la demostración se deriva un programa que satisface la especificación inicial. La tesis desarrolla un método deductivo para la derivación de programas funcionales con patrones, escritos en un lenguaje similar a Hope. El método utiliza una lógica multigénero, cuya relación con el lenguaje de programación es estudiada. También se identifican los esquemas de demostración necesarios para la derivación de funciones con patrones, basados en la demostración independiente de varias subsentencias. Cada subsentencia proporciona una subespecificación de una ecuación del futuro programa a derivar. Nuestro método deductivo está inspirado en uno previo de Zohar Manna y Richard Waldinger, conocido como el cuadro deductivo, que deriva programas en un lenguaje similar a Lisp. El nuevo método es una modificación del cuadro de estos autores, que incorpora géneros y permite demostrar una especificación mediante varios cuadros. Cada cuadro demuestra una subespecificación y por tanto deriva una ecuación del programa. Se prevén mecanismos para que los programas derivados puedan contener definiciones locales con patrones y variables anónimas y sinónimas y para que las funciones auxiliares derivadas no usen variables de las funciones principales. La tesis se completa con varios ejemplos de aplicación, un mecanismo que independentiza el método del lenguaje de programación y un prototipo de entorno interactivo de derivación deductiva. Categorías y descriptores de materia CR D.l.l [Técnicas de programación]: Programación funcional; D.2.10 [Ingeniería de software]: Diseño - métodos; F.3.1 [Lógica y significado de los programas]: Especificación, verificación y razonamiento sobre programas - lógica de programas; F.3.3 [Lógica y significado de los programas]: Estudios de construcciones de programas - construcciones funcionales; esquemas de programa y de recursion; 1.2.2 [Inteligencia artificial]: Programación automática - síntesis de programas; 1.2.3 [Inteligencia artificial]: Deducción y demostración de teoremas]: extracción de respuesta/razón; inducción matemática. Términos generales Programación funcional, síntesis de programas, demostración de teoremas. Otras palabras claves y expresiones Funciones con patrones, cuadro deductivo, especificación parcial, inducción estructural, teorema de descomposición.---ABSTRACT---One of the main difficulties in software development is the lack of an adequate conceptual framework of study. The transformational model is one such proposal that conceives software development as an iterative process of specifications transformation: an initial specification is developed and successively transformed until a final specification is obtained and taken as a program. This basic model can be implemented in several ways. The deductive approach takes a logical sentence as the initial specification and its proof constitutes the transformational process; as a byproduct of the proof, a program which satisfies the initial specification is derived. In the thesis, a deductive method for the derivation of Hope-like functional programs with patterns is developed. The method uses a many-sorted logic, whose relation to the programming language is studied. Also the proof schemes necessary for the derivation of functional programs with patterns, based on the independent proof of several subsentences, are identified. Each subsentence provides a subspecification of one equation of the future program to be derived. Our deductive method is inspired on a previous one by Zohar Manna and Richard Waldinger, known as the deductive tableau, which derives Lisp-like programs. The new method incorporates sorts in the tableau and allows to prove a sentence with several tableaux. Each tableau proves a subspecification and therefore derives an equation of the program. Mechanisms are included to allow the derived programs to contain local definitions with patterns and anonymous and synonymous variables; also, the derived auxiliary functions cannot reference parameters of their main functions. The thesis is completed with several application examples, i mechanism to make the method independent from the programming language and an interactive environment prototype for deductive derivation. CR categories and subject descriptors D.l.l [Programming techniques]: Functional programming; D.2.10 [Software engineering]: Design - methodologies; F.3.1 [Logics and meanings of programa]: Specifying and verifying and reasoning about programs - logics of programs; F.3.3 [Logics and meanings of programs]: Studies of program constructs - functional constructs; program and recursion schemes; 1.2.2 [Artificial intelligence]: Automatic programming - program synthesis; 1.2.3 [Artificial intelligence]: Deduction and theorem proving - answer/reason extraction; mathematical induction. General tenas Functional programming, program synthesis, theorem proving. Additional key words and phrases Functions with patterns, deductive tableau, structural induction, partial specification, descomposition theorem.

Development of somatic embryogenesis for cloning and conservation of mature holm oak trees (Quercus ilex L.)

La encina (Quercus ilex L.) es una de las especies forestales mediterráneas más importantes. Constituye gran parte del estrato arbóreo de dehesas o montados, produce bellota como alimento del ganado y establece simbiosis con hongos micorrizógenos de gran valor económico. La encina está considerada como una especie recalcitrante en términos de conservación de semillas y capacidad morfogénica, lo que dificulta los programas de conservación de recursos genéticos y la mejora de la especie. La propagación vegetativa es una potente herramienta de los programas de mejora, por lo que es preciso desarrollar protocolos de regeneración somática en encina. La embriogénesis somática está considerada como la modalidad más adecuada de regeneración basada en técnicas de cultivo de tejidos vegetales utilizada en biotecnología forestal. Este trabajo se centra en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática para la regeneración clonal de encinas adultas. La memoria de esta tesis se ha dividido en capítulos que se corresponden con diferentes aspectos del sistema embriogénico. La embriogénesis somática se indujo en tegumentos maternos de óvulos en desarrollo procedentes de bellotas inmaduras de encinas adultas. A pesar de las bajas frecuencias de inducción, las líneas embriogénicas generadas se amplificaron mediante embriogénesis secundaria observándose cierta pérdida de la capacidad de diferenciación con el tiempo. Tanto el genotipo como la formulación del medio de cultivo influyeron en la respuesta embriogénica, concluyendo que la formulación de macronutrientes de Schenk y Hildebrant del medio sin reguladores de crecimiento fue la combinación más efectiva en la inducción. Los resultados sugirieron la existencia de una ventana en el desarrollo del óvulo más sensible a la inducción. El genotipo in[luyó en la capacidad proliferativa de los cultivos y en la conversión de los embriones somáticos, que se incrementó suplementando el medio con ácido indol-3-butírico y 6-benciladenina. El cultivo en medio líquido de líneas embriogénicas en condiciones de inmersión transitoria incrementó el crecimiento, dependiendo del genotipo, con respecto al cultivo en medio semisólido. Sin embargo, no mejoró la capacidad de diferenciar embriones cotiledonares aislados. Se estableció un protocolo de inicio y mantenimiento de cultivos en suspensión para varias líneas embriogénicas mediante inoculación en alta densidad de agregados embrionarios procedentes del medio semisólido. Para evitar la pérdida de vigor y la capacidad morfogénica debida al cultivo prolongado se desarrolló un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas mediante vitrificación. Al determinar la influencia de los agentes crioprotectores antes y después de su inmersión en nitrógeno líquido se concluyó que las respuestas de capacidad de crecimiento y de diferenciación del material embriogénico son independientes, además de estar bajo influencia del genotipo y el tipo de material crioconservado. La combinación de sacarosa y PVS2 previa a la inmersión en nitrógeno líquido proporcionó la mayor tasa de recuperación. Cuando las líneas fueron crioconservadas 30 días la capacidad de diferenciación se perdió en todas ellas. El análisis de SSR detectó variación somaclonal en el material crioconservado a corto plazo. SSR y RAPD mostraron importantes diferencias genéticas entre los árboles donantes y el material embriogénico que dependieron del genotipo. El grado de detección dependió del marcador empleado. Ambos marcadores revelaron baja inestabilidad intraclonal. Los RAPD revelaron variación genética intra-individuo en las encinas donantes. Se discuten la variación genética pre-existente en encina, su aparición durante las primeras fases de la inducción de embriogénesis, y la presencia de tejidos provenientes de la fertilización en el explanto materno. Esto hace preciso definir la identidad genética del material donante y acometer ensayos de detección precoz de variación somaclonal. ABSTRACT Holm oak (Quercus ilex L.) is one of the most important Mediterranean forest species. It conforms the tree layer of dehesas or montados, it produces acorns to feed the livestock and it establishes symbiosis with profitable mycorrhizal fungi. Holm oak is considered as recalcitrant species in terms of seed conservation and morphogenic capacities, which complicates the development of genetic conservation and improvement programs. Vegetative propagation is one of the mightiest tools for breeding programs therefore; developing protocols for clonal regeneration of holm oak is essential. Somatic embryogenesis is considered the best tissue culture-based way of plant regeneration in forest biotechnology. The present study is focused on the study of certain aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of mature holm oak. This thesis manuscript is divided into several chapters that match with different aspects of the embryogenic system. Somatic embryogenesis induction was achieved on maternal teguments of developing ovules from immature acorns of adult holm oak trees. Despite the low induction frequencies, the generated embryogenic lines were amplified by secondary embryogenesis. A decline in the differentiation capacity over time was also observed. It was concluded that both genotype and culture media formulation influenced the embryogenic response, being the Schenk and Hildebrandt´s macronutrients formulation from culture medium and the lack of plant growth regulators the most effective combination for the induction of the embryogenic response. It has been suggested the existence of a developmental window in which ovules are prone to induction. Genotype influenced the proliferation capacity and the plant conversion of somatic embryos, which was also favoured by the presence of indol-3-butyric acid and 6-bencyladenine. The use of temporary immersion systems as proliferation in liquid culture of the embryogenic lines increased the growth depending on genotype, when compared to semisolid cultures. However, it did not improve the differentiation of single cotyledonary embryos. A protocol for the initiation and maintenance of embryogenic suspension cultures was established for several embryogenic lines with highly dense inoculi of embryogenic clusters from proliferating semisolid cultures. In order to avoid the loss of vigour and morphogenic ability of embryogenic lines due to prolonged cultures, a cryopreservation protocol for embryogenic lines of holm oak has been developed. During the determination of the influence of cryoprotective agents on the growth and differentiation capacities before and after liquid nitrogen immersion, it was concluded that both responses were independent from each other and also under the influence of genotype and the type of cryopreserved material. The combination of sucrose and PVS2 prior liquid nitrogen immersion provided higher recovery rates. When the same embryogenic lines were cryopreserved for 30 days, none was able to differentiate. The SSRs analysis of the short-term cryopreserved material detected somaclonal variation. Both SSR and RAPD markers showed high sensitivity to detect genetic differences between the donor trees and the generated embryogenic material. Nevertheless, the degree of instability detection depended on the marker. The SSR analysis indicated a relationship between genotype, the studied loci and the located polymorphisms. Also, both markers revealed low intraclonal genetic variation. The RAPD detected genetic variation within the donor trees. The presence of pre-existent genetic variation within mature trees, in addition to its occurrence during the early stages of the embryogenic induction, and the presence of tissues of fertilisation origin within the maternal explants are all discussed. Nonetheless, the determination of the genetic identity of donor material is required, in addition to early detection methods of somaclonal variation.

