Peroxisome proliferator-activated receptor mediates cross-talk with thyroid hormone receptor by competition for retinoid X receptor. Possible role of a leucine zipper-like heptad repeat.

The peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) and thyroid hormone receptors (TR) are members of the nuclear receptor superfamily, which regulate lipid metabolism and tissue differentiation. In order to bind to DNA and activate transcription, PPAR requires the formation of heterodimers with the retinoid X receptor (RXR). In addition to activating transcription through its own response elements, PPAR is able to selectively down-regulate the transcriptional activity of TR, but not vitamin D receptor. The molecular basis of this functional interaction has not been fully elucidated. By means of site-directed mutagenesis of hPPAR alpha we mapped its inhibitory action on TR to a leucine zipper-like motif in the ligand binding domain of PPAR, which is highly conserved among all subtypes of this receptor and mediates heterodimerization with RXR. Replacement of a single leucine by arginine at position 433 of hPPAR alpha (L433R) abolished heterodimerization of PPAR with RXR and consequently its trans-activating capacity. However, a similar mutation of a leucine residue to arginine at position 422 showed no alteration of heterodimerization, DNA binding, or transcriptional activation. The dimerization deficient mutant L433R was no longer able to inhibit TR action, demonstrating that the selective inhibitory effect of PPAR results from the competition for RXR as well as possibly for other TR-auxiliary proteins. In contrast, abolition of DNA binding by a mutation in the P-box of PPAR (C122S) did not eliminate the inhibition of TR trans-activation, indicating that competition for DNA binding is not involved. Additionally, no evidence for the formation of PPAR:TR heterodimers was found in co-immunoprecipitation experiments. In summary, we have demonstrated that PPAR selectively inhibits the transcriptional activity of TRs by competition for RXR and possibly non-RXR TR-auxiliary proteins. In contrast, this functional interaction is independent of the formation of PPAR:TR heterodimers or competition for DNA binding.

Role of β-TrCP1, variant and homologue in HIV-1 life cycle

Summary The CD4 molecule plays a key role in AIDS pathogenesis, it is required for entry of the virus into permissive cells and its subsequent down-modulation of the cell surface is a hallmark of HN-1 infected cells. The virus encodes no less than three proteins that participate in this process: Nef, Vpu and Env. Vpu protein interacts with CD4 within the endoplasmic reticulum of infected cells, where it targets CD4 for degradation through the interaction with a cellular protein named ß-TrCP1. This F-box protein functions as the substrate recognition subunit of the SCF ß-Trcr E3 ubiquitin ligase, which normally induce the ubiquitination and subsequent degradation of various proteins such as ß-catenin and IxBa. Mammals possess a homologue of ß-TrCP1, HOS, also named ß-TrCP2 which has a cytoplasmic subcellular distribution. Structural analysis of the ligand-binding domain of both homologues shows striking surface similarities. Both F-box proteins have a redundant role in a number of cellular processes; however the potential role of ß-TrCP2 in HIV-1 infected cells has not been evaluated. In the present study, we assessed the existence of génetic variants of BRTC, encoding ß-TrCP1, and evaluated whether these variants would affect CD4 down-modulation. Additionally, we determined whether ß-TrCP2 shares with its homologue structural and functional properties that would allow it to bind Vpu, modulate CD4 expression, and thus participate in HN-1 pathogenesis. We identified a single nucleotide polymorphism present in the human population with an allelic frequency of 0.03 that leads to the substitution of alanine 507 by a serine. However, we showed by transient transfection in HeLa CD4+ cells that this variant behaves as ß-TrCP1 with respect to CD4 down-modulation. We established transient expression systems in HeLa CD4+ cells to test whether ß-TrCP2 is implicated in Vpu-mediated CD4 down-modulation. We show by coimmunoprecipitation experiments that ß-TrCP2 binds Vpu and is able to induce CD4 down-modulation as efficiently as ß-TrCP1. In two different cell lines, HeLa CD4+ and Jurkat, Vpu-mediated CD4 down-modulation could not be completely reversed through the silencing of endogenous ß-TrCP 1 or ß-TrCP2 individually, but required both genes to be silenced simultaneously. We evaluated the role of ß-TrCP1 and ß-TrCP2 in HIV-1 life cycle using silencing prior to actual viral infection. Both ß-TrCP1 and ß-TrCP2 contributed to CD4 down-modulation during aone-cycle viral infection iri Ghost cells. In addition, the combined silencing of both homologues in the absence of env and nef reversed CD4 down-modulation, showing that ß-TrCP 1 and ß-TrCP2 represent the main and additive effectors of HIV-1 encoded Vpu. In addition, we showed that silencing of ß-TrCPI but not ß-TrCP2 induced a decrease of HIV-1 LTR-driven expression. In a transient transfection system with Tat and a LTR luciferase reporter, both homologues modulated LTR-driven expression. The present study revealed that ß-TrCP2 represents a novel protein participating in HIV-1 cycle and complete comprehension of the complex interplay occurring between the two F-Box will improve our understanding of HIV-1 infection. Résumé La molécule CD4 joue un rôle clef dans la pathogenèse du SIDA ; elle est requise pour l'entrée du virus dans les cellules permissives et la diminution de sa concentration au niveau de la surface cellulaire est une importante caractéristique des cellules infectées par le VIH-1. Le virus encode pas moins de trois protéines qui participent à ce processus Nef, Vpu et Env. La protéine Vpu lie CD4 au niveau du réticulum endoplasmique et induit sa dégradation en interagissant avec une protéine cellulaire nommée ß-TrCP 1. Cette protéine de type F-Box est une sous unité du complexe ubiquitine-ligase E3 SCFß-TrCP. Elle permet la reconnaissance du substrat par le complexe qui induit l'ubiquitination et la subséquente dégradation de diverses protéines cellulaires comme la ß-catenin ou IκBα. Les mammifères possèdent un homologue à ß-TrCP1appelé ß-TrCP2 (ou HOS). L'analyse comparative du domaine permettant la reconnaissance des substrats des deux homologues montre de frappantes similarités. Le rôle de ß-TrCP2 dans le cycle viral du VIH-1 n'a pas encore été évalué. Lors de cette étude, nous avons recherché l'existence de variants génétique de BTRC (codant pour ß-TrCP1) et nous avons évalué si ces variants pourraient affecter la dégradation des molécules CD4 induite par le virus. Nous avons ainsi identifié un polymorphisme présent dans la population humaine avec une fréquence allélique de 0.03 qui consiste en une substitution de l'alanine 507 par une sérine. Nous avons cependant montré par transfection dans des cellules HeLa CD4+ que ce variant se comporte comme ß-TrCP 1 en ce qui concerne la modulation de CD4. De plus, nous avons déterminé si ß-TrCP2 partageait avec son homologue des propriétés structurelles et fonctionnelles qui lui permettraient de lier Vpu, moduler la concentration de CD4 et ainsi prendre part à la pathogenèse du SIDA. Pour ce faire, nous avons établi un système d'expression temporaire dans des cellules HeLa CD4+. Par co-immunoprécipitation, nous avons montré que ß-TrCP2 lie Vpu et est capable d'induire la dégradation de CD4 aussi efficacement que ß-TrCP1. Dans deux différentes lignées cellulaires, HeLa CD4+ et Jurkat, la dégradation de CD4 n'a pu être complètement inhibée par le silencing individuel de ß-TrCP 1 ou ß-TrCP2, mais nécessitait le silencing simultané des 2 gènes. Nous avons évalué le rôle des deux homologues dans le cycle viral du VIH-1 en infectant des cellules Ghost avec le virus après avoir effectué un silencing des deux protéines. Nous avons ainsi montré que ß-TrCP 1 et ß-TrCP2 contribuent de manière additive à la dégradation de CD4 induite par une infection du VIH-1. Le silencing combiné des deux homologues inhiba complètement cette dégradation en l'absence de env et nef, prouvant qu'aucune autre voie ne participe à ce processus: En outre, nous avons montré que le silencing de ß-TrCP 1 mais pas celui de ß-TrCP2 induisait une diminution de l'expression virale sous contrôle du LTR. Nous n'avons cependant pas été en mesure de reconstituer cet effet en exprimant Tat et un gène reporteur sous contrôle du LTR dans des cellules HeLa CD4+. Le présent travail révèle que ß-TrCP2 représente une nouvelle protéine participant dans le cycle viral du VIH-1. Une complète compréhension de l'effet de chacun des deux homologues sur le cycle viral permettra d'améliorer notre compréhension de l'infection par le VIH-1.

