Infecção por Cryptosporidium parvum: resposta imunitária e tecnologia de anticorpos monoclonais para o diagnóstico

Cryptosporidium parvum é um protozoário intracelular, de distribuição ubiquitária, que causa enterite em humanos e animais. A diarreia é autolimitada em indivíduos imunocompetentes, podendo ser fatal em imunocomprometidos. Actualmente não existem terapêuticas específicas ou preventivas disponíveis, e o elevado custo dos actuais métodos de diagnóstico, sustentam a importância do desenvolvimento de novas abordagens. Vários estudos salientam a importância das células T CD4+ na resposta imunitária à infecção por C. parvum; outros direccionam a sua atenção para as células reguladoras (Treg); e outros tentam esclarecer qual o papel das citocinas específicas produzidas pelas células Th1 e Th2, na regulação da resposta imune, acompanhada pela produção de imunoglobulinas particulares. Na área do diagnóstico, vários e diferentes métodos têm sido utilizados, variando entre a rapidez de execução, especificidade e custo. Várias questões colocam-se, relacionadas com as características das células envolvidas na resposta à infecção e com a especificidade/sensibilidade de cada técnica. Com o objectivo de estudar a resposta imunitária de longo-termo à infecção por C. parvum, no modelo animal imunocompetente, murganhos Balb/c foram inoculados por via oral com oocistos de C. parvum, e efectivadas colheitas e análise de amostras fecais, intestino, sangue e baço, segundo um protocolo previamente definido. A caracterização das populações celulares do sangue e baço foi feita por citometria de fluxo e a identificação e quantificação de imunoglobulinas e citocinas no soro, por tecnologia xMAP® Luminex. A análise por citometria de fluxo não revelou diferenças estatisticamente significativas entre os murganhos infectados e os controlos, tendo sido apenas observado um aumento do número de neutrófilos e eosinófilos circulantes, e a sua posterior diminuição, no primeiro grupo de murganhos. Associada à elevada variabilidade observada após a reinfecção, tais variações são sugeridas como sendo o perfil exibido por estas populações de células no contexto de infecção por C. parvum no organismo imunocompetente, particularmente os eosinófilos, que apresentam um comportamento idêntico em infecção por outros parasitas. O aumento da secreção de TNF-α e IFN-γ (citocinas Th1) nos murganhos infectados, comparativamente com os grupos controlo, para além da secreção de citocinas Th2, como IL-4, IL-5 e IL-10, após a reinfecção, sugere um balanço entre as respostas Th1, para controlar o crescimento do parasita, e Th2, para limitar a patologia. A IgG1 foi o isotipo predominante ao longo de toda a infecção e reinfecção, tendo-se observado um pico de IgG2a após a reinfecção, seguido de diminuição. Esta variação poderá estar relacionada com a função da IgG1 e da IgG2a, ao nível da opsonização e neutralização dos agentes patogénicos, respectivamente. A obtenção de hibridomas secretores de anticorpos específicos para antigénios de C. parvum, por fusão celular, permitiu obter anticorpos e testar a sua aplicação à detecção de oocistos de C. parvum, em amostras fecais humanas e de animais (bovinos). Em resumo, os resultados obtidos permitem sugerir o perfil de imunoglobulinas e citocinas envolvido na resposta à infecção por C. parvum no modelo roedor imunocompetente, assim como desenvolver um futuro “kit” para detecção de C. parvum em amostras biológicas, por técnicas de imunofluorescência

