Attività catalitica ed espressione genica di enzimi antiossidanti nei mitili, Mytilus galloprovincialis esposti ai farmaci fluoxetina e propranololo ed alla loro miscela.

E’ stimato che circa 4.000 sostanze diverse vengano utilizzate nella medicina umana, fra cui soprattutto analgesici, antinfiammatori, contraccettivi, antibiotici, beta-bloccanti, regolatori lipidici, composti neuroattivi e molti altri. Inoltre un elevato numero di farmaci, spesso simili a quelli umani tra cui antibiotici e antinfiammatori, viene usato nella medicina veterinaria. L’uso può essere diverso nei diversi Paesi ma farmaci quali l’ibuprofene, la carbamazepina, o i beta-bloccanti vengono consumati in quantità di tonnellate per anno. Le analisi chimiche hanno riscontrato la presenza dei residui dei farmaci nelle acque reflue dai depuratori, nei fiumi e nei laghi in maniera ubiquitaria a concentrazioni nell’intervallo di 10-1000 ng/L. Come ci si aspetta, i farmaci sono molto concentrati nelle acque reflue degli ospedali, tuttavia la percentuale di farmaci provenienti dagli ospedali è stata valutata complessivamente non oltre il 20% del quantitativo totale. L’origine preponderante dei farmaci proviene dall’uso domiciliare, per cui gli impianti municipali di raccolta delle acqua di rifiuto sono la maggiore via di ingresso in ambiente. Una volta ingeriti e metabolizzati, i farmaci vengono escreti via urine o feci e introdotti nella rete fognaria fino alle sedi di trattamento delle acque. Altra sorgente è rappresentata dalle manifatture dei farmaci, dalle quali possono derivare scarichi illegali o accidentali. Una sorgente importante di farmaci, soprattutto di antibiotici, è rappresentata dagli allevamenti animali, sia in ambienti interni che al pascolo, e dall’acquacoltura. Nel primo caso in particolare vengono prodotti e raccolti una grande quantità di rifiuti, che di solito sono accumulati temporaneamente e poi dispersi sui suoli agricoli. I farmaci presenti nei suoli possono essere trasportati alle acque sotterranee, o dilavati a livello superficiale contribuendo ad aumentare il livello di farmaci nei corsi d’acqua oppure una volta sciolti nell’acqua interstiziale possono essere assunti dai vegetali. Gli impianti di depurazione attuali non sono pianificati per eliminare microinquinanti altamente polari come i farmaci, e in relazione alle differenti molecole la eliminazione può essere in percentuale diversa, spesso anche molto bassa. I test ecotossicologici di tipo acuto utilizzati per molto tempo per valutare la tossicità dei farmaci ambientali hanno riportato effetti soltanto a concentrazioni superiori a quelle ambientali; nei 2-3 anni più recenti tuttavia è stato messo in luce come, già a basse concentrazioni, alcuni farmaci modifichino le attività riproduttive o il metabolismo di pesci e molluschi. Da qui è nata l’esigenza di studiare quale sia la possibile interazione dei residui dei farmaci con la fauna acquatica a concentrazioni compatibili con quelle ambientali, e valutare il meccanismo d’azione sfruttando per quanto possibile le conoscenze disponibili per i farmaci messi in commercio. I farmaci infatti sono composti disegnati per avere effetti terapeutici attraverso specifici meccanismi d’azione. Negli organismi non bersaglio che risultano esposti ai residui dei farmaci in ambiente, queste sostanze potrebbero però indurre effetti simili a quelli specifici nel caso i bersagli molecolari siano stati conservati durante l’evoluzione. Inoltre, i farmaci manifestano effetti collaterali, in genere se usati a dosi elevate o per lungo tempo, e molto spesso si tratta di effetti ossidanti. E’ possibile che tali effetti siano indotti dai farmaci ambientali nei molluschi o nei pesci, magari a basse dosi se questi animali sono più sensibili dell’uomo. Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare nei mitili Mytilus galloprovincialis i potenziali effetti indotti dalla fluoxetina (farmaco antidepressivo), dal propranololo (farmaco β-bloccante), o dalla loro miscela con riferimento a quelli classificati come collaterali nell’uomo. In particolare, è stata studiata l’espressione di geni che codificano per gli enzimi antiossidanti catalasi (CAT), glutatione S transferasi (GST) e superossido dismutasi (SOD), mediatori della risposta allo stress ossidativo. I possibili effetti dei farmaci sono stati valutati dopo esposizione dei mitili Mytilus galloprovincialis per 7 giorni a fluoxetina (FX) e propranololo (PROP) ad un range di concentrazioni che comprendono quelle misurate in ambiente, e alla loro miscela alla concentrazione di 0,3 ng/l, scelta perché rappresentativa delle dosi inferiori dei due farmaci riscontrate in ambiente acquatico. I risultati hanno dimostrato che FX causa una generale diminuzione dell’espressione dei geni CAT, mentre per i geni codificanti per GST e SOD si osservano variazioni significative soltanto ad una concentrazione di FX, 300 e 3 ng/L rispettivamente. La riduzione dei livelli di espressione di CAT non sempre accompagnata dalla significativa variazione dei livelli di espressione di SOD e GST, può indicare che il sistema anti-ossidante non è in grado di adattarsi in modo efficiente all’alterazione indotta dall’esposizione a FX, portando ad un progressivo aumento dei livelli di stress. Per quanto riguarda gli effetti del PROP, i risultati ottenuti mostrano che nei mitili esposti a concentrazioni crescenti del farmaco i geni CAT e SOD risultano progressivamente sovra-espressi rispetto al controllo, anche se in maniera non significativa mentre i livelli di espressione di GST non sono significativamente alterati. I dati ottenuti esponendo i mitili alla miscela dei due farmaci, indicano che FX e PROP possono avere effetti interattivi sulla regolazione dei tre geni coinvolti nella risposta antiossidante. In presenza della miscela si osserva infatti una riduzione significativa dell’espressione del gene CAT, del gene GST mentre non ci sono effetti sul gene SOD. In conclusione, concentrazioni di PROP e FX nell’intervallo di quelle misurate in ambiente possono generare significativi effetti sui geni CAT, GST, e SOD. Come riscontrato nella precedente letteratura, l’attività o l’espressione degli enzimi antiossidanti risente molto dello stato fisiologico dei mitili e della stagionalità, quindi il ruolo degli enzimi antiossidanti come biomarker deve essere interpretato all’interno di batterie più ampie di risposte subletali degli organismi sentinella. Nel laboratorio questi dati sono stati ottenuti in precedenti lavoro di Tesi (Tosarelli, Tesi Magistrale in Biologia Marina, A.A. 2011; Inzolia, Tesi Magistrale in Biologia Marina, A.A. 2011). Le alterazioni ottenute a concentrazioni circa 1.000 volte inferiori rispetto a quelle efficaci nei test ecotossicologici acuti, dimostrano comunque che i farmaci possono avere effetti sugli organismi anche a concentrazioni molto basse come quelle ambientali. In particolare, poiché gli effetti ossidativi sono i più comuni effetti collaterali dei farmaci nell’Uomo che ne assuma elevate quantità o somministrazioni prolungate nel tempo, possiamo affermare che questi hanno luogo anche negli organismi non-target, a concentrazioni basse e dopo soli 7 giorni di esposizione. I dati della tesi non dimostrano che propranololo e fluoxetina hanno effetti deleteri sulle popolazioni o le comunità dei molluschi, ma debbono essere considerati come indicatori della vulnerabilità degli animali a questi composti.