Mécanismes moléculaires de la sécrétion d'insuline : implication de Slac2c/MyRIP, protéine effectrice de Rab27a, et rôle des phosphoinositides dans le processus d'exocytose

Résumé : La sécrétion de l'insuline en réponse au glucose circulant dans le sang est la fonction principale de la cellule β. La perte de cette fonction est une des caractéristiques du diabète de type 2. L'exocytose est une fonction cellulaire indispensable au renouvellement des composants lipidiques et protéiques de la membrane cellulaire, à la communication entre les cellules et au maintien d'un environnement adéquat. On peut distinguer deux types d'exocytose : l'exocytose constitutive et l'exocytose régulée. Cette dernière est déclenchée par des stimuli externes. L'exocytose régulée est contrôlée au niveau de la fusion des vésicules de sécrétion avec la membrane plasmique. Certains composants moléculaires impliqués dans ce processus font partie de la famille des GTPases Rab. Les deux membres de cette famille impliqués sont Rab3 et Rab27. Nous avons étudié le rôle de la GTPase Rab27 dans les cellules INS-1E, une lignée cellulaire pancréatique β qui sécrète de l'insuline de façon régulée. Nous avons trouvé que la diminution d'expression de la protéine en utilisant le technique de « RNA interference » diminue la sécrétion stimulée, mais que la distribution des granules n'est nullement affectées par ce changement d'activité intrinsèque. Un des effecteurs identifiés de cette GTPase est Slac2c/MyRIP. Cette protéine possède plusieurs domaines fonctionnels dont un qui lui permet de se lier à l'actine, constituant du cytosquelette cellulaire. L'ensemble de nos résultats suggèrent que Rab27 et MyRIP font partie d'un complexe permettant l'interaction de la granule de sécrétion avec le cytosquelette d'actine corticale et participent à la régulation des dernières étapes de l'exocytose d'insuline. Ensuite, nous avons étudié les phosphoinositides (PI). Les phosphoinositides sont d'importantes molécules impliquées dans le régulation du trafic vésiculaire. Nous avons trouvé que le phosphatidylinosito1-4-phosphate (PI4P) et le phosphatidylinositol-4,5-biphosphate (PI(4,5)P2) augmentent la sécrétion sous l'action de 10µM de Ca2+ dans les cellules INS-1E perméabilisées avec la streptolysine-O. En plus, nous avons démontré que l'exocytose est diminuée dans les cellules intactes exprimant une protéine qui séquestre le PI(4,5)P2. Une diminution similaire est observée en diminuant l'expression de deux enzymes impliquées dans la production du PI(4,5)P2, la PI4Kinase β type III et la PIP5Kinase γ type I. Pour clarifier le mécanisme d'action des PI, nous avons investigué l'implication de trois cibles potentielles des PI, la PLD1, CAPS1 et Mint1. Pour ce faire, nous avons réduit le niveau d'expression endogène de ces protéines, ce qui inhibe la libération d'hormones provoquée par le glucose. Tout ceci indique donc que la production du PI(4,5)P2 est nécessaire pour le contrôle de la sécrétion et suggère qu'une partie de l'effet du PI sur la sécrétion pourrait être exercé par l'activation de la PLD1, CAPS1 et Mint1. Abstract Insulin release from pancreatic β-cells plays an essential role in the achievement of blood glucose homeostasis and defects in the regulation of this process lead to profound metabolic disorders and hyperglycaemia (eg. type 2 diabetes). Almost every cell in our organism releases proteins and other biological compounds using a fundamental cellular process known as constitutive exocytosis. In exocrine and endocrine glands, the cells are endowed with an additional and more refined release mechanism directly tuned by extracellular signals. This process, referred to as regulated exocytosis, ensures the timely delivery of molecules such as peptide hormones and digestive enzymes to match the moment¬-to-moment requirements of the organism. Some of the molecular components involved in this process have been identified, including Rab3 and Rab27, two GTPases that regulate the final steps of secretion in many cells. We investigated the involvement of Rab27 GTPase in the secretory process of the insulin-secreting cell line INS-1E. We found that selective reduction of Rab27 expression by RNA interference did not alter granule distribution but impaired exocytosis triggered by insulin secretagogues. Screening for potential effectors revealed that Slac2c/MyRIP is associated with granules and attenuation of Slac2c expression severely impaired hormone release. This protein contains several functional domains, including, a binding domain for the cellular cytoskeleton constituent actin. Taken together our data suggest the Rab27 and MyRIP are part of a complex mediating the interaction of secretory granules with cortical cytoskeleton and participate to the regulation of the final steps in insulin exoctytosis. In the second part of the thesis, we studied phosphoinositides (PI). Phosphoinositides are important molecules involved in the regulation of vesicular trafficking. We found that phosphatidylinosito1-4-phosphate (PI4P) and phosphatidylinosito1-4,5-biphosphate (PI(4,5)P2) increase the secretory response triggered by 10µM Ca2+ in streptolysin-O permeabilized insulin-secreting INS-1E cells. In addition, nutrient-induced exocytosis was diminished in intact cells expressing constructs that sequester PI(4,5)P2. A similar decrease was observed after silencing of two enzymes involved in PI(4,5)P2 production, type III PI4Kinase β and type I PIP5Kinase γ, by RNA interference. To clarify the mechanism of action of PI, we investigated the involvement in the regulation of exocytosis of three potential PI targets, PLD1, CAPS1 and Mint1. Transfection of cells with silencers capable of reducing the endogenous levels of these proteins inhibited hormone release elicited by glucose. Our data indicate that the production PI(4,5)P2 is necessary for proper control of p-cell secretion and suggest that at least part of the effects of PI on insulin exocytosis could be exerted through the activation of PLD1, CAPS1 and Mint1.