Glomerulonefrite associada à infecção pelo vírus da hepatiteC

Descrevem-se pacientes com glomerulonefrites (GNs) associadas à infecção pelo vírus da hepatite C (HCV). Entre agosto de 93 e julho de 96 foram observados 4 pacientes, com idade mediana de 41 anos, sendo 2 do sexo masculino. Pesquisaram-se o anti-HCV por ensaio imuno-enzimático e o HCV-RNA por PCR. Também foram pesquisadas crioglobulinas séricas, hemácias dismórficas no sedimento urinário e proteinúria de 24h. Viremia, crioglobulinas, hematúria e proteinúria foram observadas nos 4 pacientes. As biópsias hepáticas revelaram atividade inflamatória nos 3 pacientes em que foram realizadas e as do rim revelaram glomerulonefrite membranoproliferativa em 3 e glomerulonefrite proliferativa mesangial em 1 paciente. Dois pacientes vêm recebendo antivirais (IFN associado à ribavirina) e evoluindo com melhora. A presença de viremia e de hepatite concomitante com as alterações urinárias constituem indícios do envolvimento viral na glomerulopatia. Tais achados são reforçados pela melhora das alterações urinárias durante o tratamento específico. Conclui-se que a pesquisa de marcadores virais em pacientes com GNs assume relevância na medida em que pode modificar a conduta terapêutica.

Estudo de crianças com síndrome do desconforto respiratório agudo: correlação anatomoclínica radiológica

Estudo retrospectivo com revisão dos casos clínicos de Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo, realizado no período de out/88 a dez/90 na Unidade de Pacientes Graves do Instituto Fernandes Figueira. Os autores estudaram as características clínicas, radiológicas e histopatológicas de acordo com o estágio evolutivo da doença. Dentre 459 casos estudados, foram selecionados 49 (11%). Onze casos tiveram exame anatomopatologico [biopsia (4), necropsia (8)] e foram classificados de acordo com o estágio evolutivo em: fase exsudativa inicial, fase proliferativa celular e fase proliferativa fibrótica. Houve correlação clínica radiológica e anatomopatológica nos casos confirmados com exame histológico. Os autores consideram importante estudos futuros em que a interação entre a pesquisa clínica e experimental permita o melhor conhecimento desta Síndrome na população pediátrica.

O bem-estar de suínos como estratégia para agregação de valor.

O aumento na demanda de proteína animal e o aumento da população mundial levaram a 8 produção animal a obter o máximo de rendimento. Sob essas circunstâncias, a produção animal tornou-se 9 mais concentrada e controlada, o que resultou no confinamento dos animais. Desde que mais atenção foi 10 dada a fatores econômicos e rendimento por animal, o bem-estar e comportamento animal foi negligenciado. 11 Contudo, hoje em dia, o bem-estar animal está ganhando mais importância devido à pressão dos 12 consumidores e grandes mercados. Isso não necessariamente significa que fornecer boas práticas de manejo 13 aos animais irá melhorar bem-estar, pois alguns animais podem apresentar distresse mesmo sob boas 14 condições de ambiente . Contudo, a questão antes de qualquer tomada de decisão de investimentos em bem-15 estar animal deveria ser quanto é perdido quando o bem-estar animal é pobre, ao invés de quanto pode ser 16 ganho com os investimentos em bem-estar animal, ou simplesmente fazer isso porque é melhor para os 17 animais. Portanto, uma vez que o bem-estar animal representa um papel importante nas perdas durante a 18 produção, a cadeia produtora de carne deve adaptar-se para mudanças nas regras de bem-estar animal, 19 regulamentos e boas práticas de manejo pré-abate. Nesse artigo de revisão, o bem-estar animal é discutido 20 como uma alternativa para agregar valor melhorar a qualidade da carne suína.

Impact of viral mmunomodulatory proteins

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

Diagnóstico laboratorial da raiva na região oeste do Estado de São Paulo

O laboratório do Pólo da Alta Sorocabana, Presidente Prudente, SP e Instituto Biológico de São Paulo, SP, realizaram avaliação do diagnóstico laboratorial da raiva no período de 1996 a 2003 na região oeste do Estado de São Paulo. Para tal, se fez uso dos testes de imunofluorescência direta e prova biológica (inoculação em camundongos) em 4.950 amostras encaminhadas para análise envolvendo as espécies canina, felina, bovina, quiróptera (morcego) e outras (eqüina, caprina, suína e roedores). Detectou-se a presença de 74 amostras positivas, sendo que destas, 58 (78,4%) foram referentes a quirópteros não hematófagos e 16 (21,6%) para bovinos. O presente estudo epidemiológico constatou que, apesar do alto índice de positividade nos quirópteros, não houve um surto de raiva nestas espécies na região de Presidente Prudente no período estudado, porque o aumento no índice de positividade foi decorrente do significativo aumento de amostras de quirópteros encaminhadas ao laboratório para pesquisa do vírus rábico.