Effects of pesticides on honey bees (Apis mellifera L.): study of a specific route of exposure and evaluation of biochemical-physiological changes in the assessment of the pesticides toxicity

In this study, some important aspects of the relationship between honey bees (Apis mellifera L.) and pesticides have been investigated. In the first part of the research, the effects of the exposure of honey bees to neonicotinoids and fipronil contaminated dusts were analyzed. In fact, considerable amounts of these pesticides, employed for maize seed dressing treatments, may be dispersed during the sowing operations, thus representing a way of intoxication for honey bees. In particular, a specific way of exposure to this pesticides formulation, the indirect contact, was taken into account. To this aim, we conducted different experimentations, in laboratory, in semi-field and in open field conditions in order to assess the effects on mortality, foraging behaviour, colony development and capacity of orientation. The real dispersal of contaminated dusts was previously assessed in specific filed trials. In the second part, the impact of various pesticides (chemical and biological) on honey bee biochemical-physiological changes, was evaluated. Different ways and durations of exposure to the tested products were also employed. Three experimentations were performed, combining Bt spores and deltamethrin, Bt spores and fipronil, difenoconazole and deltamethrin. Several important enzymes (GST, ALP, SOD, CAT, G6PDH, GAPDH) were selected in order to test the pesticides induced variations in their activity. In particular, these enzymes are involved in different pathways of detoxification, oxidative stress defence and energetic metabolism. The results showed a significant effect on mortality of neonicotinoids and fipronil contaminated dusts, both in laboratory and in semi-field trials. However, no effects were evidenced in honey bees orientation capacity. The analysis of different biochemical indicators highlighted some interesting physiological variations that can be linked to the pesticide exposure. We therefore stress the attention on the possibility of using such a methodology as a novel toxicity endpoint in environmental risk assessment.

Performance evaluation of improved output scheduling in 3lihon nodes

Le reti ottiche, grazie alla loro elevata capacità, hanno acquisito sempre maggiore importanza negli ultimi anni, sia per via del crescente volume di dati scambiati, legato soprattutto alla larga diffusione di Internet, sia per la necessità di comunicazioni in tempo reale. Dati i (relativamente) lunghi tempi di adattamento, questa tecnologia nativamente non è quella ottimale per il trasporto di un traffico a burst, tipico delle telecomunicazioni odierne. Le reti ibride cercano, quindi, di coniugare al meglio le potenzialità della commutazione ottica di circuito e della commutazione ottica a pacchetto. In questo lavoro, in particolare, ci si è concentrati su un'architettura di rete ibrida denominata 3LIHON (3-Level Integrated Hybrid Optical Network). Essa prevede tre distinti livelli di qualità di servizio (QoS) per soddisfare differenti necessità: - Guaranteed Service Type (GST): simile ad un servizio a commutazione di circuito, non ammette perdita di dati. - Statistically Multiplexed Real Time (SM/RT): simile ad un servizio a commutazione di pacchetto, garantisce ritardo nullo o molto basso all'interno della rete, permette un piccolo tasso di perdita di dati e ammette la contesa della banda. - Statistically Multiplexed Best Effort (SM/BE): simile ad un servizio a commutazione di pacchetto, non garantisce alcun ritardo tra i nodi ed ammette un basso tasso di perdita dei dati. In un nodo 3LIHON, il traffico SM/BE impossibile da servire, a causa ad es. dell'interruzione da parte di pacchetti aventi un livello di QoS più prioritario, viene irrimediabilmente perso. Questo implica anche lo spreco del tempo e delle risorse impiegati per trasmettere un pacchetto SM/BE fino alla sua interruzione. Nel presente lavoro si è cercato di limitare, per quanto possibile, questo comportamento sconveniente, adottando e comparando tre strategie, che hanno portato alla modifica del nodo 3LIHON standard ed alla nascita di tre sue varianti.

