Dissection moléculaire de la sénescence cellulaire induite par le stress et la thérapie dans le cancer de l’ovaire et son impact sur la réponse des patientes

Le cancer de l’ovaire (COv) est le cancer gynécologique le plus létal chez la femme et les traitements existants, chirurgie et chimiothérapie, ont peu évolué au cours des dernières décennies. Nous proposons que la compréhension des différents destins cellulaires tels que la sénescence que peuvent choisir les cellules du cancer de l’ovaire en réponse à la chimiothérapie pourrait conduire à de nouvelles opportunités thérapeutiques. La sénescence cellulaire a été largement associée à l’activité de la protéine TP53, qui est mutée dans plus de 90% des cas de cancer de l’ovaire séreux de haut grade (COv-SHG), la forme la plus commune de la maladie. Dans nos travaux, à partir d’échantillons dérivés de patientes, nous montrons que les cultures primaires du cancer de l’ovaire séreux de haut grade exposées au stress ou à des drogues utilisées en chimiothérapie entrent en senescence grâce à l’activité d’un isoforme du gène CDKN2A (p16INK4A). Dans ces cellules, nous avons évalué les caractéristiques fondamentales de la sénescence cellulaire tels que les altérations morphologiques, l’activité béta galactosidase associée à la sénescence, les dommages à l’ADN, l’arrêt du cycle cellulaire et le phénotype sécrétoire associé à la sénescence. En utilisant des micromatrices tissulaires construites à partir d’échantillons humains de COv-SHG pré- et post-chimiothérapie, accompagnées de leurs données cliniques, nous avons quantifié des marqueurs de sénescence incluant une diminution de la prolifération cellulaire quelques semaines après chimiothérapie. De façon intéressante, l’expression de p16INK4A dans les échantillons de COv-SHG prétraitement corrèle avec une survie prolongée des patientes suite au traitement. Ceci suggère ainsi pour la première fois un impact biologique bénéfique pour la présence de cellules cancéreuses qui sont capable d’activer la sénescence, particulièrement pour le traitement du cancer de l’ovaire. Dans le but de complémenter les thérapies actuelles avec des approches de manipulation pharmacologique de la sénescence, nos résultats suggèrent qu’il serait important de déterminer l’impact positif ou négatif de la sénescence induite par la thérapie sur la progression de la maladie et la survie, pour chaque type de cancer de façon indépendante.

Implicating the mechanisms of ADP-ribosylation factor activation in the resistance of invasive breast cancer cells to EGFR tyrosine kinase inhibitors

ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rôle dans la formation de vésicules au niveau de l’appareil de Golgi. Récemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons démontré qu’ARF1 est aussi un médiateur important de la signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) contrôlant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’EGFR active la GTPase ainsi que le rôle de cette dernière dans la régulation de la fonction du récepteur demeure inconnue. Dans cette thèse, nous avions comme objectifs de définir le mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et démontrer que l’activation de cette isoforme de ARF joue un rôle essentiel dans la résistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos études démontrent que les protéines d’adaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rôle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement d’ARF1 à l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au récepteur et donc contribue à limiter l’activation d’ARF1. De plus, nous démontrons que ARF1 favorise la résistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de l’expression de ARF1 a augmenté la sensibilité descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons également que de hauts niveaux de ARF1 contribuent à la résistance des cellules à ces médicaments en améliorant la survie et les signaux prolifératifs à travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en évidence le rôle de la protéine ARF1 dans l’apoptose en réponse aux traitements des inhibiteurs de l’EGFR. Nos résultats indiquent que la dépletion d’ARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altérant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libération du cytochrome C. Ensemble, nos résultats délimitent un nouveau mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent l’activité d’ARF1 comme un médiateur important de la résistance aux inhibiteurs EGFR.