Protein-based nanodevices for therapeutic applications

Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental (área de especialização em Biologia Celular e Saúde).

HPV- detección por técnicas de patología molecular

Se trabaja con materiales de citologías y biopsias de cervix uterino en un grupo de pacientes controles biopsiados por otras sospechas clínicas sin diagnóstico clínico, colposcópico ni citológico de presunción de infección por HPV, y tres grupos de pacientes problemas, scorizados como presuntamente negativos, presuntamente sospechosos y presuntamente infectados, basados en presencia de cortes histológicos de acantosis, hiperplasia de células basales y asas capilares, coilocitorisis, cambios nucleares, binucleación y disqueratosis. Se correlacionan las biopsias con los estudios citológicos; sobre los cortes histológicos se procede a efectuar técnicas de hibridización in situ con sondas Innogenex para los virus 6-11, 6-18, grupo del 30. Se han estudiado las asociaciones del HPV en cervix con otras patologías (especialmente infecciosas) en nuestro medio, lesiones simuladoras de infección por el HPV y se trabajará en los grupos sospechosos y presuntamente infectados que sean positivos para la HIS, con marcaciones de detección de grado de actividad proliferativa para Mib1 y p53 y su relación con los subtipos virales. En las lesiones intraepiteliales relacionadas con el HPV se investigarán en la lesión y en la mucosa vecina receptores estrogénicos y progestacionales para tratar de determinar si la infección viral afecta la expresión de estos receptores.

Caracterización de péptidos circulantes en sangre activadores e inhibidores de linfocitomas

El presente proyecto es continuación de una línea de investigación iniciada en colaboración con el Instituto de Investigaciones de Péptidos de la Universidad de Hannover, Alemania. En el mismo estudiaremos la actividad biológica de un péptido que aislamos y caracterizamos recientemente a partir del hemofiltrado de pacientes renales dializados. Este péptido, compuesto por una doble cadena de 70 aminoácidos unidos por puentes disulfuros en posición paralela, aparece en su forma postranscripcional con 1 a 3 metioninas oxidadas y tiene capacidad de ligar xenobióticos y productos naturales. Por su actividad proliferativa sobre las células de linfoma Nb2, utilizadas como bioanálisis, lo hemos denominado LPAP; péptido activador de la proliferación de linfocitoma. El efecto proliferativo sobre células de linfocitoma y posiblemente sobre otras especies celulares, representa una actividad biológica cuyas implicancias son imponderables. Dada su capacidad de fijar péptidos bioactivos no se puede descartar que el LPAP sea un transportador (o carrier), en cuyo caso la actividad proliferativa debe ser atribuida a otro compuesto firmemente ligado a la molécula secuenciada por nosotros. (...) Los siguientes objetivos son propuestos para los próximos 3 años: 1. Producción de anticuerpos específicos contra LPAP para determinar las células productoras del mismo en el organismo por un mapeo inmunocitoquímico. 2. Desarrollo de un método cuantitativo para valorar las concentraciones del péptido en diferentes fluidos corporales en sujetos en condiciones normales y patológicas. 3. Síntesis parcial o total de la molécula para establecer definitivamente la actividad biológica observada. 4. Caracterización de péptidos inhibitorios de la proliferación del Linfoma. 5. Determinación de prolactina en el hemofiltrado y correlación de su contenido con otras moléculas proliferativas o inhibidoras de las células Nb2.