Effetto dei farmaci ambientali propranololo e carbamazepina sullo sviluppo larvale del mitilo, Mytilus galloprovincialis

La presenza dei farmaci in ambiente sta assumendo sempre più rilevanza come problematica da affrontare e a cui tentare di porre rimedio. Anche se le concentrazioni nei corpi idrici risultano piuttosto basse (μg/L o ng/L), i farmaci hanno proprietà diverse dagli inquinanti convenzionali e possono ugualmente indurre effetti dannosi nella fauna acquatica. In questo lavoro sono stati valutati gli effetti del propranololo (PROP, farmaco β-bloccante) e della carbamazepina (CBZ, farmaco anticonvulsivante), su di uno stadio larvale del mitilo Mytilus galloprovincialis (larva veliger – 48 ore post fecondazione). L’esposizione a concentrazioni crescenti dei due farmaci induce un progressivo aumento della anormalità delle larve, che mostrano malformazioni o ritardi nello sviluppo. Sia PROP che CBZ aumentano l’attività dei trasportatori implicati nella Multixenobiotic Resistance (MXR), indicando che il sistema di estrusione degli xenobiotici viene attivato già in questa fase dello sviluppo larvale. Analogamente, PROP aumenta l’espressione dei geni che codificano per le proteine della famiglia MXR, P-gp ed MRP. Aumenta anche l’espressione dei geni che codificano per catalasi e GST, suggerendo un aumento delle risposte antiossidanti/detossificanti. PROP aumenta i trascritti dell’anidrasi carbonica, mentre al contrario riduce i trascritti per la proteina extrapalliale: non è chiaro quindi l’effetto del farmaco sulla regolazione della espressione di proteine coinvolte nella formazione della conchiglia. CBZ aumenta l’espressione dei trascritti per P-gp ma diminuisce quella relativa ad MRP. Inoltre, riduce l’espressione dei geni codificanti per catalasi e GST, e della proteina extrapalliale, senza avere effetto sui trascritti dell’anidrasi carbonica. In generale possiamo dire che i due farmaci inducono evidenti alterazioni a livello biochimico e molecolare che possono influenzare sia la detossificazione che la biomineralizzazione, con conseguenze rilevanti per lo sviluppo larvale.

Studio di profili di espressione di geni coinvolti nello sviluppo larvale del Mitilo Mytilus galloprovincialis.

La presente ricerca si focalizza su alcuni processi chiave dello sviluppo larvale del mitili M. galloprovincialis: la biomineralizzazione, in quanto elemento fondamentale per la formazione della conchiglia; lo sviluppo ed il mantenimento della struttura cellulare, in quanto il progredire dello sviluppo comporta molteplici cambiamenti a tutti i livelli; la detossificazione, in quanto capace di fornire l’adeguata protezione. Lo studio ha visto l’impiego di tecniche molecolari (RT-qPCR) al fine di valutare l’espressione di geni codificanti per l’enzima anidrasi carbonica, la proteina extrapalliale, il recettore 5-HT1, la proteina actina, i trasportatori di membrana P-gp e Mrp, e gli enzimi catalasi e glutatione S-transferasi. È stata poi esaminata l’attività dell’enzima protein-chinasi A e si è caratterizzato il sistema MXR. Inoltre si è cercato di valutare il coinvolgimento di meccanismi cAMP/PKA-dipendenti nella regolazione dell’espressione di geni sopra menzionati. A tale scopo, sono stati utilizzati i composti farmaceutici propranololo e carbamazepina, che, da studi precedenti, sono noti interferire nella regolazione della via di trasduzione cAMP/PKA dipendente nel mitilo. I risultati di questa ricerca permettono di affermare che lo sviluppo larvale è un processo continuo in cui vi sono costanti cambiamenti fisiologici. L’espressione basale dei trascritti studiati ha mostrato evidenti variazioni nel tempo tra uova fertilizzate, trocofore e veliger, con un trend generale di sovraregolazione. E’ emerso anche che durante il suo sviluppo, il mitilo mediterraneo non presenta lo stesso tipo di regolazione della trascrizione riscontrabile nell’esemplare adulto. La modulazione dell’espressione da parte dei farmaci utilizzati ha comportato sovra- o sotto-espressione dei geni esaminati, indicando il possibile coinvolgimento di vie di regolazione della trascrizione affidate alla trasduzione del segnale neuroendocrino e del pathway cAMP/PKA dipendente