Development of somatic embryogenesis for cloning and conservation of mature holm oak trees (Quercus ilex L.)

La encina (Quercus ilex L.) es una de las especies forestales mediterráneas más importantes. Constituye gran parte del estrato arbóreo de dehesas o montados, produce bellota como alimento del ganado y establece simbiosis con hongos micorrizógenos de gran valor económico. La encina está considerada como una especie recalcitrante en términos de conservación de semillas y capacidad morfogénica, lo que dificulta los programas de conservación de recursos genéticos y la mejora de la especie. La propagación vegetativa es una potente herramienta de los programas de mejora, por lo que es preciso desarrollar protocolos de regeneración somática en encina. La embriogénesis somática está considerada como la modalidad más adecuada de regeneración basada en técnicas de cultivo de tejidos vegetales utilizada en biotecnología forestal. Este trabajo se centra en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática para la regeneración clonal de encinas adultas. La memoria de esta tesis se ha dividido en capítulos que se corresponden con diferentes aspectos del sistema embriogénico. La embriogénesis somática se indujo en tegumentos maternos de óvulos en desarrollo procedentes de bellotas inmaduras de encinas adultas. A pesar de las bajas frecuencias de inducción, las líneas embriogénicas generadas se amplificaron mediante embriogénesis secundaria observándose cierta pérdida de la capacidad de diferenciación con el tiempo. Tanto el genotipo como la formulación del medio de cultivo influyeron en la respuesta embriogénica, concluyendo que la formulación de macronutrientes de Schenk y Hildebrant del medio sin reguladores de crecimiento fue la combinación más efectiva en la inducción. Los resultados sugirieron la existencia de una ventana en el desarrollo del óvulo más sensible a la inducción. El genotipo in[luyó en la capacidad proliferativa de los cultivos y en la conversión de los embriones somáticos, que se incrementó suplementando el medio con ácido indol-3-butírico y 6-benciladenina. El cultivo en medio líquido de líneas embriogénicas en condiciones de inmersión transitoria incrementó el crecimiento, dependiendo del genotipo, con respecto al cultivo en medio semisólido. Sin embargo, no mejoró la capacidad de diferenciar embriones cotiledonares aislados. Se estableció un protocolo de inicio y mantenimiento de cultivos en suspensión para varias líneas embriogénicas mediante inoculación en alta densidad de agregados embrionarios procedentes del medio semisólido. Para evitar la pérdida de vigor y la capacidad morfogénica debida al cultivo prolongado se desarrolló un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas mediante vitrificación. Al determinar la influencia de los agentes crioprotectores antes y después de su inmersión en nitrógeno líquido se concluyó que las respuestas de capacidad de crecimiento y de diferenciación del material embriogénico son independientes, además de estar bajo influencia del genotipo y el tipo de material crioconservado. La combinación de sacarosa y PVS2 previa a la inmersión en nitrógeno líquido proporcionó la mayor tasa de recuperación. Cuando las líneas fueron crioconservadas 30 días la capacidad de diferenciación se perdió en todas ellas. El análisis de SSR detectó variación somaclonal en el material crioconservado a corto plazo. SSR y RAPD mostraron importantes diferencias genéticas entre los árboles donantes y el material embriogénico que dependieron del genotipo. El grado de detección dependió del marcador empleado. Ambos marcadores revelaron baja inestabilidad intraclonal. Los RAPD revelaron variación genética intra-individuo en las encinas donantes. Se discuten la variación genética pre-existente en encina, su aparición durante las primeras fases de la inducción de embriogénesis, y la presencia de tejidos provenientes de la fertilización en el explanto materno. Esto hace preciso definir la identidad genética del material donante y acometer ensayos de detección precoz de variación somaclonal. ABSTRACT Holm oak (Quercus ilex L.) is one of the most important Mediterranean forest species. It conforms the tree layer of dehesas or montados, it produces acorns to feed the livestock and it establishes symbiosis with profitable mycorrhizal fungi. Holm oak is considered as recalcitrant species in terms of seed conservation and morphogenic capacities, which complicates the development of genetic conservation and improvement programs. Vegetative propagation is one of the mightiest tools for breeding programs therefore; developing protocols for clonal regeneration of holm oak is essential. Somatic embryogenesis is considered the best tissue culture-based way of plant regeneration in forest biotechnology. The present study is focused on the study of certain aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of mature holm oak. This thesis manuscript is divided into several chapters that match with different aspects of the embryogenic system. Somatic embryogenesis induction was achieved on maternal teguments of developing ovules from immature acorns of adult holm oak trees. Despite the low induction frequencies, the generated embryogenic lines were amplified by secondary embryogenesis. A decline in the differentiation capacity over time was also observed. It was concluded that both genotype and culture media formulation influenced the embryogenic response, being the Schenk and Hildebrandt´s macronutrients formulation from culture medium and the lack of plant growth regulators the most effective combination for the induction of the embryogenic response. It has been suggested the existence of a developmental window in which ovules are prone to induction. Genotype influenced the proliferation capacity and the plant conversion of somatic embryos, which was also favoured by the presence of indol-3-butyric acid and 6-bencyladenine. The use of temporary immersion systems as proliferation in liquid culture of the embryogenic lines increased the growth depending on genotype, when compared to semisolid cultures. However, it did not improve the differentiation of single cotyledonary embryos. A protocol for the initiation and maintenance of embryogenic suspension cultures was established for several embryogenic lines with highly dense inoculi of embryogenic clusters from proliferating semisolid cultures. In order to avoid the loss of vigour and morphogenic ability of embryogenic lines due to prolonged cultures, a cryopreservation protocol for embryogenic lines of holm oak has been developed. During the determination of the influence of cryoprotective agents on the growth and differentiation capacities before and after liquid nitrogen immersion, it was concluded that both responses were independent from each other and also under the influence of genotype and the type of cryopreserved material. The combination of sucrose and PVS2 prior liquid nitrogen immersion provided higher recovery rates. When the same embryogenic lines were cryopreserved for 30 days, none was able to differentiate. The SSRs analysis of the short-term cryopreserved material detected somaclonal variation. Both SSR and RAPD markers showed high sensitivity to detect genetic differences between the donor trees and the generated embryogenic material. Nevertheless, the degree of instability detection depended on the marker. The SSR analysis indicated a relationship between genotype, the studied loci and the located polymorphisms. Also, both markers revealed low intraclonal genetic variation. The RAPD detected genetic variation within the donor trees. The presence of pre-existent genetic variation within mature trees, in addition to its occurrence during the early stages of the embryogenic induction, and the presence of tissues of fertilisation origin within the maternal explants are all discussed. Nonetheless, the determination of the genetic identity of donor material is required, in addition to early detection methods of somaclonal variation.