Modificación de la actividad de células inmunocompetentes en criptococosis y distomatosis experimental

El objetivo de este proyecto es profundizar los conocimientos en las células que regulan las interacciones huésped-parásito en dos modelos experimentales diferentes donde se involucra la participación de Cryptococcus neoformans y Fasciola hepatica. En el primer modelo se continuará analizando el modelo de infección experimental con Cryptococcus neoformans. Para ello se estudiarán las modificaciones que ocurran en los mecanismos de activación del macrófago respecto a la generación de derivados tóxicos del oxígeno y derivados tóxicos del nitrógeno. Por otra parte, considerando que en células tímicas y células esplénicas de animales infectados con Cryptococcus neoformans se ha evideniciado la presencia de células con funciones supresoras; se determinará si el metabolismo de la L-arginina participa en esta actividad supresora. Cultivando células de timo y bazo se determinará la sensibilidad de estas células al óxido nítrico por medio de dadores químicos de NO y por el NO generado por macrófagos activados. Por otra parte se desarrollará un modelo de distomatosis experimental en ratas, en el cual se estudiarán las funciones accesorias de CP de ratas infectadas con Fasciola hepatica y la participación de los productos de excreción-secreción de este parásito en la modificación de estas funciones. Se analizarán las capacidades fagocíticas y presentadoras de antígeno en CP de ratas infectadas como así también en CP de animales inoculados con los productos excretores-secretores del parásito. Además se estudiará la acción de la CP de ratas infectadas con Fasciola hepatica sobre la respuesta proliferativa de células mononucleares de bazo de ratas normales estimuladas con mitógenos.

Mecanismos Celulares y Moleculares que regulan la Secreción, Proliferación y Muerte de Células Lactotropas. Cellular and molecular mechanisms that regulate secretion, proliferation and death of lactotroph cells.

El presente proyecto está dirigido a estudiar los mecanismos celulares y moleculares involucrados en la regulación de la población de lactotropas, como resultado del balance entre los procesos de proliferación y muerte celular correlacionados con la secreción de prolactina. Dentro de las vías de transducción de señales involucradas se determinará la activación de las diferentes isoformas de PKC utilizando inhibidores específicos y la participación de la vía MAPK-ERK1/2 en cultivos primarios adenohipofisarios y en la línea tumoral GH3B6. Además, se completará la caracterización morfológica y bioquímica de los diferentes procesos de muerte celular inducidos por bromocriptina en modelos de regresión de prolactinomas. Se incorporan al presente proyecto nuevas líneas de investigación dirigidas a estudiar la participación de receptores estrogénicos nucleares y de membrana sobre la actividad secretoria y proliferativa de células lactotropas. Se fija como objetivo la identificación de los mismos y su translocación intracelular en respuesta a estímulos específicos. Estas investigaciones se realizarán en cultivo primario de adenohipófisis, a nivel de microscopía electrónica y confocal. La participación de las isoformas alfa y beta de receptores estrogénicos intracelulares y de membrana en los efectos del estradiol sobre la proliferación y secreción de PRL se determinará mediante el uso de agonistas y antagonistas específicos en cultivo primario de adenohipófisis y de la línea GH3B6. Un tema de actualidad es el estudio de vías de señalización involucradas en las acciones del estrógeno en interacción con neuropéptidos o factores de crecimiento, estableciendo la interacción entre los receptores de membrana, además de posibles "crosstalk" entre diferentes rutas de transducción de señales. Como aporte a este tópico se propone estudiar los efectos genómicos y no genómicos del estradiol en interacción con TRH o FGF-2, modulando la actividad secretoria y proliferativa de las células lactotropas. Los datos obtenidos podrán contribuir al conocimiento de nuevas estrategias utilizadas para disminuir el crecimiento de tumores, inhibiendo moléculas claves como receptores de estrógenos, factores de crecimiento y algunas involucradas en las vías de señalización.

Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la inmunosupresión observada durante la infección con Trypanosoma cruzi: Rol de la vía PD-1/PD1-L y E3 ubiquitina ligasas. Molecular mechanismns involved in the immunosupression during Tryapanosoma cruzi infection. Role of PD1-PD1-L pathway and E3 ubiquitin ligases.

Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, un problema de salud importante en América Latina, así como también en América Central, ya que causa infección crónica afectando a millones de personas [1]. Durante esta enfermedad se han descripto varias alteraciones de la respuesta inmune, entre ellas una severa inmunosupresión durante la etapa aguda de la infección, tanto en humanos como en ratones. Células T provenientes de ratones infectados activadas in vitro, muestran reducción en la respuesta proliferativa a mitógenos, característica de un estado de inmunosupresión [2-4]. La falla del sistema inmune durante estadios tempranos de la infección probablemente colabore con la diseminación y el establecimiento del parásito. Un gran número de estudios se han focalizado en la identificación de mecanismos moleculares responsables del fenómeno de inmunosupresión, entre los mecanismos citados se ha demostrado presencia de células supresoras [5-9], factores inmunosupresores presentes en el parásito [2, 3, 10-13], producción excesiva de óxido nítrico [14], disminuida producción de IL-2 y reducida expresión del receptor de IL2 en células de bazo de animales infectados [9, 15-17]. Muchos de estos mecanismos han sido exhaustivamente investigados, sin embargo no está del todo claro si existen mecanismos adicionales involucrados en la inmunosupresión de la célula T. Adicionalmente, en los últimos años nuevas moléculas que median la regulación negativa de la célula T, entre las cuales están PD-1/PD1-L [18], arginasa [19] y E3 ubiquitina ligasas [20-22], han sido reportadas durante inmunosupresión en diversas infecciones. Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease, is parasite causing chronic infections in human and other mammalian species. There is an important immunosupresion during the acute phase of the infection that contribute to the dissemination and installation of the parasite. Several studies have been focused on identifying the mechanisms involved in the immunosupresion; however it is not clear if there are additional mechanisms implicated. In addition, during the last years new molecules involved in the negative T cell regulation such as PD-1/PD1-L pathway and E3 ubiquitin ligases (E3-Ub-Lig) have been reported. It has been demonstrated, that E3-Ub-Lig control the amount and localization of intracellular signal mediators, limiting T cell activation. Moreover, these mechanisms mediate the immunosupresion observed during several infections leading to the persistence of the pathogen in the host. In this project the role of E3-Ub-Lig on the T cell immunosupresion and hipo-response mechanisms observed during T. cruzi infection will be studied. On the other hand, it has been reported that some pathogens release proteins with E3-Ub-Lig activity modifying the ubiquitination process to promote their survival and replication in the host. Recently, a protein with E3-Ub-Lig activity was identified in T. cruzi, however its target molecule has not been discovered yet. Therefore, one of the aims of this project consists on studying different potential target molecules for this novel E3-Ub-Lig. In addition, during the last years, important progress has been done about the biological rol of PD-1/PD1-L pathway on the regulation of the immune response in several infections. However, it is not well known how PD-1/PD1-L pathway transduces signals at intracelular level to block T cell response. Because of this, it is interesting to study if there is any relation between the PD-1/PD1-L pathway and E3-Ub-Lig on the mechanism of T cell immunosupression during T. cruzi infection.

Formas graves de retinopatia predizem aterosclerose subclínica em indivíduos com diabetes tipo 1

FUNDAMENTO: Em pacientes com diabetes tipo 2, a presença de retinopatia está associada a doença cardiovascular aumentada, independentemente dos fatores de risco conhecidos para a doença vascular. OBJETIVO: Investigar a associação da retinopatia diabética (RD) e seus graus com a presença de aterosclerose coronariana subclínica em pacientes com diabetes tipo 1. MÉTODOS: Um estudo transversal foi conduzido com 150 pacientes com diabetes tipo 1, assintomáticos para doença arterial coronariana. Foram submetidos à avaliação clínica para verificar complicações microvasculares e avaliação para a presença de calcificação arterial coronariana (CAC). RESULTADOS: Formas graves de RD (RD grave não proliferativa - RDNP - e RD proliferativa - RDP) foram associadas à CAC (RC: 3,98; IC de 95%; 1,13-13,9, p = 0,03), de maneira independente dos fatores de risco conhecidos para a doença cardiovascular (idade, A1C, hipertensão, dislipidemia e sexo masculino). CONCLUSÃO: Os pacientes com formas graves de RD estão em risco de presença de doença arterial coronariana, de maneira independente dos tradicionais fatores de risco cardiovascular.