Characterization of the bovine IkappaB kinases (IKK)alpha and IKKbeta, the regulatory subunit NEMO and their substrate IkappaBalpha

The Nuclear factor (NF)-kappaB signalling pathway plays a critical role in the regulation and coordination of a wide range of cellular events such as cell growth, apoptosis and cell differentiation. Activation of the IKK (inhibitor of NF-kappaB kinase) complex is a crucial step and a point of convergence of all known NF-kappaB signalling pathways. To analyse bovine IKKalpha (IKK1), IKKbeta (IKK2) and IKKgamma (or NF-kappaB Essential MOdulator, NEMO) and their substrate IkappaBalpha (Inhibitor of NF-kappaB), the corresponding cDNAs of these molecules were isolated, sequenced and characterized. A comparison of the amino acid sequences with those of their orthologues in other species showed a very high degree of identity, suggesting that the IKK complex and its substrate IkappaBalpha are evolutionarily highly conserved components of the NF-kappaB pathway. Bovine IKKalpha and IKKbeta are related protein kinases showing 50% identity which is especially prominent in the kinase and leucine zipper domains. Co-immunoprecipitation assays and GST-pull-down experiments were carried out to determine the composition of bovine IKK complexes compared to that in human Jurkat T cells. Using these approaches, the presence of bovine IKK complexes harbouring IKKalpha, IKKbeta, NEMO and the interaction of IKK with its substrate IkappaBalpha could be demonstrated. Parallel experiments using human Jurkat T cells confirmed the high degree of conservation also at the level of protein-protein interactions. Finally, a yeast two-hybrid analysis showed that bovine NEMO molecules, in addition to the binding to IKKalpha and IKKbeta, also strongly interact with each other.

Nuclear receptor and target gene mRNA abundance in duodenum and colon of dogs with chronic enteropathies

Nuclear receptors (NR), such as constitutive androstane receptor (CAR), pregnane X receptor (PXR) and peroxisome proliferator-associated receptors alpha and gamma (PPARalpha, PPARgamma) are mediators of inflammation and may be involved in inflammatory bowel disease (IBD) and food responsive diarrhea (FRD) of dogs. The present study compared mRNA abundance of NR and NR target genes [multi drug-resistance gene-1 (MDR1), multiple drug-resistance-associated proteins (MRD2, MRD3), cytochrome P450 (CYP3A12), phenol-sulfating phenol sulfotransferase (SULT1A1) and glutathione-S-transferase (GST A3-3)] in biopsies obtained from duodenum and colon of dogs with IBD and FRD and healthy control dogs (CON; n=7 per group). Upon first presentation of dogs, mRNA levels of PPARalpha, PPARgamma, CAR, PXR and RXRalpha in duodenum as well as PPARgamma, CAR, PXR and RXRalpha in colon were not different among groups (P>0.10). Although mRNA abundance of PPARalpha in colon of dogs with FRD was similar in both IBD and CON (P>0.10), PPARalpha mRNA abundance was higher in IBD than CON (P<0.05). Levels of mRNA of MDR1 in duodenum were higher in FRD than IBD (P<0.05) or CON (P<0.001). Compared with CON, abundances of mRNA for MRP2, CYP3A12 and SULT1A1 were higher in both FRD and IBD than CON (P<0.05). Differences in mRNA levels of PPARalpha and MRP2 in colon and MDR1, MRP2, CYP3A12 and SULT1A1 in duodenum may be indicative for enteropathy in FRD and (or) IBD dogs relative to healthy dogs. More importantly, increased expression of MDR1 in FRD relative to IBD in duodenum may be a useful diagnostic marker to distinguish dogs with FRD from dogs with IBD.