Investigation du rôle de Myo9b dans la migration des interneurones GABAergiques corticaux

Les encéphalopathies épileptogènes sont des maladies graves de l’enfance associant une épilepsie, souvent réfractaire, et un retard de développement. Les mécanismes sous-tendant ces maladies sont peu connus. Cependant, nous postulons que ces épilepsies puissent être causées par une dysfonction du réseau inhibiteur. En effet, des défauts de migration ou de maturation des interneurones GABAergiques (INs) corticaux induisent l’épilepsie, tant chez l’humain que chez la souris. Dans le but d’étudier les causes génétiques des encéphalopathies épileptogènes sporadiques inexpliquées, le laboratoire de la Dre Rossignol a procédé au séquençage d’exome entier d’une cohorte d’enfants atteints. Cela a permis d’identifier, chez un patient, une nouvelle mutation de novo, possiblement pathogène, dans le gène MYO9b. MYO9b est impliqué dans la migration de cellules immunitaires et cancéreuses et est exprimée durant le développement cérébral. Nous émettons l’hypothèse voulant que MYO9b puisse être importante pour la migration des INs corticaux. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que Myo9b est exprimé dès le stade embryonnaire par les progéniteurs des INs corticaux et que son expression se restreint aux INs dans le cortex mature. De plus, nous démontrons que la répression ex vivo de Myo9b sélectivement dans les INs au sein de tranches corticales organotypiques embryonnaires mène à des défauts morphologiques majeurs de ces cellules en migration. En effet, ces cellules présentent une morphologie multipolaire et des neurites rostraux plus longs et plus complexes. Ces changements morphologiques pourraient avoir un impact majeur sur la migration des INs et ainsi perturber le développement des réseaux inhibiteurs.

The modelling of electrical current NDT methods and its application to weld testing

Discussion of the numerical modeling of NDT methods based on the potential drop and the disruption of power lines to describe the nature, importance and application of modeling. La 1ère partie est consacrée aux applications aux contrôles par courants de Foucault. The first part is devoted to applications for inspection by eddy currents.

Pedagogia Freinet :mediação para o social, o político e a formação de professores

Ce projet présente dans son premier chapitre une étude historique-bibliographique basée sur la Pédagogie Freinet en France, ainsi que sa formation républicaine, ses courants politiques et idéologiques qui ont moulés l organisation sociale et éducationnelle de ce pays. Ce travail montre le rôle des courants de gauche dans ce processus, cela se reflète aussi sur le jeune Freinet. Les changements opérés dans la décennie de 1950 dans le système scolaire, dans le propre Mouvement Freinet et les ruptures qui ont eues à l intérieur de ce mouvement. Cela se termine avec les directions prises dans les dernières décennies, son arrivée au Brésil et les perspectives actuelles. Le deuxième chapitre aborde la reconstitution historique du Brésil dont sa phase coloniale et impériale. Les événements historiques de la IIIe, IVe et Ve République sont mis en relief avec ceux du Mouvement Freinet. La phase militaire imposée au Brésil et les luttes pour la reconquête de la démocratie. Il se termine avec les considérations sur la LDBEN 9394/96 et l implantation du Curso Normal Superior; un bref historique de la Pédagogie Freinet au Brésil, des thèmes importants travaillés dans le troisième chapitre. Dans ce chapitre une recherche qualitative est décrite basée dans l Etnographie Critique et Multiréférentiellel et aussi dans la Recherche-Action. Elle est développée auprès d un groupe de cinq professeurs des premières classes de l école primaire au collège, inscrites dans le Curso Normal Superior. Les données ont été obtenues à partir de rencontres régulières avec le groupe la médiation didactique , des entretiens, des questionnaires, des observations dans les salles de classe, du travail final du cours, nommé Mémorial de Formation. À travers l ensemble des données, on recherche les apports et l actualité d une proposition pédagogique historiquement firmée pour le développement de la praxis éducative