Expressão imunoistoquímica de diferenciação e crescimento celular em cardiomiócitos de neonatos

FUNDAMENTO: As alterações cardíacas na fase de transição do coração fetal para a vida extrauterina vêm sendo exploradas por inúmeras pesquisas em animais, e os mecanismos celulares responsáveis por essas modificações ainda não estão bem documentado em seres humanos. OBJETIVO: Avaliar o mecanismo de diferenciação celular em cardiomiócitos ocorridas nos primeiros dias de vida, por meio da análise imunoistoquímica de proteínas envolvidas com processos de proliferação e contração muscular, em amostras de miocárdio de recém-natos humanos. MÉTODO: Estudo transversal de amostras parafinadas de miocárdio provenientes de banco de necropsias de recémnascidos humanos, divididos em dois grupos amostrais: recém-nascidos a termo que foram a óbito com no máximo dois dias de vida (NEO1) com 10 casos, e recém- nascidos a termo que foram a óbito entre três e 10 dias de vida (NEO2) com 14 casos, a fim de seguir uma linha de tempo que contemplasse a fase de transição da circulação fetal a vida extrauterina. As amostras foram estudadas em tissue microarray e os anticorpos utilizados foram o Ki67, PCNA, PTEN, Bcl2 (proliferação) e HHF35 e actina sarcomérica (proteínas contráteis). RESULTADOS: Foi encontrada diferença com o Ki67 p = 0,02, HHF35 p < 0,01 e actina sarcomérica p = 0,02, e a expressão do Ki67 foi mais alta no grupo NEO1 e a expressão do HHF35 e da actina sarcomérica foi mais alta no grupo NEO2. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que os cardiomiócitos apresentam uma característica proliferativa (Ki67) nos NEO1 e que essa vai, seguindo uma linha temporal, sendo substituída por um caráter de diferenciação (HHF35 e actina sarcomérica) nos NEO2.

Infecção per os de gatos com formas vegetativas de Toxoplasma gondii Nicolle & Manceaux, 1909 sem produção de oocistos

Quatro grupos de 6 gatos (24 gatos) recém-nascidos e desmamados receberam "per os", respectivamente, suspensões de toxoplasmas de camundongos com 3-4 dias de infecção, de 4 amostras de T. gondii. Cada grupo teve um gato testemunha. Nenhum dos gatos de experiência eliminou oocistos atribuíveis a T. gondii, em períodos de observação de 6 a 20 dias; e suas fezes, conservadas 2-4 dais em bicromato de potássio a 2,5% e ministradas "per os" a camundongos, não induziram toxoplasmose nesses roedores. Com exceção dos que eram portadores de Isospora, os gatos não mostraram formas evolutivas de coccídios no epitélio intestinal. Em todos os grupos a infecção toxoplásmica foi comprovada pela positividade da reação de Sabin & Feldman (1:16 a 1:1024); e pelo isolamento de toxoplasmas pela inoculação de triturados dos seus principais órgãos em camundongos indicadores. De um modo geral, os gatos mais crescidos não mostraram sinais de doença, porém os outros, e principalmente os recém-nascidos adoeceram e vários morreram de toxoplasmose sistêmica: esplenite, hepatite, enterite, penumonia e, mais raramente, miocardite e encefalite. Os toxoplasmas foram encontrados em todos esses órgãos e, tamém, nos rins e supra-renais.