Plataforma de simulación en Matlab-Simulink de un accionamiento regulado para emular aerogeneradores

En este proyecto se desarrolla un modelo de simulación de un accionamiento controlado que emula el comportamiento de una turbina eólica, el cual se ha llevado a cabo a través del programa para simulación Matlab/Simulink. Su desarrollo se ha estructurado de la siguiente forma: Tras una breve introducción a la energía eólica y a las máquinas eléctricas objeto de estudio en este proyecto, se procede a la caracterización y representación de dichas maquinas dentro de la plataforma de simulación virtual Simulink. Posteriormente se explican posibles estrategias de control de la máquina de inducción, las cuales son aplicadas para la realización de un control de velocidad. Asimismo, se realiza un control vectorial de par de la máquina de inducción de modo que permita un seguimiento efectivo del par de referencia demandado por el usuario, ante distintas condiciones. Finalmente, se añade el modelo de turbina eólica de manera que, definiendo los valores de velocidad de viento, ángulo de paso y velocidad del eje, permite evaluar el par mecánico desarrollado por la turbina. Este modelo se valida comprobando su funcionamiento para diferentes puntos de operación ante diversas condiciones del par de carga. Las condiciones de carga se establecen acoplando al modelo de la turbina, un generador síncrono de imanes permanentes conectado a una carga resistiva. ! II! ABSTRACT In this project, the simulation model of a controlled drive that emulates the behaviour of a wind turbine is developed. It has been carried out through the platform for multidomian simulation called Matlab/Simulink. Its development has been structured as follows: After a brief introduction to the wind energy and the electrical machines studied in this project, these machines are characterized and represented into the virtual simulation platform, Simulink. Subsequently, the possible control strategies for the induction machine are explained and applied in order to carry out a speed control. Additionally, a torque vector control of the induction machine is performed, so as to enable an effective monitoring of the reference torque requested by the user, under different conditions. Finally, the wind turbine model is implemented so as to assess the turbine mechanical torque, after defining the wind speed, the pitch angle and the shaft speed values. This model is validated by testing its functionality for different operating points under various load torques. The load conditions are set up by attaching a permanent magnets synchronous machine, with a resistive load, to the turbine model.

Comportamiento del paciente de la clínica dental. Modelo basado en la percepción de la calidad del servicio y fidelización del paciente

Esta tesis doctoral propone un modelo de comportamiento del paciente de la clínica dental, basado en la percepción de la calidad del servicio (SERVQUAL), la fidelización del paciente, acciones de Marketing Relacional y aspectos socioeconómicos relevantes, de los pacientes de clínicas dentales. En particular, el estudio de campo se lleva a cabo en el ámbito geográfico de la Comunidad de Madrid, España, durante los años 2012 y 2013. La primera parte del proceso de elaboración del modelo está basada en la recolección de datos. Para ello, se realizaron cinco entrevistas a expertos dentistas y se aplicaron dos tipos encuestas diferentes: una para el universo formado por el conjunto de los pacientes de las clínicas dentales y la otra para el universo formado el conjunto de los dentistas de las clínicas dentales de la Comunidad de Madrid. Se obtuvo muestras de: 200 encuestas de pacientes y 220 encuestas de dentistas activos colegiados en el Ilustre Colegio Oficial de Odontólogos y Estomatólogos de la I Región Madrid. En la segunda parte de la elaboración del modelo, se realizó el análisis de los datos, la inducción y síntesis del modelo propuesto. Se utilizó la metodología de modelos gráficos probabilísticos, específicamente, una Red Bayesiana, donde se integraron variables (nodos) y sus dependencias estadísticas causales (arcos dirigidos), que representan el conocimiento obtenido de los datos recopilados en las encuestas y el conocimiento derivado de investigaciones precedentes en el área. Se obtuvo una Red Bayesiana compuesta por 6 nodos principales, de los cuales dos de ellos son nodos de observación directa: “Revisit Intention” y “SERVQUAL”, y los otros cuatro nodos restantes son submodelos (agrupaciones de variables), estos son respectivamente: “Attitudinal”, “Disease Information”, “Socioeconomical” y “Services”. Entre las conclusiones principales derivadas del uso del modelo, como herramientas de inferencia y los análisis de las entrevistas realizadas se obtiene que: (i) las variables del nodo “Attitudinal” (submodelo), son las más sensibles y significativas. Al realizarse imputaciones particulares en las variables que conforman el nodo “Attitudinal” (“RelationalMk”, “Satisfaction”, “Recommendation” y “Friendship”) se obtienen altas probabilidades a posteriori en la fidelidad del paciente de la clínica dental, medida por su intención de revisita. (ii) En el nodo “Disease Information” (submodelo) se destaca la relación de dependencia causal cuando se imputa la variable “Perception of disease” en “SERVQUAL”, demostrando que la percepción de la gravedad del paciente condiciona significativamente la percepción de la calidad del servicio del paciente. Como ejemplo destacado, si se realiza una imputación en la variable “Clinic_Type” se obtienen altas probabilidades a posteriori de las variables “SERVQUAL” y “Revisit Intention”, lo que evidencia, que el tipo de clínica dental influye significativamente en la percepción de la calidad del servicio y en la fidelidad del paciente (intención de revisita). (iii) En el nodo “Socioeconomical” (submodelo) la variable “Sex” resultó no ser significativa cuando se le imputaban diferentes valores, por el contrario, la variable “Age” e “Income” mostraban altas variabilidades en las probabilidades a posteriori cuando se imputaba alguna variable del submodelo “Services”, lo que evidencia, que estas variables condicionan la intención de contratar servicios (“Services”), sobretodo en las franjas de edad de 30 a 51 años en pacientes con ingresos entre 3000€ y 4000€. (iv) En el nodo “Services” (submodelo) los pacientes de las clínicas dentales mostraron altas probabilidades a priori para contratar servicios de fisiotrapia oral y gingival: “Dental Health Education” y “Parking”. (v) Las variables de fidelidad del paciente medidas desde su perspectiva comportamental que fueron utilizadas en el modelo: “Visit/year” “Time_clinic”, no aportaron información significativa. Tampoco, la variable de fidelidad del cliente (actitudinal): “Churn Efford”. (vi) De las entrevistas realizadas a expertos dentistas se obtiene que, los propietarios de la clínica tradicional tienen poca disposición a implementar nuevas estrategias comerciales, debido a la falta de formación en la gestión comercial y por falta de recursos y herramientas. Existe un rechazo generalizado hacia los nuevos modelos de negocios de clínicas dentales, especialmente en las franquicias y en lo que a políticas comerciales se refiere. Esto evidencia una carencia de gerencia empresarial en el sector. Como líneas futuras de investigación, se propone profundizar en algunas relaciones de dependencia (causales) como SERVQUALServices; SatisfactionServices; RelationalMKServices, Perception of diseaseSatisfaction, entre otras. Así como, otras variables de medición de la fidelidad comportamental que contribuyan a la mejora del modelo, como por ej. Gasto del paciente y rentabilidad de la visita. ABSTRACT This doctoral dissertation proposes a model of the behavior of the dental-clinic customer, based on the service-quality perception (SERVQUAL), loyalty, Relational Marketing and some relevant socio-economical characteristics, of the dental-clinic customers. In particular, the field study has been developed in the geographical region of Madrid, Spain during the years 2012 and 2013. The first stage of the preparation of the model consist in the data gathering process. For this purpose, five interviews where realized to expert dentists and also two different types of surveys: one for the universe defined by the set of dental-clinic patients and the second for the universe defined by the set of the dentists of the dental clinics of the Madrid Community. A sample of 200 surveys where collected for patients and a sample of 220 surveys where collected from active dentists belonging to the Ilustre Colegio Oficial de Odontólogos y Estomatólogos de la I Región Madrid. In the second stage of the model preparation, the processes of data-analysis, induction and synthesis of the final model where performed. The Graphic Probabilistic Models methodology was used to elaborate the final model, specifically, a Bayesian Network, where the variables (nodes) and their statistical and causal dependencies where integrated and modeled, representing thus, the obtained knowledge from the data obtained by the surveys and the scientific knowledge derived from previous research in the field. A Bayesian Net consisting on six principal nodes was obtained, of which two of them are directly observable: “Revisit Intention” y “SERVQUAL”, and the remaining four are submodels (a grouping of variables). These are: “Attitudinal”, “Disease Information”, “Socioeconomical” and “Services”. The main conclusions derived from the model, as an inference tool, and the analysis of the interviews are: (i) the variables inside the “Attitudinal” node are the most sensitive and significant. By making some particular imputations on the variables that conform the “Attitudinal” node (“RelationalMk”, “Satisfaction”, “Recommendation” y “Friendship”), high posterior probabilities (measured in revisit intention) are obtained for the loyalty of the dental-clinic patient. (ii) In the “Disease Information” node, the causal relation between the “Perception of disease” and “SERVQUAL” when “Perception of disease” is imputed is highlighted, showing that the perception of the severity of the patient’s disease conditions significantly the perception of service quality. As an example, by imputing some particular values to the “Clinic_Type” node high posterior probabilities are obtained for the “SERVQUAL” variables and for “Revisit Intention” showing that the clinic type influences significantly in the service quality perception and loyalty (revisit intention). (iii) In the “Socioeconomical” variable, the variable “Sex” showed to be non-significant, however, the “Age” variable and “Income” show high variability in its posterior probabilities when some variable from the “Services” node where imputed, showing thus, that these variables condition the intention to buy new services (“Services”), especially in the age range from 30 to 50 years in patients with incomes between 3000€ and 4000€. (iv) In the “Services” submodel the dental-clinic patients show high priors to buy services such as oral and gingival therapy, Dental Health Education and “Parking” service. (v) The obtained loyalty measures, from the behavioral perspective, “Visit/year” and “Time_clinic”, do not add significant information to the model. Neither the attitudinal loyalty component “Churn Efford”. (vi) From the interviews realized to the expert dentists it is observed that the owners of the traditional clinics have a low propensity to apply new commercial strategies due to a lack of resources and tools. In general, there exists an opposition to new business models in the sector, especially to the franchise dental model. All of this evidences a lack in business management in the sector. As future lines of research, a deep look into some statistical and causal relations is proposed, such as: SERVQUALServices; SatisfactionServices; RelationalMKServices, Perception of diseaseSatisfaction, as well as new measurement variables related to attitudinal loyalty that contribute to improve the model, for example, profit per patient and per visit.