L'Amérique Latine et les Caraïbes au seuil du troisième millénaire

Avant-proposParfois pour le meilleur et parfois pour le pire, notre monde est un monde globalisé.Nous connaissons actuellement une profonde crise financière à l'échelle planétaire. Fin octobre 2008, le Conseil des chefs de secrétariat des organismes des Nations unies pour la coordination (CEB) déclarait que «la crise que nous traversons aujourd'Hui va avoir des répercussions sur tous les pays, développés et en développement, mais les effets les plus graves seront ressentis essentiellement par ceux qui ne sont pour rien dans le déclenchement de cette crise, à savoir les pauvres des pays en développement».Avant que cette crise n'éclate, Alain Rouquié1 affirmait déjà : «l'état est de retour. Son rôle économique et social pour atténuer les chocs extérieurs et l'impact d'une concurrence sans frontières est à l'ordre du jour».Selon Rouquié, l'ouverture et les réformes structurelles des années quatre-vingt, aussi douloureuses qu'elles aient été, ont eu une utilité fonctionnelle durable. Le problème, dit-il, est que ces réformes ont été accompagnées d'une idéologie opportuniste qui absolutisait le recours à la «main invisible» du marché dans tous les domaines. Ainsi, au nom des nécessités d'une économie mondialisée, l'état, était dénoncé comme un obstacle à la croissance et au progrès. Le fondamentalisme dogmatique et anti-étatique de marché imposait une recette universelle, non discutable et anti-démocratique.L'histoire récente nous démontre qu'il n'existe pas une façon unique de s'intégrer aux courants mondiaux des biens et des capitaux et que l'ensemble des réformes (ouverture, privatisations, dérégulation) considéré à un moment donné comme la seule modalité d'intégration à l'économie mondiale, a été à l'origine d'une série de crises successives en Amérique latine et dans les Caraïbes dont le bilan est étique en termes de réalisations et lourd en frustrations; par ailleurs, les voies hétérodoxes vers la globalisation empruntées par la Chine et par l'inde, par exemple, fortement teintées de caractéristiques idiosyncrasiques en matière de politique économique et dont la direction est restée aux mains des états nationaux affichent des résultats plus positifs.Ce document rend compte des idées centrales de publications récentes de la Commission économique pour l'Amérique latine et les Caraïbes (CEPALC). Les principales sources des thèses dans lesquelles s'inscrivent les idées développées dans les pages qui suivent sont: Mondialisation et développement2, publié en 2002, et Desarrollo productivo en economías abiertas3, publié en 2004. l'information quantitative plus conjoncturelle et les analyses à court terme ont été extraites de différentes éditions des publications annuelles : Balance preliminar de las economías de América Latina y el Caribe, et Estudio económico de América Latina y el Caribe.l'Amérique latine et les Caraïbes a été la région du monde en développement qui a le plus misé sur le programme d'internationalisation et de libéralisation économiques, cristallisé dans ce qui a été connu comme le Consensus de Washington. Les années 1990 ont été marquées par une vague de réformes en ce sens dans tout le continent, dont les résultats, cependant, ont été maigres. Au bilan, certes, des aspects favorables comme l'Atténuation des déséquilibres budgétaires, la fin des processus chroniques d'Hyperinflation qui sévissait dans la région, la modernisation de secteurs spécifiques de l'Appareil de production et l'essor des exportations. Mais dans la colonne des éléments négatifs, on ne peut manquer d'inscrire un taux de croissance faible et volatil, le démantèlement de l'Appareil de production, la hausse du chômage, de l'informalité et de l'inégalité, l'Accroissement de la vulnérabilité extérieure et la dégradation des relations macroéconomiques clés.La région de l'Amérique latine et des Caraïbes est sortie du marasme qui a caractérisé la fin des années 90 et le début de la présente décennie et a retrouvé la voie de la croissance. En effet, l'Année 2007 a été la cinquième année consécutive d'augmentation du produit