Functional interaction of vascular endothelial-protein-tyrosine phosphatase with the angiopoietin receptor Tie-2

During development of the vertebrate vascular system essential signals are transduced via protein-tyrosine phosphorylation. Null-mutations of receptor-tyrosine kinase (RTK) genes expressed in endothelial cells (ECs) display early lethal vascular phenotypes. We aimed to identify endothelial protein-tyrosine phosphatases (PTPs), which should have similar importance in EC-biology. A murine receptor-type PTP was identified by a degenerated PCR cloning approach from endothelial cells (VE-PTP). By in situ hybridization this phosphatase was found to be specifically expressed in vascular ECs throughout mouse development. In experiments using GST-fusion proteins, as well as in transient transfections, trapping mutants of VE-PTP co-precipitated with the Angiopoietin receptor Tie-2, but not with the Vascular Endothelial Growth Factor receptor 2 (VEGFR-2/Flk-1). In addition, VE-PTP dephosphorylates Tie-2 but not VEGFR-2. We conclude that VE-PTP is a Tie-2 specific phosphatase expressed in ECs, and VE-PTP phosphatase activity serves to specifically modulate Angiopoietin/Tie-2 function. Based on its potential role as a regulator of blood vessel morphogenesis and maintainance, VE-PTP is a candidate gene for inherited vascular malformations similar to the Tie-2 gene.

Thiazolides inhibit growth and induce glutathione-S-transferase Pi (GSTP1)-dependent cell death in human colon cancer cells

Thiazolides are a novel class of broad-spectrum anti-infective drugs with promising in vitro and in vivo activities against intracellular and extracellular protozoan parasites. The nitrothiazole-analogue nitazoxanide (NTZ; 2-acetolyloxy-N-(5-nitro 2-thiazolyl) benzamide) represents the thiazolide parent compound, and a number of bromo- and carboxy-derivatives with differing activities have been synthesized. Here we report that NTZ and the bromo-thiazolide RM4819, but not the carboxy-thiazolide RM4825, inhibited proliferation of the colon cancer cell line Caco2 and nontransformed human foreskin fibroblasts (HFF) at or below concentrations the compounds normally exhibit anti-parasitic activity. Thiazolides induced typical signs of apoptosis, such as nuclear condensation, DNA fragmentation and phosphatidylserine exposure. Interestingly, the apoptosis-inducing effect of thiazolides appeared to be cell cycle-dependent and induction of cell cycle arrest substantially inhibited the cell death-inducing activity of these compounds. Using affinity chromatography and mass spectrometry glutathione-S-transferase P1 (GSTP1) from the GST class Pi was identified as a major thiazolide-binding protein. GSTP1 expression was more than 10 times higher in the thiazolide-sensitive Caco2 cells than in the less sensitive HFF cells. The enzymatic activity of recombinant GSTP1 was strongly inhibited by thiazolides. Silencing of GSTP1 using siRNA rendered cells insensitive to RM4819, while overexpression of GSTP1 increased sensitivity to RM4819-induced cell death. Thiazolides may thus represent an interesting novel class of future cancer therapeutics.

REMEDIATION OF TETRACYCLINE FROM WATER SOURCES USING VETIVER GRASS (Chrysopogon zizanioides L. Nash) AND TETRACYCLINE-TOLERANT ROOT-ASSOCIATED BACTERIA

Antibiotics are emerging contaminants worldwide. Due to insufficient policy regulations, public awareness, and the constant exposure of the environment to antibiotic sources has created a major environmental concern. Wastewater treatment plants (WWTP) are not equipped to filter-out these compounds before the discharge of the disinfected effluent into water sources (e.g., lakes and streams) and current available technologies are not equipped to remediate these compounds from environmental sources. Hence, the challenge remains to establish a biological system to remove these antibiotics from wastewater. An invitro hydroponic remediation system was developed using vetiver grass (Chrysopogon zizanioides L. Nash) to remediate tetracycline (TC) from water. Comparative metabolomics studies were conducted to investigate the metabolites/pathways associated with tetracycline metabolism in plants and TC-degrading bacteria. The results show that vetiver plants effectively uptake tetracycline from water sources. Vetiver root-associated bacteria recovered during the hydroponic remediation trial were highly tolerant to TC (as high as 600 ppm) and could use TC as a sole carbon and energy source. Growth conditions (pH, temperature, and oxygen requirement) for TC-tolerant bacteria were optimized for higher TC remediation capability from water sources. The plant (roots and shoots) and bacterial species were further characterized for the metabolites produced during the TC degradation process using GC-MS to identify the possible biochemical mechanism involved. Also, the plant root zone was screened for metabolites/enzymes that were secreted during antibiotic degradation and could potentially enhance the degradation process. The root zone was selected for this analysis because this region of the plant has shown a greater capacity for antibiotic degradation compared to the shoot zone. The role of antioxidant enzymes in TC degradation process revealed glutathione-S-transferase (GSTs) as an important group of enzymes in both plant and bacteria potentially involved in TC degradation process. Metabolomics results also suggest potential GST activity in the TC remediation/ transformation process used by plants. This information could be useful in gaining insights for the application of biological remediation systems for the mitigation of antibiotics from waste-water.