El Parque Agrario: estructura de preservación de los espacios agrarios en entornos urbanos en un contexto de cambio global

La propuesta del análisis de la figura de Parque Agrario en el ámbito español surge ante la constatación de que un nuevo paradigma está aconteciendo a escala estatal. Diversos focos se encuentran trabajando en paralelo, y de forma participada, en pos de la reformulación de las políticas públicas relacionadas con la agricultura periurbana. Estos focos ven en la figura de Parque Agrario un instrumento territorial que permite mejorar la sostenibilidad y cohesión territorial a través de la defensa de la gobernanza alimentaria local, sin olvidar la necesidad de conservación de los recursos naturales y el patrimonio paisajístico, junto a la prestación de múltiples servicios de los ecosistemas de estos ámbitos a la ciudadanía. Complementariamente, se empieza a vislumbrar el papel que esta figura puede desempeñar como herramienta de desarrollo territorial de los sistemas agrarios periurbanos, clave ante los efectos de carácter local que la globalización ejerce en estos territorios. La figura de Parque Agrario es una estructura que actúa bloqueando la base territorial, favoreciendo el desarrollo de la actividad agraria. Su mayor potencial es el de convertir el factor “proximidad urbana” de una amenaza a una oportunidad de desarrollo local endógeno que permita la continuidad de la agricultura, de los agricultores y del espacio agrario. La peculiaridad del Parque Agrario es que no es una figura al uso, estructurada y reglada por una legislación, sino que se trata de una iniciativa ad hoc, específica para cada caso, orientada a cumplir determinados objetivos de dinamización agraria, protección urbanística y valorización territorial. A pesar de la existencia de diversas definiciones y aportaciones sobre diferentes aspectos de la figura, no existe un análisis complejo de la misma en todas sus dimensiones, ni una tentativa de descripción de un modelo global y unitario del caso español y de sus potenciales resultados. Tampoco se han analizado en profundidad sus “invariantes” que se muestran como los elementos estructurantes del proyecto, capaces desarrollarse de forma diversa, de alcanzar diferentes niveles de complejidad, y de materializarse en función a las posibilidades que permita el marco normativo y legal. Por tanto, se plantea como objetivo principal de la tesis la definición de un modelo conceptual de Parque Agrario español, capaz de ser articulado e institucionalizado mediante un proceso de gobernanza, y que, como condición sine qua non sea duradero en el tiempo. Para poder llegar a describir un modelo colectivo se realiza, en primer lugar, un análisis genealógico que permita analizar sistemáticamente las propuestas desarrolladas en el ámbito español y los casos para establecer la existencia de una continuidad en la idea de Parque Agrario en las propuestas desarrolladas durante los últimos 25 años—sus invariantes—, y analice todos aquellos elementos que han ido enriqueciendo la figura en cada experiencia —sus variantes. Este análisis, además, ofrece como aportaciones el árbol genealógico y los mapas de dispersión de la figura y el primer catálogo de propuestas de Parque Agrario materializadas en proyecto. El resultado de la inducción de los datos obtenidos en el análisis genealógico es el modelo conceptual de Parque Agrario, que se define como una estructura orgánica de planificación-gestión-gobierno del territorio capaz de adaptarse a las necesidades específicas de todo sistema agrario periurbano que requiera la articulación-institucionalización de esta figura en él. Una vez descrito el modelo, se contrasta su fiabilidad mediante su aplicación como metodología de caracterización y evaluación de dos estudios de casos: uno exitoso, el Parque Agrario del Baix Llobregat, y uno frustrado, la propuesta de Parque Agrario de la Vega de Granada. ------------------------------------------------------ ABSTRACT -------------------------------------------------------------------- The proposed analysis of the figure of Agrarian Park in the Spanish sphere arises from the awareness that a new paradigm is happening at the state level. Different focuses are working in parallel, under participated programs, after the reformulation of public policies related to urban agriculture. These areas understand the figure of Agrarian Park as a territorial instrument for improving sustainability and territorial cohesion through the defense of local food governance, considering the need for conservation of natural resources and landscape heritage together with the multiple ecosystem services provided by these areas to the public. Additionally, the role that this figure can play as a tool for territorial development of peri-urban agrarian systems, which are key to the local effects that globalization has on these territories, is staring to be envisioned. The figure of Agrarian Park is a structure that works by blocking the territorial base to encourage the development of agrarian activity. Its greatest potential is to convert the threat of "urban proximity" into an opportunity for an endogenous local development that allows the persistence of agriculture, farmers and the agrarian space. The uniqueness of the Agrarian Park is that it is not a standard figure, structured and regulated by legislation, but rather an ad hoc initiative, specific to each case, designed to meet certain objectives of agrarian revitalization, urban protection and territorial enhance. Despite the existence of several definitions and contributions on different aspects of the figure, there is a lack of a complex analysis of it in all its dimensions, missing any attempt to describe a global and unitary model of the Spanish case and its potential outcomes. Its "invariants” have neither been evaluated in depth, shown as the structural elements of the project able to be developed in different ways, to achieve numerous levels of complexity, and to be materialized according to the possibilities allowed by the regulatory and legal framework. Therefore, the definition of a conceptual model of Spanish Agrarian Park able to be articulated and institutionalized through a process of governance, and durable over time as a sine qua non requisite, it is proposed as the main aim of the thesis. To get to describe a collective model, a genealogical analysis that systematically analyzes the proposals and cases developed in the Spanish field is undertaken to verify the existence of a continuity of the idea of Agrarian Park on the proposals developed during the past 25 years -invariants-, and evaluate all the elements that have enriched this figure in each experience - variants. This analysis also provides as inputs a family tree, maps of dispersion of the figure and the first catalog of Agrarian Park proposals materialized into projects. The result of inducting the data obtained in the genealogical analysis is the Conceptual Model of Agrarian Park, defined as an organic planning-management-government structure of the territory able to adapt to the specific needs of all peri-urban agrarian systems that require the articulation-institutionalization of this figure in it. Having described the model, its reliability is tested by applying it as a methodology for characterization and evaluation of two case studies, one successful, the Baix Llobregat Agrarian Park, and one frustrated, the proposed Agrarian Park de la Vega of Granada.