et, en raison des projections positives pour l'Année 2008, le taux moyen d'augmentation du PIB par habitant pour la période 2003 - 2008 devrait être légèrement supérieur à 3 %, ce qui en ferait la période de croissance la plus marquée et la plus longue depuis 1980.Cette évolution positive a été favorisée par un contexte international propice. l'Augmentation du produit mondial ainsi que l'essor du commerce international, le relèvement du cours international de nombreux produits de base exportés par la région et le faible niveau des taux d'intérêt (situation qui a commencé à se modifier vers le milieu de l'Année 2004 avec le changement de signede la politique monétaire adopté par la Réserve fédérale des états-Unis) se sont avérés favorables à la croissance du PIB ainsi qu'à l'Apparition de caractéristiques inédites dans un processus de croissance soutenue dans la région. C'est ainsi que les pays ont pu mettre fin à la contrainte extérieure, grâce à un excédent continu sur le compte courant résultant à son tour de l'évolution favorable des termes de l'échange, de l'Accélération de la tendance à long terme à la hausse du taux de croissance des exportations et à la forte augmentation des fonds envoyés par les émigrants.Dans le passé, néanmoins, des conjonctures tout aussi positives sur les marchés internationaux n'avaient pas été accompagnées d'une bonne performance régionale. En l'occurrence, l'orientation adoptée en matière de politique économique par de nombreux états de l'Amérique latine et des Caraïbes a joué un rôle déterminant pour tirer parti de facteurs qui, dans un autre contexte, n'auraient pu constituer qu'une autre opportunité perdue. l'obtention d'excédents primaires réitérés dans les comptes publics (grâce à un recouvrement accru et à une attitude prudente dans la gestion des dépenses) ainsi que la volonté de maintenir un taux de change réel compétitif sont des mesures qui, dans le cadre de ce scénario international propice, autorisent un optimisme modéré quant à l'évolution à moyen terme de la région.Cependant, dans un monde en pleine croissance, une gestion macroéconomique ordonnée n'est pas suffisante pour asseoir un processus de développement. l'un des héritages des années 90 est L'hétérogénéité croissante de la structure de production qui s'est traduite par l'exclusion massive de certains agents économiques alors que d'autres progressaient vers la modernisation productive.On peut distinguer aujourd'Hui, dans l'économie latino-américaine, trois grands groupes d'unités productives en fonction de leur degré de formalisation et de leur taille. Le premier groupe est celui composé par les grandes entreprises, dont beaucoup sont transnationales et dont les niveaux de productivité sont proches de la barre internationale mais qui, dans le même temps, n'ont guère de liens avec l'économie locale et présentent une très faible capacité endogène de générer des innovations. Le deuxième groupe englobe les petites et moyennes entreprises du secteur formel qui éprouvent généralement de grandes difficultés d'accès à certains marchés, en particulier au marché financier et à celui des services technologiques, et qui présentent surtout une faible capacité d'articulation productive au sein même du groupe et avec les plus grandes entreprises. Le dernier groupe est celui des micro et petites entreprises du secteur informel qui, en raison de leur structure et de leurs capacités, affichent la productivité relative la plus faible et fonctionnent dans un contexte qui les prive de toute possibilité de développement et d'apprentissage. En outre, les travailleurs salariés et les chefs de micro-entreprises de ce secteur n'ont aucune forme de protection sociale contre les risques qui les menacent, incluant la perte d'emploi ou de revenus.Le développement productif de cette véritable économie à trois vitesses passe par l'Adoption de politiques publiques volontaristes propres à niveler le terrain de jeu grâce à une structure différenciée d'aides et d'incitations.l'Administration de la macroéconomie et les politiques productives ne représentent toutefois qu'une partie des initiatives