Mécanismes moléculaires de l'homodimérisation de la protéine Scaffold IB1 et son implication dans la sécrétion d'insuline

RÉSUMÉ Les kinases activées par des mitogènes (MAPKs) constituent une importante famille d'enzymes conservée dans l'évolution. Elles forment un réseau de signalisation qui permet à la cellule de réguler spécifiquement divers processus impliqués dans la différenciation, la survie ou l'apoptose. Les kinases formant le module MAPK sont typiquement disposées en cascades de trois partenaires qui s'activent séquentiellement par phosphorylation. Le module minimum est constitué d'une MAPK kinase kinase (MAPKKK), d'une MAPK kinase (MAPKK) et d'une MAPK. Une fois activée, la MAPK phosphoryle différents substrats tels que des facteurs de transcription ou d'autres protéines. Chez les mammifères, trois groupes principaux de MAPKs ont été identifiés. Il s'agit du groupe des kinases régulées par des signaux extracellulaires du type «mitogènes » (ERK), ainsi que des groupes p38 et cJun NH2-terminal kinase (JNK), ou SAPK pour stress activated protein kinase, plutôt activées par des stimuli de type «stress ». De nombreuses études ont impliqué JNK dans la régulation de différents processus physiologiques et pathologiques, comme le diabète, les arthrites rhumatoïdes, l'athérosclérose, l'attaque cérébrale, les maladies de Parkinson et d'Alzheimer. JNK, en particulier joue un rôle dans la mort des cellules sécrétrices d'insuline induite par l'interleukine (IL)-1 β, lors du développement du diabète de type 1. IB1 est une protéine scaffold (échafaud) qui participe à l'organisation du module de JNK. IB1 est fortement exprimée dans les neurones et les cellules β du pancréas. Elle a été impliquée dans la survie des cellules, la régulation de l'expression du transporteur du glucose de type 2 (Glut-2) et dans le processus de sécrétion d'insuline glucose-dépendante. IBl est caractérisée par plusieurs domaines d'interaction protéine-protéine : un domaine de liaison à JNK (JBD), un domaine homologue au domaine 3 de Src (SH3) et un domaine d'interaction avec des tyrosines phosphorylées (PID). Des partenaires d'IB1, incluant les membres de la familles des kinases de lignée mélangée (MLKs), la MAPKK MKK7, la phosphatase 7 des MAPKs (MKP-7) ainsi que la chaîne légère de la kinésine, ont été isolés. Tous ces facteurs, sauf les MLKs et MKK7 interagissent avec le domaine PID ou l'extrême partie C-terminale d'IBl (la chaîne légère de la kinésine). Comme d'autres protéines scaffolds déjà décrites, IBl et un autre membre de la famille, IB2, sont capables d'homo- et d'hétérodimériser. L'interaction a lieu par l'intermédiaire de leur région C-terminale, contenant les domaines SH3 et PID. Mais ni le mécanisme moléculaire, ni la fonction de la dimérisation n'ont été caractérisés. Le domaine SH3 joue un rôle central lors de l'assemblage de complexes de macromolécules impliquées dans la signalisation intracellulaire. Il reconnaît de préférence des ligands contenant un motif riche en proline de type PxxP et s'y lie. Jusqu'à maintenant, tous les ligands isolés se liant à un domaine SH3 sont linéaires. Bien que le domaine SH3 soit un domaine important de la transmission des signaux, aucun partenaire interagissant spécifiquement avec le domaine SH3 d'IB1 n'a été identifié. Nous avons démontré qu'IBl homodimérisait par un nouveau set unique d'interaction domaine SH3 - domaine SH3. Les études de cristallisation ont démontré que l'interface recouvrait une région généralement impliquée dans la reconnaissance classique d'un motif riche en proline de type PxxP, bien que le domaine SH3 d'IB1 ne contienne aucun motif PxxP. L'homodimère d'IB1 semble extrêmement stable. Il peut cependant être déstabilisé par trois mutations ponctuelles dirigées contre des résidus clés impliqués dans la dimérisation. Chaque mutation réduit l'activation basale de JNK dépendante d'IB 1 dans des cellules 293T. La déstabilisation de la dimérisation induite par la sur-expression du domaine SH3, provoque une diminution de la sécrétion d'insuline glucose dépendant. SUMMARY Mitogen activated kinases (MAPK) are an important and conserved enzyme family. They form a signaling network required to specifically regulate process involved in cell differentiation, proliferation or death. A MAPK module is typically organized in a threekinase cascade which are activated by sequential phosphorylation. The MAPK kinase kinase (MAPKKK), the MAPK kinase (MAPKK) and the MAPK constitute the minimal module. Once activated, the MAPK phosphorylates its targets like transcription factors or other proteins. In mammals, three major groups of MAPKs have been identified : the group of extra-cellular regulated kinase (ERK) which is activated by mitogens and the group of p38 and cJun NH2-terminal kinase (JNK) or SAPK for stress activated protein kinase, which are activated by stresses. Many studies implicated JNK in many physiological or pathological process regulations, like diabetes, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, strokes or Parkinson and Alzheimer disease. In particular, JNK plays a crucial role in pancreatic β cell death induced by Interleukin (IL)-1 β in type 1 diabetes. Islet-brain 1 (IB 1) is a scaffold protein that interacts with components of the JNK signal-transduction pathway. IB 1 is expressed at high levels in neurons and in pancreatic β-cells, where it has been implicated in cell survival, in regulating expression of the glucose transporter type 2 (Glut-2) and in glucose-induced insulin secretion. It contains several protein-protein interaction domains, including a JNK-binding domain (JBD), a Src homology 3 domain (SH3) and a phosphotyrosine interaction domain (PID). Proteins that have been shown to associate with IB 1 include members of the Mixed lineage kinase family (MLKs), the MAPKK MKK7, the MAPK phosphatase-7 MKP7, as well as several other ligands including kinesin light chain, LDL receptor related family members and the amyloid precursor protein APP. All these factors, except MLK3 and MKK7 have been shown to interact with the PID domain or the extreme C-terminal part (Kinesin light chain) of IB 1. As some scaffold already described, IB 1 and another member of the family, IB2, have previously been shown to engage in oligomerization through their respective C-terminal regions that include the SH3 and PID domains. But neither the molecular mechanisms nor the function of dimerization have yet been characterized. SH3 domains are central in the assembly of macromolecular complexes involved in many intracellular signaling pathways. SH3 domains are usually characterized by their preferred recognition of and association with canonical PxxP motif. In all these cases, a single linear sequence is sufficient for binding to the SH3 domain. However, although SH3 domains are important elements of signal transduction, no protein that interacts specifically with the SH3 domain of IB 1 has been identified so far. Here, we show that IB 1 homodimerizes through a navel and unique set of SH3-SH3 interactions. X-ray crystallography studies indicate that the dieter interface covers a region usually engaged in PxxP-mediated ligand recognition, even though the IB 1 SH3 domain lacks this motif. The highly stable IB 1 homodimer can be significantly destabilized in vitro by individual point-mutations directed against key residues involved in dimerization. Each mutation reduces IB 1-dependent basal JNK activity in 293T cells. Impaired dimerization induced by over-expression of the SH3 domain also results in a significant reduction in glucose-dependent insulin secretion in pancreatic β-cells.