Design, Technology and Characterization of Micromechanised Sensors and Actuators for Harsh Environments

Los sistemas micro electro mecánicos (MEMS) han demostrado ser una exitosa familia de dispositivos que pueden usarse como plataforma para el desarrollo de dispositivos con aplicaciones en óptica, comunicaciones, procesado de señal y sensorización. Los dispositivos MEMS estándar suelen estar fabricados usando tecnología de silicio. Sin embargo, el rendimiento de estos MEMS se puede mejorar si se usan otros materiales. Por ejemplo, el diamante nanocristalino (NCD) ofrece unas excelentes propiedades mecánicas, transparencia y una superficie fácil de funcionalizar. Por otro lado, el sistema de materiales (In; Ga; Al)N, los materiales IIIN, se pueden usar para producir estructuras monocristalinas con alta sensibilidad mecánica y química. Además, el AlN se puede depositar por pulverización catódica reactiva sobre varios substratos, incluyendo NCD, para formar capas policristalinas orientadas con alta respuesta piezoeléctrica. Adicionalmente, tanto el NCD como los materiales III-N muestran una gran estabilidad térmica y química, lo que los hace una elección idónea para desarrollar dispositivos para aplicaciones para alta temperatura, ambientes agresivos e incluso para aplicaciones biocompatibles. En esta tesis se han usado estos materiales para el diseño y medición de demostradores tecnológicos. Se han perseguido tres objetivos principales: _ Desarrollo de unos procesos de fabricación apropiados. _ Medición de las propiedades mecánicas de los materiales y de los factores que limitan el rendimiento de los dispositivos. _ Usar los datos medidos para desarrollar dispositivos demostradores complejos. En la primera parte de esta tesis se han estudiado varias técnicas de fabricación. La estabilidad de estos materiales impide el ataque y dificulta la producción de estructuras suspendidas. Los primeros capítulos de esta disertación se dedican al desarrollo de unos procesos de transferencia de patrones por ataque seco y a la optimización del ataque húmedo sacrificial de varios substratos propuestos. Los resultados de los procedimientos de ataque se presentan y se describe la optimización de las técnicas para la fabricación de estructuras suspendidas de NCD y materiales III-N. En un capítulo posterior se estudia el crecimiento de AlN por pulverización catódica. Como se ha calculado en esta disertación para obtener una actuación eficiente de MEMS, las capas de AlN han de ser finas, típicamente d < 200 nm, lo que supone serias dificultades para la obtención de capas orientadas con respuesta piezoeléctrica. Las condiciones de depósito se han mapeado para identificar las fronteras que proporcionan el crecimiento de material orientado desde los primeros pasos del proceso. Además, durante la optimización de los procesos de ataque se estudió un procedimiento para fabricar películas de GaN nanoporoso. Estas capas porosas pueden servir como capas sacrificiales para la fabricación de estructuras suspendidas de GaN con baja tensión residual o como capas para mejorar la funcionalización superficial de sensores químicos o biológicos. El proceso de inducción de poros se discutirá y también se presentarán experimentos de ataque y funcionalización. En segundo lugar, se han determinado las propiedades mecánicas del NCD y de los materiales III-N. Se han fabricado varias estructuras suspendidas para la medición del módulo de Young y de la tensión residual. Además, las estructuras de NCD se midieron en resonancia para calcular el rendimiento de los dispositivos en términos de frecuencia y factor de calidad. Se identificaron los factores intrínsecos y extrínsecos que limitan ambas figuras de mérito y se han desarrollado modelos para considerar estas imperfecciones en las etapas de diseño de los dispositivos. Por otra parte, los materiales III-N normalmente presentan grandes gradientes de deformación residual que causan la deformación de las estructuras al ser liberadas. Se han medido y modelado estos efectos para los tres materiales binarios del sistema para proporcionar puntos de interpolación que permitan predecir las características de las aleaciones del sistema III-N. Por último, los datos recabados se han usado para desarrollar modelos analíticos y numéricos para el diseño de varios dispositivos. Se han estudiado las propiedades de transducción y se proporcionan topologías optimizadas. En el último capítulo de esta disertación se presentan diseños optimizados de los siguientes dispositivos: _ Traviesas y voladizos de AlN=NCD con actuación piezoeléctrica aplicados a nanoconmutadores de RF para señales de alta potencia. _ Membranas circulares de AlN=NCD con actuación piezoeléctrica aplicadas a lentes sintonizables. _ Filtros ópticos Fabry-Pérot basados en cavidades aéreas y membranas de GaN actuadas electrostáticamente. En resumen, se han desarrollado unos nuevos procedimientos optimizados para la fabricación de estructuras de NCD y materiales III-N. Estas técnicas se han usado para producir estructuras que llevaron a la determinación de las principales propiedades mecánicas y de los parámetros de los dispositivos necesarios para el diseño de MEMS. Finalmente, los datos obtenidos se han usado para el diseño optimizado de varios dispositivos demostradores. ABSTRACT Micro Electro Mechanical Systems (MEMS) have proven to be a successful family of devices that can be used as a platform for the development of devices with applications in optics, communications, signal processing and sensorics. Standard MEMS devices are usually fabricated using silicon based materials. However, the performance of these MEMS can be improved if other material systems are used. For instance, nanocrystalline diamond (NCD) offers excellent mechanical properties, optical transparency and ease of surface functionalization. On the other hand, the (In; Ga; Al)N material system, the III-N materials, can be used to produce single crystal structures with high mechanical and chemical sensitivity. Also, AlN can be deposited by reactive sputtering on various substrates, including NCD, to form oriented polycrystalline layers with high piezoelectric response. In addition, both NCD and III-N materials exhibit high thermal and chemical stability, which makes these material the perfect choice for the development of devices for high temperatures, harsh environments and even biocompatible applications. In this thesis these materials have been used for the design and measurement of technological demonstrators. Three main objectives have been pursued: _ Development of suitable fabrication processes. _ Measurement of the material mechanical properties and device performance limiting factors. _ Use the gathered data to design complex demonstrator devices. In a first part of the thesis several fabrication processes have been addressed. The stability of these materials hinders the etching of the layers and hampers the production of free standing structures. The first chapters of this dissertation are devoted to the development of a dry patterning etching process and to sacrificial etching optimization of several proposed substrates. The results of the etching processes are presented and the optimization of the technique for the manufacturing of NCD and III-N free standing structures is described. In a later chapter, sputtering growth of thin AlN layers is studied. As calculated in this dissertation, for efficient MEMS piezoelectric actuation the AlN layers have to be very thin, typically d < 200 nm, which poses serious difficulties to the production of c-axis oriented material with piezoelectric response. The deposition conditions have been mapped in order to identify the boundaries that give rise to the growth of c-axis oriented material from the first deposition stages. Additionally, during the etching optimization a procedure for fabricating nanoporous GaN layers was also studied. Such porous layers can serve as a sacrificial layer for the release of low stressed GaN devices or as a functionalization enhancement layer for chemical and biological sensors. The pore induction process will be discussed and etching and functionalization trials are presented. Secondly, the mechanical properties of NCD and III-N materials have been determined. Several free standing structures were fabricated for the measurement of the material Young’s modulus and residual stress. In addition, NCD structures were measured under resonance in order to calculate the device performance in terms of frequency and quality factor. Intrinsic and extrinsic limiting factors for both figures were identified and models have been developed in order to take into account these imperfections in the device design stages. On the other hand, III-N materials usually present large strain gradients that lead to device deformation after release. These effects have been measured and modeled for the three binary materials of the system in order to provide the interpolation points for predicting the behavior of the III-N alloys. Finally, the gathered data has been used for developing analytic and numeric models for the design of various devices. The transduction properties are studied and optimized topologies are provided. Optimized design of the following devices is presented at the last chapter of this dissertation: _ AlN=NCD piezoelectrically actuated beams applied to RF nanoswitches for large power signals. _ AlN=NCD piezoelectrically actuated circular membranes applied to tunable lenses. _ GaN based air gap tunable optical Fabry-Pérot filters with electrostatic actuation. On the whole, new optimized fabrication processes has been developed for the fabrication of NCD and III-N MEMS structures. These processing techniques was used to produce structures that led to the determination of the main mechanical properties and device parameters needed for MEMS design. Lastly, the gathered data was used for the design of various optimized demonstrator devices.