nécessaires pour jeter les bases d'un processus de développement économique à long terme. Il est indispensable de réparer la déchirure du tissu social qui est l'un des effets secondaires les plus graves de l'expérience de politique mise en oeuvre dans les années 90. l'Aggravation de L'hétérogénéité productive et de l'inégalité, ainsi que l'Augmentation de l'informalité et du chômage ne se traduisent pas seulement en pertes statiques et dynamiques en termes de niveau du produit et de taux de croissance à long terme; elles constituent également une menace latente à la cohabitation démocratique et à l'unité des perspectives et d'objectifs qui doit accompagner les processus de changement historique inévitablement impliqués dans le développement économique.C'est pourquoi la CEPALC a proposé la création d'un pacte de cohésion sociale fondé sur l'Adoption d'engagements réciproques entre les différents secteurs sociaux et l'état afin de jeter les bases d'un avenir inclusif du point de vue social dans la région. Ce pacte repose sur plusieurs piliers: la cohérence vis-à-vis des fondements de la politique économique, la création d'emplois, la protection sociale, ainsi que l'éducation et la formation professionnelle pour l'ensemble de la population.Depuis l'époque de Celso Furtado et Raúl Prebisch, des concepts comme le schéma centre - périphérie et l'étude des tendances à long terme des termes de l'échange, l'importance de la contrainte extérieure pour la stabilité macroéconomique des économies moins développées, la nécessité de promouvoir, à partir de l'état, la croissance de certaines activités ou de certains secteurs productifs considérés comme stratégiques ainsi que le lien entre le phénomène inflationniste et l'Action distributive ont nourri le débat intellectuel dans le continent et inspiré les responsables de la prise de décision de différents gouvernements et à différentes périodes.La synthèse de documents récents présentée ici prétend suivre cette même voie de construction d'une pensée locale qui se découvre universelle en révélant les particularités de son contexte et qui trouve sa justification dans la volonté de contribuer à l'émergence d'acteurs sociaux et de réalités nationales souvent oubliés.Devant la profondeur de la crise d'origine financière qui touche toute la planète et dont les répercussions les plus graves seront ressenties par les pauvres des pays en développement, nous rejoignons Rouquié pour dire, au sens vertueux, que l'état est de retour pour s'acquitter des tâches que le marché a été, à lui seul, incapable de réaliser.Alicia BárcenaSecrétaire exécutiveCommission économique pour l'Amériquelatine et les Caraïbes (CEPALC)RésuméCe livre de la CEPALC est publié conjointement avec la Coopération française et contient deux essais sur l'Amérique latine et les Caraïbes où sont essentiellement abordés les défis qui se posent à la région au seuil de ce millénaire. Ces premières années du millénaire se caractérisent d'ores et déjà par une conjoncture économique difficile dont il est encore difficile de mesurer les conséquences.Le premier article rédigé par des experts de la CEPALC rend compte des idées centrales de publications récentes de la Commission. Les thèses dans lesquelles s'inscrivent les idées développées dans les pages qui suivent émanent des publications ci-après: Mondialisation et développement, publié en 2002, et Desarrollo productivo en economías abiertas, publié en 2004. l'information quantitative plus conjoncturelle et les analyses à court terme ont été extraites de différentes éditions des publications annuelles: Balance preliminar de las economías de América Latina y el Caribe, et Estudio económico de América Latina.Le deuxième article, rédigé par Alain Rouquié, expert en questions latino-américaines et président de la Maison de l'Amérique latine à Paris, propose, selon les propres dires de l'Auteur, une série de réflexions libres sur l'Amérique latine.La publication conjointe de ces deux essais met en relief une complémentarité de perspectives issues des deux hémisphères du globe, ce qui confère à cet ouvrage un intérêt tout particulier.