Analyse des modifications de la chromatine impliquées dans l'effet barrière de CTF1 aux télomères humains

Eukaryotic genomes are compartmentalized in different structural domains that can affect positively or negatively gene expression. These regions of euchromatin and heterochromatin are characterized by distinct histones marks which can facilitate or repress gene transcription. The chromatin environment represents thus one of the main problems to control gene expression in biotechnological applications or gene therapy, since its expression is affected by the chromatin neighboring its locus of insertion. Some chromatin regions like telomeres are composed of constitutive heterochromatin which leads to the telomeric position effect (TPE) that silences genes adjacent to the telomere. TPE is known to spread by the selfrecruitment of the SIR histone deacetylase complex from the telomere in S.cerevisiae, but the histone marks that are associated to telomeric chromatin in mammalian cells remain mostly unknown. The transcription factor CTF1 has shown antisilencing properties in mammalian cells and also a boundary activity against TPE in yeast cells when fused to the yeast Gal4 DNA binding domain. In the work presented here, we describe a dual-reporter system to assess the boundary activity of proteins such as CTF1 at human telomeres. When located between the two reporter genes, CTF1 shields the telomere distal gene from TPE, while the telomereproximal gene remains silenced by telomeric heterochromatin. The boundary activity of CTF1 is shown to act regardless its function of transcriptional activator, by opposition to the transcriptional activator VP16 which activates indifferently both transgenes. Moreover, this study shows that CTF1 boundary activity is linked to its H3 binding function, as expected from a chromatin remodeler. ChIP experiments showed that histone deacetylation is the main histone modification involved in gene silencing at mammalian cell telomeres. Distinctly to yeast cells, the histone deacetylation signal in human cells extented over a short range along the chromosome. CTF1 may help to block this propagation and therefore to restore histones acetylation level on telomere protected locus. Surprisingly, other histone marks such as trimethyl-H3K9 or trimethyl-H4K20 were found on telomere protected locus, while in another clone, unsilencing of telomere distal transgene was associated with recruitment of the histone variant H2A.Z. Thus, I conclude that CTF1 displays a chromatin boundary function which is independent of its transcriptional activity and therefore exhibit features required for use as chromatin insulator in biotechnological applications. RESUME Les génomes eucaryotes sont compartementalisés en domaines structurels qui peuvent affecter positivement ou négativement l'expression des gènes avoisinants. Ces régions dites d'euchromatine ou d'hétérochromatine sont caractérisées par des modifications posttraductionnelles des histones qui peuvent faciliter ou au contraire inhiber la transcription des gènes qui s'y trouvent. Ainsi, isoler un gène de son environnement chromatinien est problème fréquent lorsqu'il s'agit de contrôler son expression dans le cadre d'applications en biotechnologie ou encore en thérapie génique. Certaines régions de chromatine telles que les télomères sont composées d'hétérochromatine constitutive qui mène au silençage des gènes avoisinants. Cet effet de position télomérique (TPE) est connu dans la levure S.cerevisiae comme se propageant par auto-recrutement du complexe de déacétylation d'histone SIR, alors que peu de modifications de chromatine ont pu être associées à ce phénomène dans les cellules de mammifères. Le facteur de transcription CTF1 a montré des propriétés d'anti-silençage dans les cellules de mammifères, ainsi qu'une activité barrière contre le silençage télomérique dans les cellules de levures lorsqu'il est fusionné au domaine de liaison à l'ADN de la protéine de levure Gal4. Dans le travail présenté ci-après est décrit un système à deux gènes rapporteurs permettant de mesurer l'activité barrière de protéines telles que CTF1 aux télomères humains, et les modifications de chromatine qui y sont associées. Lorsque CTF1 est placé entre les deux gènes rapporteurs, le gène distant du télomère est protégé du silençage qui lui est associé, alors que le gène proche du télomère reste soumis à ce silençage induit par l'hétérochromatine télomérique. L'activité barrière de CTF1 est montrée ici comme agissant indépendamment de son activité transcriptionnelle, par opposition à l'activateur transcriptionnel VP16 qui active indifféremment les deux transgènes. En outre, cette étude appuie l'hypothèse stipulant que CTF1 agisse comme remodeleur chromatinien puisqu'elle démontre que son activité barrière est directement dépendante de son activité de liaison avec l'histone H3. De plus, des expériences d'immuno-précipitation de la chromatine démontrent que la déacétylation des histones est le majeur phénomène intervenant dans le silençage télomérique. Par opposition à la levure, ce signal de déacétylation ne se propage dans les cellules humaines que sur une courte distance le long du chromosome. CTF1 agit ainsi en bloquant cette propagation et en restaurant le niveau d'acétylation des histones sur le locus protégé du télomère. De manière surprenante et inattendue, d'autres modifications d'histones telles que 4 les H3K9 et H4K20 triméthylées sont aussi observées à ce locus, tandis le recrutement du variant H2A.Z peut aussi être suffisant à restaurer l'expression du gène distant du télomère. En terme de cette analyse, CTF1 exhibe ainsi une fonction de barrière chromatinienne qui exclue une activité transcriptionnelle non désirée - propriété qui est requise dans l'établissement des isolateurs visant à permettre le contrôle d'un transgène dans le cadre d'applications en biotechnologies.

Cooperating pre-T-cell receptor and TCF-1-dependent signals ensure thymocyte survival.

Intrathymic T-cell maturation critically depends on the selective expansion of thymocytes expressing a functionally rearranged T-cell receptor (TCR) beta chain. In addition, TCR-independent signals also contribute to normal T-cell development. It is unclear whether and how signals from the 2 types of pathways are integrated. Here, we show that T-cell factor-1 (TCF-1), a nuclear effector of the canonical wingless/int (wnt)/catenin signaling pathway, ensures the survival of proliferating, pre-TCR(+) thymocytes. The survival of pre-TCR(+) thymocytes requires the presence of the N-terminal catenin-binding domain in TCF-1. This domain can bind the transcriptional coactivator beta-catenin and may also bind gamma-catenin (plakoglobin). However, in the absence of gamma-catenin, T-cell development is normal, supporting a role for beta-catenin. Signaling competent beta-catenin is present prior to and thus arises independently from pre-TCR signaling and does not substantially increase on pre-TCR signaling. In contrast, pre-TCR signaling significantly induces TCF-1 expression. This coincides with the activation of a wnt/catenin/TCF reporter transgene in vivo. Collectively, these data suggest that efficient TCF-dependent transcription requires that pre-TCR signaling induces TCF-1 expression, whereas wnt signals may provide the coactivator such as beta-catenin. The 2 pathways thus have to cooperate to ensure thymocyte survival at the pre-TCR stage.

International Union of Pharmacology. LXI. Peroxisome proliferator-activated receptors.