Nuevos mecanismos moleculares de tolerancia a sequía y otros tipos de estrés abiótico en especies arbóreas de interés económico

Las masas forestales tienen una importancia colosal para nuestra sociedad y el conjunto de la biosfera. Estudios recientes a escala mundial indican que la sequía es el factor abiótico que más afecta a su crecimiento y supervivencia, seguida por las temperaturas extremas y la salinidad. Aunque comprender los mecanismos con que las especies arbóreas toleran estas formas de estrés tiene un interés aplicado evidente, dichos mecanismos se han estudiado mucho más en especies herbáceas modelo o de interés agronómico. Existen sin embargo diferencias notables entre ellas, como se demuestra en esta tesis y en otros trabajos recientes. Nuestro estudio se centra concretamente en la respuesta molecular del chopo –el sistema modelo forestal más desarrollado– al estrés abiótico, con particular énfasis en la sequía. Utilizando una estrategia proteómica y tratamientos controlados, hemos identificado componentes mayoritarios de dicha respuesta. Su participación en la misma se ha validado mediante análisis transcripcionales detallados utilizando tecnología qRT-PCR (PCR cuantitativa en tiempo real). Hemos identificado proteínas cuyo nexo funcional con mecanismos de tolerancia ya era conocido, como chaperonas moleculares sHSP o enzimas que atenúan el estrés oxidativo, pero también proteínas cuya relación funcional con el estrés es menos clara o incluso novedosa, como polifenol oxidasas (PPO), deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (SDR), o bicupinas (BIC), entre otras. El cuerpo central de la tesis consiste en la caracterización detallada de una PPO inusual, cuya inducción por estrés hídrico se describe por vez primera. Estas enzimas están ampliamente distribuidas en plantas, si bien su número es muy variable de unas especies a otras. Algunas, como nogal, tienen un único gen, mientras que Arabidopsis no tiene ninguno. En la última versión del genoma de chopo hemos identificado un total de 12 miembros bona fide, corrigiendo trabajos previos, y hemos caracterizado su expresión individual ante diferentes situaciones de estrés controlado y tratamientos hormonales. La isoforma antedicha es el único miembro de la familia que responde claramente a la deshidratación. También responde a salinidad y a la mayor parte de tratamientos hormonales ensayados, pero no a daño mecánico o tratamientos con metil jasmonato. Esto la diferencia de enzimas homólogas presentes en otras especies de plantas, que se han relacionado experimentalmente con estrés biótico. Los patrones de acumulación de transcritos en árboles adultos son compatibles con un papel protector frente a la sequía. La integración de nuestros estudios funcionales y filogenéticos sugiere que la familia ha sufrido un proceso reciente de diversificación y neofuncionalización, siendo la protección frente a deshidratación su papel primigenio. Aunque se conoce la actividad bioquímica in vitro de este tipo de enzimas, sus sustratos naturales son esencialmente una incógnita. Mediante expresión heteróloga en Escherichia coli BL21(DE3) hemos detectado que la enzima de chopo es capaz de oxidar L-DOPA a dopaquinona, siendo menos activa frente a otros sustratos. Por otra parte, hemos demostrado su localización cloroplástica mediante transformación transitoria de protoplastos con fusiones a la proteína fluorescente YFP. Mediante la obtención de plantas transgénicas de A. thaliana hemos demostrado que la enzima de chopo aumenta considerablemente la tolerancia in vivo frente a la deshidratación y al estrés salino. El análisis fenotípico detallado de las líneas transgénicas, combinando múltiples metodologías, nos ha permitido sustanciar que la tolerancia tiene una base compleja. Esta incluye una mayor protección del sistema fotosintético, una capacidad antioxidante muy incrementada y la acumulación de solutos osmoprotectores como la prolina. Los análisis metabolómicos nos han permitido asociar la expresión de la proteína a la síntesis de un flavano no descrito previamente en A. thaliana, vinculando la enzima de chopo con la síntesis de fenilpropanoides. También hemos observado alteraciones en los niveles hormonales que podrían subyacer a efectos pleiotrópicos con interés aplicado, como un aumento consistente del tamaño de la planta o el acortamiento del ciclo de crecimiento. Además de aportar datos novedosos sobre la funcionalidad in vivo de esta familia de oxidasas, los resultados de esta tesis demuestran que los árboles son sistemas de estudio interesantes para caracterizar nuevas estrategias de tolerancia al estrés abiótico con potencial aplicado. ABSTRACT Forests masses have an extraordinary importance for our society and the biosphere. Recent worldwide studies indicate that drought is the abiotic factor that affects more their growing and survival, followed by extreme temperatures and salinity. The understanding of how the arboreal species tolerate the stress has an evident practical interest, but their mechanisms have been studied much more in herbaceous species or with agronomic interest. However, considerable differences exist between them, as this thesis and recent studies show. Our study is focused on the molecular response of the poplar –the more developed forestry model system- to abiotic stress, specifically focused in the drought. Using a proteomic strategy and controlled treatments, we have identified main components in such response. Its participation has been validated through transcriptional analysis using qRT-PCR technology. We have identified proteins whose functional connection with tolerance mechanisms were already known, as molecular chaperones sHSP or enzymes that attenuate the oxidative stress, but also some proteins whose functional relationship with the stress is less clear or even novel, as polifenol oxidases (PPO), short chain deshidrogenases/reductases (SDR), or bicupines (BIC), among others. The central body of the thesis consists of the detailed characterization of an unsual PPO, whose induction due to drought stress is first described. These enzymes are thoroughly distributed in plants, but their number of members is very variable among species. Some of them, as the walnut tree, have a single gene, while Arabidopsis has none. We have identified a total of 12 members in the last version of the poplar genome, correcting previous works, and have characterized their individual expression against different situations of controlled stress and hormone treatments. The aforementioned isoform is the only member of the family that responds clearly to the drought. It also reacts to salinity and the majority of hormonal treatments tested, but it does not respond to mechanical damage or treatments with methyl jasmonate. This is the difference with homologue enzymes present in other plant species, which have been related experimentally with abiotic stress. The accumulation patterns of transcripts in adult trees are compatible with a protector role against drought. The integration of our functional and phylogenetic studies suggests that the family has suffered a recent process of diversification and neofunctionalization, being the protection against drought their original role. Although the in vitro biochemistry activity of this kind of enzymes is already known, their natural substracts are essentially a mystery. By means of heterologous expression of Escherichia coli BL21(DE3) we have detected that the enzyme of poplar is able to oxidize L-DOPA to dopaquinone, being less active against other substrates. Additionally, we have proven its chloroplastic location with transitory transformation of protoplasts with YFP protein fusion. By means of getting transgenic plants of A. thaliana, we have demonstrated that the poplar enzyme increases notably the in vivo tolerance against the drought and salinity stresses. The phenotypic analysis of the transgenic lines, and the use of multiple methodologies, allowed us to test the complexity of the tolerance. This includes a major protection of the photosynthetic system, a very increased antioxidant capacity and the accumulation of osmoprotectant solutes as the proline. The metabolic analysis has allowed to associate the protein expression with the synthesis of a Flavan non described previously in A. thalaiana, linking the enzyme of poplar with the synthesis of phenylpropanoids. We have observed alterations in the hormonal levels that could underlie pleiotropic effects with applied interest, as a consistent increase of the size of the plant and the reduction of the growth cycle. The results of this thesis, in addition to provide novel data about the in vivo functionality of the oxidase family, demonstrate that the trees are interesting systems of study to characterize new strategies of tolerance against abiotic stress with applied potential.