La transformation productive 20 ans aprés: problémes anciens, nouvelles opportunités. Synthése

Incluye Bibliografía

As transformações históricas e a dinâmica atual da paisagem na alta bacia do rio Pericumã, MA

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Le poids de la notion Tesniérienne de centralité du verbe dans les analyses linguistiques

This paper examines the historical role that Tesnière’s theory on the centrality of the verb exerted on some theoretical branches that study the way utterances are built in language. The main goal of this paper is to evaluate the impact that such a proposal had in changing the view of the clause being purely logical (a proposition) or purely syntactic (abstractly equated) to a view that embodies semantics and pragmatics to the syntactic organization of the utterance. A close examination of research dedicated to the grammatical and lexicographic description of Portuguese helps to illustrate the here proposed assessment and contributes to support the claim of the influence of Tesnière on current linguistic analyses.

PCSK9 inhibitors: emerging treatment to lower cholesterol?

The achievement rate of recommended low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) targets of < 1.8 mmol/l for secondary prevention in very high risk patients is difficult. Observational studies reported that loss of function mutation of the PCS9 was associated with LDL-C decrease level and reduction of cardiovascular events. Monoclonal antibodies to PCSK9 (REGN727 and AMG 145, PSCK9 inhibitors) have been tested in clinical studies of phase I and II and showed LDL-C level reduction of 60-70% compared to placebo. This approach appears safe and well-tolerated. The PCSK9 inhibitors are now tested in large phase III clinical studies to assess the long-term safety and efficacy of this new promising approach.

Numerical modeling of electromagnetic coupling phenomena in the vicinities of overhead power transmission lines.

Electromagnetic coupling phenomena between overhead power transmission lines and other nearby structures are inevitable, especially in densely populated areas. The undesired effects resulting from this proximity are manifold and range from the establishment of hazardous potentials to the outbreak of alternate current corrosion phenomena. The study of this class of problems is necessary for ensuring security in the vicinities of the interaction zone and also to preserve the integrity of the equipment and of the devices there present. However, the complete modeling of this type of application requires the three- -dimensional representation of the region of interest and needs specific numerical methods for field computation. In this work, the modeling of problems arising from the flow of electrical currents in the ground (the so-called conductive coupling) will be addressed with the finite element method. Those resulting from the time variation of the electromagnetic fields (the so-called inductive coupling) will be considered as well, and they will be treated with the generalized PEEC (Partial Element Equivalent Circuit) method. More specifically, a special boundary condition on the electric potential is proposed for truncating the computational domain in the finite element analysis of conductive coupling problems, and a complete PEEC formulation for modeling inductive coupling problems is presented. Test configurations of increasing complexities are considered for validating the foregoing approaches. These works aim to provide a contribution to the modeling of this class of problems, which tend to become common with the expansion of power grids.

Proline and pyrrolidine derivatives: new drug cadidates for hepatitis C treatment

The more advantageous hepatitis C virus (HCV) inhibitors (most of them incorporating polysubstituted prolines or pyrrolidines) are detailed in this paper. The improvement of current treatments by combination of antiviral drugs is the driving force of this race to reduce the fast proliferation of this virus. The enhancement of efficiency in short periods of treatment is crucial in the economical point of view and for the hope of all infected people. New protease or polymerase inhibitors have been recently developed in order to substitute the traditional highly toxic PEG-interferon α-2b/ribavirin tandem. The contribution of our group in this field concerns the elaboration of the first and second generation GSK polymerase inhibitors through enantioselective processes based on silver(I)- and gold(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of azomethine ylides.

La tagatose-1,6-bisphosphate aldolase et la fructose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I : mécanisme et stéréospécificité