The three peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are ligand-activated transcription factors of the nuclear hormone receptor superfamily. They share a high degree of structural homology with all members of the superfamily, particularly in the DNA-binding domain and ligand- and cofactor-binding domain. Many cellular and systemic roles have been attributed to these receptors, reaching far beyond the stimulation of peroxisome proliferation in rodents after which they were initially named. PPARs exhibit broad, isotype-specific tissue expression patterns. PPARalpha is expressed at high levels in organs with significant catabolism of fatty acids. PPARbeta/delta has the broadest expression pattern, and the levels of expression in certain tissues depend on the extent of cell proliferation and differentiation. PPARgamma is expressed as two isoforms, of which PPARgamma2 is found at high levels in the adipose tissues, whereas PPARgamma1 has a broader expression pattern. Transcriptional regulation by PPARs requires heterodimerization with the retinoid X receptor (RXR). When activated by a ligand, the dimer modulates transcription via binding to a specific DNA sequence element called a peroxisome proliferator response element (PPRE) in the promoter region of target genes. A wide variety of natural or synthetic compounds was identified as PPAR ligands. Among the synthetic ligands, the lipid-lowering drugs, fibrates, and the insulin sensitizers, thiazolidinediones, are PPARalpha and PPARgamma agonists, respectively, which underscores the important role of PPARs as therapeutic targets. Transcriptional control by PPAR/RXR heterodimers also requires interaction with coregulator complexes. Thus, selective action of PPARs in vivo results from the interplay at a given time point between expression levels of each of the three PPAR and RXR isotypes, affinity for a specific promoter PPRE, and ligand and cofactor availabilities.

Caspase-1 autoproteolysis is differentially required for NLRP1b and NLRP3 inflammasome function.

Inflammasomes are caspase-1-activating multiprotein complexes. The mouse nucleotide-binding domain and leucine rich repeat pyrin containing 1b (NLRP1b) inflammasome was identified as the sensor of Bacillus anthracis lethal toxin (LT) in mouse macrophages from sensitive strains such as BALB/c. Upon exposure to LT, the NLRP1b inflammasome activates caspase-1 to produce mature IL-1β and induce pyroptosis. Both processes are believed to depend on autoproteolysed caspase-1. In contrast to human NLRP1, mouse NLRP1b lacks an N-terminal pyrin domain (PYD), indicating that the assembly of the NLRP1b inflammasome does not require the adaptor apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC). LT-induced NLRP1b inflammasome activation was shown to be impaired upon inhibition of potassium efflux, which is known to play a major role in NLRP3 inflammasome formation and ASC dimerization. We investigated whether NLRP3 and/or ASC were required for caspase-1 activation upon LT stimulation in the BALB/c background. The NLRP1b inflammasome activation was assessed in both macrophages and dendritic cells lacking either ASC or NLRP3. Upon LT treatment, the absence of NLRP3 did not alter the NLRP1b inflammasome activity. Surprisingly, the absence of ASC resulted in IL-1β cleavage and pyroptosis, despite the absence of caspase-1 autoprocessing activity. By reconstituting caspase-1/caspase-11(-/-) cells with a noncleavable or catalytically inactive mutant version of caspase-1, we directly demonstrated that noncleavable caspase-1 is fully active in response to the NLRP1b activator LT, whereas it is nonfunctional in response to the NLRP3 activator nigericin. Taken together, these results establish variable requirements for caspase-1 cleavage depending on the pathogen and the responding NLR.

Metastatic leishmaniasis. A chronic inflammatory response to Leishmania's viral endosymbiont.

Leishmania parasites have been plaguing humankind for centuries as a range of skin diseases named the cutaneous leishmaniases (CL). Carried in a hematophagous sand fly, Leishmania usually infests the skin surrounding the bite site, causing a destructive immune response that may persist for months or even years. The various symptomatic outcomes of CL range from a benevolent self- healing reddened bump to extensive open ulcerations, resistant to treatment and resulting in life- changing disfiguration. Many of these more aggressive outcomes are geographically isolated within the habitats of certain Neotropical Leishmania species; where about 15% of cases experience metastatic complications. However, despite this correlation, genetic analysis has revealed no major differences between species causing the various disease forms. We have recently identified a cytoplasmic dsRNA virus within metastatic L. guyanensis parasites that acts as a potent innate immunogen capable of worsening lesionai inflammation and prolonging parasite survival. The dsRNA genome of Leishmania RNA virus (LRV) binds and stimulates Toll-Like-Receptor-3 (TLR3), inducing this destructive inflammation, which we speculate as a factor contributing to the development of metastatic disease. This thesis establishes the first experimental model of LRV-mediated leishmanial metastasis and investigates the role of non-TLR3 viral recognition pathways in LRV-mediated pathology. Viral dsRNA can be detected by various non-TLR3 pattern recognition receptors (PRR); two such PRR groups are the RLRs (Retinoic acid-inducible gene 1 like receptors) and the NLRs (nucleotide- binding domain, leucine-rich repeat containing receptors). The RLRs are designed to detect viral dsRNA in the cytoplasm, while the NLRs react to molecular "danger" signals of cell damage, often oligomerizing into molecular scaffolds called "inflammasomes" that activate a potent inflammatory cascade. Interestingly, we found that neither RLR signalling nor the inflammasome pathway had an effect on LRV-mediated pathology. In contrast, we found a dramatic inflammasome independent effect for the NLR family member, NLRP10, where a knockout mouse model showed little evidence of disease. This phenotype was mimicked in an NLR knockout with which NLRP10 is known to interact: NLRC2. As this pathway induces the chronic inflammatory cell lineage TH17, we investigated the role of its key chronic inflammatory cytokine, IL-17A, in human patients infected by L. guyanensis. Indeed, patients infected with LRV+ parasites had a significantly increased level of IL-17A in lesionai biopsies. Interestingly, LRV presence was also associated with a significant decrease in the correlate of protection, IFN-y. This association was repeated in our murine model, where after we were able to establish the first experimental model of LRV-dependent leishmanial metastasis, which was mediated by IL-17A in the absence of IFN-y. Finally, we tested a new inhibitor of IL-17A secretion, SR1001, and reveal its potential as a Prophylactic immunomodulator and potent parasitotoxic drug. Taken together, these findings provide a basis for anti-IL-17A as a feasible therapeutic intervention to prevent and treat the metastatic complications of cutaneous leishmaniasis. -- Les parasites Leishmania infectent l'homme depuis des siècles causant des affections cutanées, appelées leishmanioses cutanées (LC). Le parasite est transmis par la mouche des sables et réside dans le derme à l'endroit de la piqûre. Au niveau de la peau, le parasite provoque une réponse immunitaire destructrice qui peut persister pendant des mois voire des années. Les symptômes de LC vont d'une simple enflure qui guérit spontanément jusqu' à de vastes ulcérations ouvertes, résistantes aux traitements. Des manifestations plus agressives sont déterminées par les habitats géographiques de certaines espèces de Leishmania. Dans ces cas, environ 15% des patients développent des lésions métastatiques. Aucun «facteur métastatique» n'a encore été trouvé à ce jour dans ces espèces. Récemment, nous avons pu identifier un virus résidant dans certains parasites métastatiques présents en Guyane française (appelé Leishmania-virus, ou LV) et qui confère un avantage de survie à son hôte parasitaire. Ce virus active fortement la réponse inflammatoire, aggravant l'inflammation et prolongeant l'infection parasitaire. Afin de diagnostiquer, prévenir et traiter ces lésions, nous nous sommes intéressés à identifier les composants de la voie de signalisation anti-virale, responsables de la persistance de cette inflammation. Cette étude décrit le premier modèle expérimental de métastases de la leishmaniose induites par LV, et identifie plusieurs composants de la voie inflammatoire anti-virale qui facilite la pathologie métastatique. Contrairement à l'homme, les souris de laboratoire infectées par des Leishmania métastatiques (contenant LV, LV+) ne développent pas de lésions métastatiques et guérissent après quelques semaines d'infection. Après avoir analysé un groupe de patients atteints de leishmaniose en Guyane française, nous avons constaté que les personnes infectées avec les parasites métastatiques LV+ avaient des niveaux significativement plus faibles d'un composant immunitaire protecteur important, appelé l'interféron (IFN)-y. En utilisant des souris génétiquement modifiées, incapables de produire de l'IFN-y, nous avons observé de telles métastases. Après inoculation dans le coussinet plantaire de souris IFN-y7" avec des parasites LV+ ou LV-, nous avons démontré que seules les souris infectées avec des leishmanies ayant LV développent de multiples lésions secondaires sur la queue. Comme nous l'avons observé chez l'homme, ces souris sécrètent une quantité significativement élevée d'un composant inflammatoire destructeur, l'interleukine (IL)-17. IL-17 a été incriminée pour son rôle dans de nombreuses maladies inflammatoires chroniques. On a ainsi trouvé un rôle destructif similaire pour l'IL-17 dans la leishmaniose métastatique. Nous avons confirmé ce rôle en abrogeant IL-17 dans des souris IFN-y7- ce qui ralentit l'apparition des métastases. Nous pouvons donc conclure que les métastases de la leishmaniose sont induites par l'IL-17 en absence d'IFN-v. En analysant plus en détails les voies de signalisation anti-virale induites par LV, nous avons pu exclure d'autres voies d'activation de la réponse inflammatoire. Nous avons ainsi démontré que la signalisation par LV est indépendante de la signalisation inflammatoire de type « inflammasome ». En revanche, nous avons pu y lier plusieurs autres molécules, telles que NLRP10 et NLRC2, connues pour leur synergie avec les réponses inflammatoires. Cette nouvelle voie pourrait être la cible pour des médicaments inhibant l'inflammation. En effet, un nouveau médicament qui bloque la production d'IL-17 chez la souris s'est montré prometteur dans notre modèle : il a réduit le gonflement des lésions ainsi que la charge parasitaire, indiquant que la voie anti-virale /inflammatoire est une approche thérapeutique possible pour prévenir et traiter cette infection négligée.