The platelet protein kinase C substrate pleckstrin binds directly to SDPR protein

Pleckstrin is a modular platelet protein consisting of N- and C-terminal pleckstrin homology (PH) domains, a central dishevelled egl10 and pleckstrin (DEP) domain and a phosphorylation region. Following agonist-induced platelet stimulation, dimeric pleckstrin translocates to the plasma membrane, is phosphorylated and then monomerizes. A recent study found that pleckstrin null platelets from a knockout mouse have a defect in granule secretion, actin polymerization and aggregation. However, the mechanism of pleckstrin signaling for this function is unknown. Our recent studies have led to the identification of a novel pleckstrin-binding protein, serum deprivation response protein (SDPR), by co-immunoprecipitation, GST-pulldowns and nanospray quadruple time of flight mass spectrometry. We show that this interaction occurs directly through N-terminal sequences of pleckstrin. Both pleckstrin and SDPR are phosphorylated by protein kinase C (PKC), but the interaction between pleckstrin and SDPR was shown to be independent of PKC inhibition or activation. These results suggest that SDPR may facilitate the translocation of nonphosphorylated pleckstrin to the plasma membrane in conjunction with phosphoinositides that bind to the C-terminal PH domain. After binding of pleckstrin to the plasma membrane, its phosphorylation by PKC exerts downstream effects on platelet aggregation/secretion.

Global warming in an independent record of the past 130 years

The thermometer-based global surface temperature time series (GST) commands a prominent role in the evidence for global warming, yet this record has considerable uncertainty. An independent record with better geographic coverage would be valuable in understanding recent change in the context of natural variability. We compiled the Paleo Index (PI) from 173 temperature-sensitive proxy time series (corals, ice cores, speleothems, lake and ocean sediments, historical documents). Each series was normalized to produce index values of change relative to a 1901–2000 base period; the index values were then averaged. From 1880 to 1995, the index trends significantly upward, similar to the GST. Smaller-scale aspects of the GST including two warming trends and a warm interval during the 1940s are also observed in the PI. The PI extends to 1730 with 67 records. The upward trend appears to begin in the early 19th century but the year-to-year variability is large and the 1730–1929 trend is small.

Syntrophin mutation associated with long QT syndrome through activation of the nNOS-SCN5A macromolecular complex.