Biotecnología forestal aplicada a la producción de madera de nogal

Los nogales son especies pertenecientes a la familia Juglandaceae, ampliamente distribuidos por las zonas templadas y subtropicales del planeta. Son apreciados desde la antigüedad por la calidad de sus frutos y su madera. Su grado de domesticación es relativamente bajo comparado con cultivos alimenticios, e incluso respecto a otras especies forestales. Aunque el mercado de la madera de nogal suele mover grandes cantidades de dinero, su producción está basada principalmente en explotaciones extensivas, creciendo bajo sistemas poco tecnificados. Algunos intentos se han realizado en los EUA y Europa para la obtención de variedades madereras de nogal, pero ya sea por sus prolongados ciclos biológicos, por la complejidad genética de los caracteres sobre los que habría que incidir, por la escasa experiencia acumulada en programas de mejoramiento o por las limitaciones de los protocolos comerciales de reproducción asexual disponibles, lo cierto es que no existen genotipos seleccionados y destinados para tal fin. Poseer la capacidad de reproducir asexualmente los genotipos selectos es el complemento necesario de los programas de mejoramiento genético. Igualmente constituye la base de cualquier sistema productivo intensivo. Los sistemas de propagación vegetativa tradicionales en la familia Juglandaceae, además de ser inefectivos para la producción de elevados volúmenes de plantas, implican una gran complejidad en su ejecución y sus resultados suelen ser impredecibles. La micropropagación se plantea como la mejor alternativa para superar las dificultades de estas técnicas. Sin embargo, los nogales son considerados como altamente recalcitrantes al cultivo de tejidos, lo que provoca que sólo muy pocos genotipos sean propagados de forma comercial. Varias fases de la micropropagación de los nogales son especialmente conflictivas, e inciden de manera individual, y en su conjunto, sobre el resultado final. El control de los contaminantes microbianos, junto con la emisión de sustancias fenólicas y el decaimiento de los cultivos dificultan el establecimiento in vitro de la gran mayoría de los genotipos. La re-emergencia de microorganismos durante la proliferación es una fuente de pérdidas importante que también puede conducir al fracaso de la micropropagación. Las bajas tasas de enraizamiento y la elevada mortalidad registrada durante la aclimatación, unidas a factores genéticos, terminan por limitar la utilización comercial de esta tecnología a unos pocos genotipos. Con el objetivo de desarrollar un protocolo de micropropagación pre-comercial para el nogal híbrido maderero, se incidió en la solución de los principales problemas que dificultan la definición de ésta como una tecnología funcional para la producción de clones de ortetos selectos, al menos, para aquellos genotipos que pudieron ser establecidos in vitro. Así, aquí se presenta una metodología para el establecimiento in vitro que reduce la complejidad de esta fase y mejora el porcentaje de éxito durante la introducción. Igualmente se profundizó en el saneamiento de material contaminado y en el desarrollo de una herramienta que sirva para abordar el control de la re-emergencia microbiana durante la proliferación. También se analizan los elementos claves de este protocolo que garantizan la obtención de microbrotes de calidad enraizables, potencialmente capaces de soportar el paso a condiciones ex vitro. La evaluación de aspectos como la sustitución del FeEDTA por el FeEDDHA como fuente hierro, la introducción del Floroglucinol en el medio de cultivo de proliferación y la determinación de una fuente de carbono adecuada para la formación de las raíces, junto con un manejo adecuado de la fase previa a la pre-inducción radical, fueron determinantes en la micropropagación de hasta 14 genotipos de nogal híbrido maderero. Adicionalmente, la realización de un análisis detallado del sistema radical permitió comprobar que la metodología propuesta favorece la producción de raíces que están conectadas vascularmente con el tallo, lo que unido a la presencia de estomas morfológicamente normales, permite reducir las pérdidas por estas causas y favorece el proceso de endurecimiento. Como complemento del programa de mejora y de clonación, se abordó el desarrollo de una herramienta que permitiera identificar y diferenciar las selecciones. Buscando combinar la simplicidad de la técnica con el máximo poder discriminativo posible, se eligió el uso de marcadores genéticos del tipo SSR. En una primera aproximación, se evaluó la conveniencia de emplear primers previamente publicados (Woeste et al. 2002) y utilizados en varias especies de la familia Juglandaceae (Dangl et al. 2005, Victory et al. 2006, Ross-Davis y Woeste 2008, entre otros autores). A pesar de que la mayoría de las parejas de cebadores evaluadas rindieron productos de amplificación interpretables, su capacidad de clasificación conjunta fue muy reducida y de uso muy limitado en una población afectada por un alto grado de parentesco. Por esta razón fue necesario desarrollar una batería de marcadores microsatélites diseñados específicamente para el nogal híbrido maderero. De las 700 regiones secuenciadas, finalmente 24 parejas demostraron ser funcionales y lo suficientemente polimórficas como para discriminar entre medios hermanos. Al ser utilizadas 10 de las nuevas parejas de primers, junto con 2 de la genoteca desarrollada por Woeste et al. (2002), en una población diferente fue posible genotipar con una PID del orden de 10-11, lo que abre la posibilidad de utilizar este set de marcadores de novo dentro de la familia Juglandaceae.

Conservación de plantas regeneradas in vitro y análisis de la variación somaclonal de Cinchona officinalis, Linneo