Characterization of the neuronal microtubule regulator SCG10 in transfected cells and " in vivo "

SUMMARY The ability of neuronal processes to find their way along complex paths and to establish appropriate connections depends on continual rearrangements of the cytoskeletal components. The regulation of microtubules plays an important role for morphological changes underlying nevrite outgrowth, axonal elongation, and growth cone steering. SCG10 (superior cervical ganglion clone 10) is a neuronal growthassociated protein developmentally regulated and highly enriched in the neuronal growth cones. SCG10 presents a microtubule destabilizing activity that could participate to the regulation of microtubule dynamics and thus explain microtubule behaviors in the growth cone during axonal elongation and turning. It is here suggested that a tight control of the opposite effects on microtubules of SCG10 and the stabilizing microtubule-associated protein MAP1B allows a fine tuning of cytoskeletal rearrangement and may provide the required microtubule dynamic instability to promote axonal growth. Moreover, antibodyblockade of SCG10 function, that leads to growth cone pauses similar as those triggered by the guidance molecule EphB, and the modulation of SCG10 activity by the Rho GTPase Rnd1 suggest a potential role for SCG10 in the signal transduction pathways of extracellular guidance cues. The identification of the active zone protein Bassoon as a potential interaction partner for the SCG10-related protein NPC2, using atomic force microscopy as well as COS-7 and neuronal cell cultures, also gives new insights for a role of this protein family into the processes of synapse genesis or plasticity. Finally, SCG10 mutant mice generated by gene targeting and expressing a soluble form of the protein have been characterized during early postnatal development and in the adulthood. Due to the deletion of its membrane binding domain, SCG10 specific subcellular targeting to growth cones is compromised and results in impairments of motor and coordination development. Further histological analysis in the sciatic nerve reveal that these symptoms are associated with neurodegenerative signs. RESUME Une navigation correcte des prolongements cellulaires neuronaux leur permettant de former des connections appropriées repose sur de continuels réarrangements des constituants de leur cytosquelette. La régulation des microtubules joue notamment un rôle important dans les changements morphologiques qui accompagnent la croissance axonale et les réorientations du cône de croissance. SCG10 (superior cervical ganglion clone 10) est une protéine étroitement associée à la croissance neuronale, hautement régulée durant le développement et abondante au niveau du cône de croissance. SCG10 présente une activité déstabilisatrice sur les microtubules qui pourrait permettre une régulation des paramètres dynamiques propres aux microtubules et ainsi expliquer leur comportement durant la navigation du cône de croissance. Il est ici proposé qu'un contrôle précis des effets opposés de SCG10 et d'une autre protéine stabilisante associée aux microtubules (MAP1 B) permette un réglage fin des réarrangements du cytosquelette et puisse ainsi produire l'instabilité dynamique nécessaire à la croissance anale. Par ailleurs, le blocage de la fonction de SCG10 par un anticorps spécifique, conduisant à des pauses du cônes de croissance similaires à celles provoquées par la molécule de guidage EphB, ainsi que la modulation de l'activité de SCG10 par la Rho GTPase Rnd1 suggèrent une potentielle implication de SCG10 dans les voies de transduction des signaux provenant de molécules de guidage extracellulaires. L'identification d'une interaction de la protéine synaptique Bassoon avec la protéine NPC2 apparentée à SCG10, au moyen de la microscopie à force atomique et dans des cultures de cellules neuronales et COS-7, ouvre des perspectives concernant ces protéines dans la formation et la plasticité synaptiques. Finalement, des souris mutantes pour SCG10 produites par ciblage de gène et exprimant une forme soluble de la protéine ont été caractérisées durant la phase précoce du développement et à l'âge adulte. La délétion du domaine permettant l'ancrage de SCG10 aux membranes compromet sa sub-localisation au niveau du cône de croissance et résulte en l'apparition de troubles moteurs et de la coordination. Des analyses histologiques complémentaires au niveau du nerf sciatique montrent que ces symptômes sont associés avec des signes neurodégénératifs.

The adaptor complex 2 directly interacts with the alpha 1b-adrenergic receptor and plays a role in receptor endocytosis.

Using the yeast two-hybrid system, we identified the mu 2 subunit of the clathrin adaptor complex 2 as a protein interacting with the C-tail of the alpha 1b-adrenergic receptor (AR). Direct association between the alpha 1b-AR and mu 2 was demonstrated using a solid phase overlay assay. The alpha 1b-AR/mu 2 interaction occurred inside the cells, as shown by the finding that the transfected alpha 1b-AR and the endogenous mu 2 could be coimmunoprecipitated from HEK-293 cell extracts. Mutational analysis of the alpha 1b-AR revealed that the binding site for mu 2 does not involve canonical YXX Phi or dileucine motifs but a stretch of eight arginines on the receptor C-tail. The binding domain of mu 2 for the receptor C-tail involves both its N terminus and the subdomain B of its C-terminal portion. The alpha 1b-AR specifically interacted with mu 2, but not with the mu 1, mu 3, or mu 4 subunits belonging to other AP complexes. The deletion of the mu 2 binding site in the C-tail markedly decreased agonist-induced receptor internalization as demonstrated by confocal microscopy as well as by the results of a surface receptor biotinylation assay. The direct association of the adaptor complex 2 with a G protein-coupled receptor has not been reported so far and might represent a common mechanism underlying clathrin-mediated receptor endocytosis.