Mutations in 11 genes that encode ion channels or their associated proteins cause inherited long QT syndrome (LQTS) and account for approximately 75-80% of cases (LQT1-11). Direct sequencing of SNTA1, the gene encoding alpha1-syntrophin, was performed in a cohort of LQTS patients that were negative for mutations in the 11 known LQTS-susceptibility genes. A missense mutation (A390V-SNTA1) was found in a patient with recurrent syncope and markedly prolonged QT interval (QTc, 530 ms). SNTA1 links neuronal nitric oxide synthase (nNOS) to the nNOS inhibitor plasma membrane Ca-ATPase subtype 4b (PMCA4b); SNTA1 also is known to associate with the cardiac sodium channel SCN5A. By using a GST-fusion protein of the C terminus of SCN5A, we showed that WT-SNTA1 interacted with SCN5A, nNOS, and PMCA4b. In contrast, A390V-SNTA1 selectively disrupted association of PMCA4b with this complex and increased direct nitrosylation of SCN5A. A390V-SNTA1 expressed with SCN5A, nNOS, and PMCA4b in heterologous cells increased peak and late sodium current compared with WT-SNTA1, and the increase was partially inhibited by NOS blockers. Expression of A390V-SNTA1 in cardiac myocytes also increased late sodium current. We conclude that the A390V mutation disrupted binding with PMCA4b, released inhibition of nNOS, caused S-nitrosylation of SCN5A, and was associated with increased late sodium current, which is the characteristic biophysical dysfunction for sodium-channel-mediated LQTS (LQT3). These results establish an SNTA1-based nNOS complex attached to SCN5A as a key regulator of sodium current and suggest that SNTA1 be considered a rare LQTS-susceptibility gene.

Measurement of structural anisotropy in femoral trabecular bone using clinical-resolution CT images

Discrepancies in finite-element model predictions of bone strength may be attributed to the simplified modeling of bone as an isotropic structure due to the resolution limitations of clinical-level Computed Tomography (CT) data. The aim of this study is to calculate the preferential orientations of bone (the principal directions) and the extent to which bone is deposited more in one direction compared to another (degree of anisotropy). Using 100 femoral trabecular samples, the principal directions and degree of anisotropy were calculated with a Gradient Structure Tensor (GST) and a Sobel Structure Tensor (SST) using clinical-level CT. The results were compared against those calculated with the gold standard Mean-Intercept-Length (MIL) fabric tensor using micro-CT. There was no significant difference between the GST and SST in the calculation of the main principal direction (median error=28°), and the error was inversely correlated to the degree of transverse isotropy (r=−0.34, p<0.01). The degree of anisotropy measured using the structure tensors was weakly correlated with the MIL-based measurements (r=0.2, p<0.001). Combining the principal directions with the degree of anisotropy resulted in a significant increase in the correlation of the tensor distributions (r=0.79, p<0.001). Both structure tensors were robust against simulated noise, kernel sizes, and bone volume fraction. We recommend the use of the GST because of its computational efficiency and ease of implementation. This methodology has the promise to predict the structural anisotropy of bone in areas with a high degree of anisotropy, and may improve the in vivo characterization of bone.

GSTM1 and GSTT1 null polymorphisms and risk of salivary gland carcinoma.

Glutathione S-transferase (GST) genes detoxify and metabolize carcinogens, including oxygen free radicals which may contribute to salivary gland carcinogenesis. This cancer center-based case-control association study included 166 patients with incident salivary gland carcinoma (SGC) and 511 cancer-free controls. We performed multiplex polymerase chain reaction-based polymorphism genotyping assays for GSTM1 and GSTT1 null genotypes. Odds ratios (ORs) and 95% confidence intervals (CIs) were calculated with multivariable logistic regression analyses adjusted for age, sex, ethnicity, tobacco use, family history of cancer, alcohol use and radiation exposure. In our results, 27.7% of the SGC cases and 20.6% of the controls were null for the GSTT1 (P = 0.054), and 53.0% of the SGC cases and 50.9% of the controls were null for the GSTM1 (P = 0.633). The results of the adjusted multivariale regression analysis suggested that having GSTT1 null genotype was associated with a significantly increased risk for SGC (odds ratio 1.5, 95% confidence interval 1.0-2.3). Additionally, 13.9% of the SGC cases but only 8.4% of the controls were null for both genes and the results of the adjusted multivariable regression analysis suggested that having both null genotypes was significantly associated with an approximately 2-fold increased risk for SGC (odds ratio 1.9, 95% confidence interval 1.0-3.5). The presence of GSTT1 null genotype and the simultaneous presence of GSTM1 and GSTT1 null genotypes appear associated with significantly increased SGC risk. These findings warrant further study with larger sample sizes.