Cinchona officinalis (Rubiaceae), especie endémica del Valle de Loja, ubicado en la región sur del Ecuador, es un recurso forestal de importancia medicinal y ecológica, además la especie ha sido catalogada como planta nacional y es un ícono de la región sur por su aporte a la farmacopea mundial. Esta especie, entre los siglos XVII-XIX sufrió una gran presión en sus poblaciones debido a la extracción masiva de la corteza para la cura del paludismo. Aunque la actividad extractiva generó grandes ingresos a la Corona Española y a la región Sur del Ecuador, ésta fue poco o nada sustentable ecológicamente, provocando la desaparición de la especie en muchos sitios de la provincia, pues, en su momento, no se consideraron alternativas de recuperación de las poblaciones naturales. Actualmente la extracción y consumo de la corteza en la zona de origen es baja o nula, sin embargo esta zona enfrenta nuevas amenazas. La deforestación a causa de proyectos de desarrollo en infraestructuras, la práctica de actividades agrícolas y de ganadería, y los efectos del cambio climático han ocasionado, en estos últimos años, la fragmentación de los ecosistemas. La mayoría de los bosques del sur del Ecuador se han convertido en parches aislados (los bosques en los que se distribuye C. officinalis no son la excepción) siendo esta la principal causa para que la especie se encuentre en estado de amenaza. Los individuos de la especie tienen una alta capacidad de rebrote y producen semillas durante todo el año; sin embargo la capacidad germinativa y la tasa de sobrevivencia son bajas, además de estas dificultades la especie requiere de la asociación con otras especies vegetales para su desarrollo, lo cual ha limitado su distribución en pequeños parches aislados. Con esta problemática, la recuperación natural de las poblaciones es una necesidad evidente. Varios trabajos y esfuerzos previos se han realizado a nivel local: i. Identificación de la distribución actual y potencial; ii. Determinación de la fenología y fructificación iii. Programas de educación ambiental, iv. Análisis moleculares para determinar la diversidad genética. v. Ensayos de propagación vegetativa; y otras acciones de tipo cultural. No obstante, el estado de conservación y manejo de las poblaciones naturales no ha mejorado significativamente, siendo necesaria la aplicación de estrategias integradas de conservación in situ y ex situ, que permitan la recuperación y permanencia de las poblaciones naturales a largo plazo. El presente trabajo tiene como fin dar alternativas para el cultivo de tejidos in vitro de Cinchona officinalis centrados en la propagación masiva a partir de semillas, análisis de la fidelidad genética y alternativas de conservación de tejidos. Los objetivos específicos que se plantean son: i. Analizar el proceso de germinación y proliferación in vitro. ii. Evaluar la estabilidad genética en explantes cultivados in vitro, mediante marcadores ISSR. iii. Establecer protocolos de conservación in vitro mediante limitación del crecimiento y criopreservación de segmentos nodales y yemas. Los resultados más significativos de esta investigación fueron: i. El desarrollo de protocolos eficientes para mejorar los porcentajes de germinación y la proliferación de brotes en explantos cultivados in vitro. Para evaluar el efecto de los fenoles sobre la germinación, se determinó el contenido total de fenoles y el porcentaje de germinación en semillas de C. officinalis comparados con una especie de control, C. pubescens. Para inducir a proliferación, se utilizaron segmentos nodales de plántulas germinadas in vitro en medio Gamborg (1968) suplementado con diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas). Los resultados obtenidos sugieren que el contenido de compuestos fenólicos es alto en las semillas de C. officinalis en comparación con las semillas de C. pubescens. Estos fenoles pueden eliminarse con peróxido de hidrógeno o con lavados de agua para estimular la germinación. La formación de nuevos brotes y callos en la mayoría de las combinaciones de reguladores de crecimiento se observó en un período de 45 días. El mayor porcentaje de proliferación de brotes, formación de callos y presencia de brotes adventicios se obtuvo en medio Gamborg (B5) suplementado con 5.0 mg/l 6-bencil-aminopurina y 3.0 mg/l de ácido indol-3-butírico. ii. La evaluación de la fidelidad genética de los explantes obtenidos con distintas combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal y diversos subcultivos. Se realizó el seguimiento a los explantes obtenidos de la fase anterior, determinando el índice de multiplicación y analizando la fidelidad genética de los tejidos obtenidos por las dos vías regenerativas: brotación directa y regeneración de brotes a partir de callos. Este análisis se realizó por amplificación mediante PCR de las secuencias ubicadas entre microsatélites-ISSR (Inter simple sequence repeat). El medio Gamborg (B5) con 3.0 mg/l de AIB y 5.0 mg/l de BAP usado como medio de inducción en la primera etapa de cultivo generó el mayor índice de proliferación (11.5). Un total de 13 marcadores ISSR fueron analizados, 6 de éstos fueron polimórficos. El mayor porcentaje de variación somaclonal fue inducido en presencia de 1.0 mg/l 2,4-D combinado con 0.2 mg/l Kin con un 1.8% en el segundo sub-cultivo de regeneración, la cual incrementó a 3.6% en el tercer sub-cultivo. Todas las combinaciones con presencia de 2,4-D produjeron la formación de callos y presentaron variación genética. Por su parte la fidelidad genética se mantuvo en los sistemas de propagación directa a través de la formación de brotes a partir de meristemos preformados. iii. El establecimiento de protocolos de conservación in vitro y crioconservación de segmentos nodales y yemas. Para la conservación limitando el crecimiento, se cultivaron segmentos nodales en los medios MS y B5 en tres concentraciones de sus componentes (25, 50 y 100%); y en medio B5 más agentes osmóticos como el manitol, sorbitol y sacarosa en diferentes concentraciones (2, 4 y 8%); los cultivos se mantuvieron por 12 meses sin subcultivos. Para el establecimiento de protocolos para la crioconservación (paralización del metabolismo) se usaron yemas axilares y apicales a las cuales se les aplicaron los métodos de encapsulación-deshidratación y vitrificación. La efectividad de los protocolos usados se determinó en función de la sobrevivencia, reducción del crecimiento y regeneración. Los resultados obtenidos en este apartado reflejan que un crecimiento limitado puede mantener tejidos durante 12 meses de almacenamiento, usando medio B5 más manitol entre 2 y 8%. En los protocolos de crioconservación, se obtuvo el mayor porcentaje de recuperación tras la congelación en NL en el tratamiento control seguido por el método crioprotector de encapsulación-deshidratación. Este trabajo brinda alternativas para la propagación de C. officinalis bajo condiciones in vitro, partiendo de material vegetal con alta diversidad genética. El material propagado puede ser fuente de germoplasma para la recuperación y reforzamiento de las poblaciones naturales así como una alternativa de producción para las comunidades locales debido a la demanda actual de corteza de la zona de origen para la elaboración de agua tónica. ABSTRACT Cinchona officinalis (Rubiaceae) is endemic to the Loja Valley, located in the southern area of Ecuador. The importance of this plant as medical and ecological resource is so great that it has been designated as the national flower and is an icon of the southern region for its contribution to the world pharmacopoeia. Between XVII-XIX centuries its population suffered great reduction due to massive harvesting of the bark to cure malaria. Although extraction activity generated large revenues to the Spanish Crown and the southern region of Ecuador, this was not ecologically sustainable, causing the disappearance of the species in many areas of the province, because during that time alternatives to prevent extinction and recover natural populations were not taken in account. Currently the extraction and consumption of bark in the area of origin is almost absent, but this species faces new threats. Deforestation due to infrastructure development, the practice of farming and ranching, and the effects of climate change had led to the fragmentation of ecosystems during the recent years. Most of the forests of southern Ecuador have become isolated patches, including those where C. officinalis is diffused. The lack of suitable habitat is today the main threat for the species. The species has a high capacity for regeneration and produces seeds throughout the year, but the germination rate is low and the growth is slow. In addition, the species requires the association with other plant species to develop. All these factors had limited its distribution to small isolated patches. The natural recovery of populations is essential to face this problem. Several studies and previous efforts had been made at local level: i. Identification of current and potential distribution; ii. Phenology determination. iii. Environmental education programs, iv. Molecular analisis to determine the genetic diversity. v. Testing of vegetative propagation; and other actions of cultural nature. Despite these efforts, the state of conservation and management of natural populations has not improved significantly. Implementation of integrated in situ and ex situ conservation strategies for the recovery and permanence of long-term natural populations is still needed. This work aims to provide alternatives for in vitro culture of tissue of Cinchona officinalis focused on mass propagation from seeds, genetic fidelity analysis and tissue conservation alternatives. The specific aims are: i. Analyze the process of germination and proliferation in vitro. ii. To evaluate the genetic stability of the explants cultured in vitro by ISSR markers. iii. Establish protocols for in vitro conservation by limiting growth and cryopreservation of nodal segments and buds. The most significant results of this research were: i. The development of efficient protocols to improve germination rates and proliferation of buds in explants cultured in vitro. To study the effect of phenols on germination, the total phenolic content and percentage germination was measured in C. officinalis and in a control species, C. pubescens, for comparison. The content of phenolic compounds in C. officinalis seeds is higher than in C. pubescens. These phenols can be removed with hydrogen peroxide or water washes to stimulate germination. To analyze the regeneration, we used nodal explants from seedlings germinated in vitro on Gamborg medium (1968) supplemented with different combinations of growth regulators (auxins and cytokinins) to induce proliferation. The formation of new shoots and calluses was observed within a period of 45 days in most combinations of growth regulators. The highest percentage of shoot proliferation, callus formation and adventitious buds were obtained in B5 medium supplemented with 5.0 mg/l 6-benzyl-aminopurine and 3.0 mg/l indole-3-butyric acid. ii. Evaluating genetic fidelity explants obtained with various combinations of plant growth regulators and different subcultures. The genetic fidelity was analyzed in tissues obtained by the two regenerative pathways: direct sprouting and shoot regeneration from callus. This analysis was performed by PCR amplification of the sequences located between microsatellite-ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Among a total of 13 ISSR markers analyzed, 6 were polymorphic. The highest percentage of somaclonal variation was induced in the presence of 1.0 mg/l 2,4-D combined with 0.2 mg/l Kin with 1.8% in the second round of regeneration, and increased to 3.6% in the third round. The presence of 2,4-D induced genetic variation in all the combinations of growth regulators. Meanwhile genetic fidelity remained systems propagation through direct shoot formation from meristems preformed. iii. Establishing conservation protocols in vitro and cryoconservation of nodal segments and buds. For medium-term conservation (limited growth) nodal segments were cultured in MS and B5 media at three concentrations (25, 50 and 100%); we tested B5 medium with different concentrations of osmotic agents such as mannitol, sorbitol and sucrose (2, 4 and 8%); cultures were maintained for 12 months with regular subculturing. To establish protocols for cryoconservation (cessation of metabolism) different methods of encapsulation-dehydration and vitrification were applied to axillary and apical buds. The effectiveness of the used protocols is determined based on the survival, growth and regeneration success. The results show that these tissues can be maintained in storage for 12 months, using B5 medium plus mannitol between 2 and 8%. The cryoconservation protocol with highest percentage of recovery was obtained by contral treatment, followed by freezing in NL with encapsulation-dehydration method. This work provides alternatives for the propagation in vitro of C. officinalis, starting from plant material with high genetic diversity. The obtained material represents a source of germplasm to support the recovery and strengthening of natural populations as well as a creation of alternative sources for local communities due to the current demand of bark for the preparation of tonic water.