RDM1, a novel RNA recognition motif (RRM)-containing protein involved in the cell response to cisplatin in vertebrates.

A variety of cellular proteins has the ability to recognize DNA lesions induced by the anti-cancer drug cisplatin, with diverse consequences on their repair and on the therapeutic effectiveness of this drug. We report a novel gene involved in the cell response to cisplatin in vertebrates. The RDM1 gene (for RAD52 Motif 1) was identified while searching databases for sequences showing similarities to RAD52, a protein involved in homologous recombination and DNA double-strand break repair. Ablation of RDM1 in the chicken B cell line DT40 led to a more than 3-fold increase in sensitivity to cisplatin. However, RDM1-/- cells were not hypersensitive to DNA damages caused by ionizing radiation, UV irradiation, or the alkylating agent methylmethane sulfonate. The RDM1 protein displays a nucleic acid binding domain of the RNA recognition motif (RRM) type. By using gel-shift assays and electron microscopy, we show that purified, recombinant chicken RDM1 protein interacts with single-stranded DNA as well as double-stranded DNA, on which it assembles filament-like structures. Notably, RDM1 recognizes DNA distortions induced by cisplatin-DNA adducts in vitro. Finally, human RDM1 transcripts are abundant in the testis, suggesting a possible role during spermatogenesis.

In vitro characterization of PlySK1249, a novel phage lysin, and assessment of its antibacterial activity in a mouse model of Streptococcus agalactiae bacteremia.

Beta-hemolytic Streptococcus agalactiae is the leading cause of bacteremia and invasive infections. These diseases are treated with β-lactams or macrolides, but the emergence of less susceptible and even fully resistant strains is a cause for concern. New bacteriophage lysins could be promising alternatives against such organisms. They hydrolyze the bacterial peptidoglycan at the end of the phage cycle, in order to release the phage progeny. By using a bioinformatic approach to screen several beta-hemolytic streptococci, a gene coding for a lysin was identified on a prophage carried by Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis SK1249. The gene product, named PlySK1249, harbored an original three-domain structure with a central cell wall-binding domain surrounded by an N-terminal amidase and a C-terminal CHAP domain. Purified PlySK1249 was highly lytic and bactericidal for S. dysgalactiae (2-log10 CFU/ml decrease within 15 min). Moreover, it also efficiently killed S. agalactiae (1.5-log10 CFU/ml decrease within 15 min) but not several streptococcal commensal species. We further investigated the activity of PlySK1249 in a mouse model of S. agalactiae bacteremia. Eighty percent of the animals (n = 10) challenged intraperitoneally with 10(6) CFU of S. agalactiae died within 72 h, whereas repeated injections of PlySK1249 (45 mg/kg 3 times within 24 h) significantly protected the mice (P < 0.01). Thus, PlySK1249, which was isolated from S. dysgalactiae, demonstrated high cross-lytic activity against S. agalactiae both in vitro and in vivo. These encouraging results indicated that PlySK1249 might represent a good candidate to be developed as a new enzybiotic for the treatment of systemic S. agalactiae infections.

Characterization and functional identification of a novel plant extradiol 4,5-dioxygenase involved in betalain pigment biosynthesis in Portulaca Grandiflora

RESUME Les bétalaïnes sont des pigments chromo-alcaloïdes violets et jaunes présents dans les plantes appartenant à l'ordre des Caryophyllales et dans les champignons des genres Amanita et Hygrocybe. Leur courte voie de biosynthèse est élucidée chimiquement depuis de nombreuses années, mais les enzymes impliquées dans cette biosynthèse chez les plantes ne sont toujours pas caractérisées. L'enzyme de la DOPA-dioxygénase d' Amanita muscaria a été identifiée (Girod et Zryd, 1991a), mais de nombreuses tentatives d'isolation d'un homologue chez les plantes ont échoué. Afin d'isoler les gènes spécifiques des bétalaïnes chez les plantes, nous avons construit des banques soustraites d'ADNc à partir d'ARN total de pétales immatures de Portulaca grandiflora (Pg) de génotypes jaunes et blancs, respectivement violets et blancs. Les clones couleur- spécifiques ont été détectés en premier par analyse Northem du RNA de pétales blancs et colorés. Les candidats positifs ont alors été soumis à une analyse de transcription au niveau des tiges colorées, vertes et des feuilles, afin d'établir leur expression spécifique. Deux ARNs messagers complets ont une expression corrélée avec l'accumulation des bétalaïnes dans les tissus. Le premier de ces clones, A.16, code pour une oxydase de l'acyl-Coenzyme A (ACX) putative, mais le domaine de liaison du FAD essentiel pour l'activité d'ACX est absent. Toutes nos tentatives pour démontrer sa fonction ont échoué. Le rôle de cette protéine dans la voie de synthèse des bétalaïnes reste inconnu. Le deuxième de ces clones spécifique aux bétalaïnes, L.6 (isolé par Zaiko, 2000), a été renommé DODA en raison de son homologie avec le domaine LigB (pfam02900) d'une 4,5-dioxygénase extradiol bactérienne. DODA a été identifié in silico comme une dioxygénase extradiol en raison de la conservation stricte, au niveau de sa séquence peptidique, des résidus catalytiques de LigB et de ceux liant le cofacteur fer. Une analyse de transfert Southem a montré que ce gène est unique dans Pg. L'expression transitoire de DODA par transformation biolistique dans des pétales blancs de Pg a produit des taches violettes ou jaunes dans des cellules transformées. Une analyse HPLC de ces taches a démontré leur identité avec les bétalaïnes présentes naturellement dans les pétales violets et jaunes de Pg, confirmant ainsi la complémentation par le gène Pg DODA de l'allèle récessif cc présent dans les pétales blancs de Pg. Des homologues de DODA (DOPA-dioxygénase) ont été identifiés dans de nombreuses espèces de plantes, y compris dans celles sans bétalaïne. L'alignement de ces homologues a permis l'identification d'un motif spécifique aux bétalaïnes à côté d'une histidine catalytique conservée. Ce motif [H-P-(S,A)-(N,D)-x-T-P] remplace le motif [H-N-L-R] conservé dans les plantes sans bétalaïne et le motif [H-N-L-x] présent dans tous les homologues bactériens et archaebactériens. Une modélisation tridimensionnelle préliminaire du site actif de Pg DODA et de son homologue dans la mousse Physcomitrella patens a montré l'importance de ce motif spécifique aux bétalaïnes pour l'accessibilité du substrat au site actif. L'analyse phylogénétique de DODA a confirmé l'évolution séparée de cette protéine chez les plantes à bétalaïnes par comparaison avec celle des plantes sans bétalaïne. Nous avons donc conclu que les bétalaïnes sont apparues par modification de l'affinité pour un substrat d'enzymes similaires à DODA, chez un ancêtre unique des Caryophyllales qui a perdu toute capacité de biosynthèse des anthocyanes. Finalement, Pg DODA n'a aucune similarité avec la protéine DODA d' Amanita muscaria, bien que celle-ci complémente aussi la pigmentation des pétales blancs de Pg. La biosynthèse des bétalaïnes est un exemple remarquable de convergence évolutive biochimique indépendante entre espèces de règnes différents. ABSTRACT Betalains are violet and yellow chromo-alkaloid pigments present in plants belonging to the order Caryophyllales and also in the fungal genera Amanita and Hygrocybe. Their short biosynthetic pathway is chemically well understood since many years, but enzymes involved in the plant pathway are still uncharacterized. The DOPA-dioxygenase from Amanita muscaria was identified (Girod and Zryd, 1991a), but numerous attempts to identify a plant homologue to the corresponding gene, failed. In order to isolate betalain-specific genes in plants, subtractive cDNA libraries were built with total RNA from white and yellow and respectively, violet immature petals from Portulaca grandiflora (Pg) genotypes. Colour-specific clones were first detected by Northern blot analysis using RNA from white and coloured petals. Positive candidates were submitted to further transcription analysis in coloured, green stems and leaves in order to assess their specific expression. Two full-length mRNAs showed a correlated expression with betalain accumulation in tissues. One of them, A.16, encodes a putative acyl-Coenzyme A oxidase (ACX), but missing the FAD binding domain essential for the ACX activity. Thus, all attempts to demonstrate its function failed. The role of this protein in the betalain biosynthesis pathway, if any, is still unknown. The second betalain-specific mRNA, L.6 (isolated by Zaiko, 2000) shows a homology with a LigB domain (pfam02900) from a bacterial extradiol 4,5-dioxygenase. It was then renamed DODA (DOPA-dioxygenase). DODA was identified in silico as a highly conserved extradiol dioxygenase due to the strict conservation of its peptidic sequence with LigB catalytic residues and iron-binding cofactor residues. Southern blot analysis showed that this gene is a single copy-gene in Pg. Transient expression of DODA protein through biolistic transformation of Pg white petals produced violet or yellow spots in individual cells. HPLC analysis of these spots showed an identity with betalain pigments present naturally in yellow and violet Pg petals, thus confirming the complementation of the recessive cc allele present in Pg white petals by Pg DODA gene. DODA homologues were identified in numerous plant species including those without betalain. Alignment of these homologues allowed the identification of a betalain-specific pattern beside a highly conserved catalytic histidine. This [H-P-(S,A)-(N,D)-x-T-P] pattern replaces a [H-N-L-R] pattern strictly conserved in non-betalain plants and a [H-N-L-x] pattern present in all bacterial and archaebacterial homologues. Preliminary three-dimensional modeling of the active site of Pg DODA and its Physcomitrella patens moss homologue revealed the importance of this betalain-specific pattern for the substrate accessibility to the DODA active site. DODA phylogenetic analysis confirmed the separate evolution of this protein in betalain-producing plants. We conclude that betalain pigments appeared in a unique ancestor of the Caryophyllales order in which anthocyanin biosynthetic pathway was impaired, by a modification of enzymes of the DODA family for substrate affinity. The Pg DODA protein has no sequence similarity with Amanita muscaria DODA, despite the fact that they both complement Pg white petals for their pigmentation. Betalain biosynthesis is an interesting example of independent biochemical evolutionary convergence between species from different kingdoms.

Ewing sarcoma cancer stem cells : from mechanisms to therapeutic targeting

Le sarcome d'Ewing (SE) est la 2ème tumeur des os la plus fréquente chez les enfants, et le pronostic est sombre au stade métastatique. La pathogenèse du SE repose sur une translocation, provocant la fusion du domaine activateur du facteur de transcription EWS, avec la partie liant l'ADN de la protéine FLI-1. Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont supposées être les moteurs de la croissance tumorale, et représente de ce fait des cibles thérapeutiques préférentielles. Dans ce travail nous nous sommes efforcés de comprendre, ainsi que de cibler les mécanismes liés à l'émergence des CSC dans le sarcome d'Ewing. La formation des CSC du ES est liée à un défaut de maturation des miRNAs provoqué par une sous-expression d'un gène, TARBP2, dans les CSC. Ce défaut de maturation peut être corrigé par un traitement des cellules avec de l'enoxacine, une fluoroquinolone utilisée pour traiter les infections urinaires. L'enoxacine seule n'étant pas suffisante pour éradiquer les tumeurs in vivo, nous avons testé la combinaison d'une thérapie ciblée sur les CSC avec une chimiothérapie classique, la doxorubicine, ciblant les cellules différentiées. In vitro l'enoxacine induit l'apoptose dans les CCS sans affecter les cellules différentiées, alors que à l'inverse, la doxorubicine n'affecte que les cellules de la « masse » tumorale. In vivo la combinaison de ces deux drogues inhibe la croissance de tumeurs provenant de cellules primaires xenotranplantées et éradique les CSCs. Nos résultats mettent en lumière une nouvelle approche thérapeutique directement applicable pour le sarcome d'Ewing, et pourraient ainsi rapidement déboucher sur des essais cliniques. Dans la deuxième partie de ce travail nous avons essayé de comprendre comment EWS-FLI1, la protéine de fusion issue de la translocation chromosomique du sarcome d'Ewing conduit à la génération des CSC. Pour cela nous avons effectué des ChIPseq (immunoprecipitation de la chromatine suivi de séquençage) pour EWS-FLI1 ainsi que pour certaines modifications histoniques. -- Ewing sarcoma family tumors (ESFT) are the second most frequent bone tumors in children and have a high rate of recurrence when metastatic at presentation. The pathogenesis of Ewing sarcoma is underlayed by a translocation, leading to the fusion of the trans-activating domain of EWS with the FLU DNA binding domain. Cancer stem cells (CSCs) are thought to be the driving force of tumor growth. In this work we focused on understanding the mechanisms underlying ESFT CSC emergence as well as defining targeted therapeutic strategies. Emergence of CSCs in ESFT has been shown to arise from a defect in TARBP2-dependent microRNA maturation, which can be corrected by exposure to the fluoroquinolone enoxacin. As enoxacin alone is not sufficient to reverse tumor growth in vivo, we assessed the effect of combining a drug that abrogates CSC properties with doxorubicin, a standard-of-care therapy in ESFT. Primary ESFT CSCs and bulk tumor cells were treated with different concentration of drugs and displayed divergent responses to doxorubicin and enoxacin. Doxorubicin, which targets the tumor bulk, displayed toxicity toward primary adherent ESFT cells in culture but not to CSC-enriched ESFT spheres. Conversely, enoxacin induced apoptosis but only in ESFT spheres and specifically on the CD133+ population. In combination, the two drugs markedly depleted CSC and strongly reduced primary growth in xenograft assays of two primary ESFT. Our results identify a potentially attractive therapeutic strategy for ESFT that combines mechanism-based targeting of CSC using a low toxicity antibiotic with a standard-of-care cytotoxic drug, offering immediate applications for clinical evaluation. In the second part of this work we performed chromatin immunopercipitation on CSCs and bulk cells for EWS-FLI1 binding as well as some chromatin modifications, and concluded that EWS-FLI1 shows cell context dependent binding.