La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase qui fait preuve d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-bisphosphate (FBP), du sorbose-1,6-bisphosphate et du psicose-1,6-bisphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Aldolase de classe I, qui donc catalyse sa réaction en formant un intermédiaire covalent obligatoire, ou base de Schiff, avec son susbtrat, la TBP aldolase de S. pyogenes partage 14 % d’identité avec l’enzyme modèle de cette famille, la FBP aldolase de muscle de mammifère. Bien que le mécanime catalytique de la FBP aldolase des mammifères ait été examiné en détails et qu’il soit approprié d’en tirer des renseignements quant à celui de la TBP aldolase, le manque singulier de stéréospécificité de cette dernière tant dans le sens du clivage que celui de la condensation n’est toujours pas éclairci. Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution des structures de l’enzyme native et mutée, en complexe avec des subtrats et des inhibiteurs compétitifs, à des résolutions comprises entre 1.8 Å et 2.5 Å. Le trempage des cristaux de TBP aldolase native et mutante dans une solution saturante de FBP ou TBP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire covalent lié à la Lys205, la lysine catalytique. La determination des profils pH de la TBP aldolase native et mutée, entreprise afin d'évaluer l’influence du pH sur la réaction de clivage du FBP et TBP et ìdentifier le(s) résidu(s) impliqué(s), en conjonction avec les données structurales apportées par la cristallographie, ont permis d’identifier sans équivoque Glu163 comme résidu responsable du clivage. En effet, le mode de liaison sensiblement différent des ligands utilisés selon la stéréochimie en leur C3 et C4 permet à Glu163, équivalent à Glu187 dans la FBP aldolase de classe I, d’abstraire le proton sur l’hydroxyle du C4 et ainsi d’amorcer le clivage du lien C3-C4. L’étude du mécanimse inverse, celui de la condensation, grâce par exemple à la structure de l’enzyme native en complexe avec ses substrats à trois carbones le DHAP et le G3P, a en outre permis d’identifier un isomérisme du substrat G3P comme possible cause de la synthèse des isomères en C4 par cette enzyme. Ce résultat, ainsi que la decouverte d’un possible isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP, identifié précedemment, permet de cerner presque complètement les particularités du mécanisme de cette enzyme et d’expliquer comment elle est capable de synthétiser les quatres stéréoisomères 3(S/R), 4(S/R). De plus, la résolution de ces structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie. Enfin, la résolution de la structure du mutant Lys229→Met de la FBP aldolase de muscle en complexe avec la forme cyclique du FBP, de même que des études cristallographiques sur le mutant équivalent Lys205→Met de la TBP aldolase de S. pyogenes et des expériences de calorimétrie ont permis d’identifier deux résidus particuliers, Ala31 et Asp33 chez la FBP aldolase, comme possible cause de la discrimination de cette enzyme contre les substrats 3(R) et 4(S), et ce par encombrement stérique des substrats cycliques. La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières.

Développement et utilisation de modèles in vitro et de données précliniques pour augmenter la prédictibilité de la perméabilité et du métabolisme intestinal chez l'humain

Tout médicament administré par la voie orale doit être absorbé sans être métabolisé par l’intestin et le foie pour atteindre la circulation systémique. Malgré son impact majeur sur l’effet de premier passage de plusieurs médicaments, le métabolisme intestinal est souvent négligé comparativement au métabolisme hépatique. L’objectif de ces travaux de maîtrise est donc d’utiliser, caractériser et développer différents outils in vitro et in vivo pour mieux comprendre et prédire l’impact du métabolisme intestinal sur l’effet de premier passage des médicaments comparé au métabolisme hépatique. Pour se faire, différents substrats d’enzymes du métabolisme ont été incubés dans des microsomes intestinaux et hépatiques et des différences entre la vitesse de métabolisme et les métabolites produits ont été démontrés. Afin de mieux comprendre l’impact de ces différences in vivo, des études mécanistiques chez des animaux canulés et traités avec des inhibiteurs enzymatiques ont été conduites avec le substrat métoprolol. Ces études ont démontré l’impact du métabolisme intestinal sur le premier passage du métoprolol. De plus, elles ont révélé l’effet sur la vidange gastrique du 1-aminobenzotriazole, un inhibiteur des cytochromes p450, évitant ainsi une mauvaise utilisation de cet outil dans le futur. Ces travaux de maîtrise ont permis d’améliorer les connaissances des différents outils in vitro et in vivo pour étudier le métabolisme intestinal tout en permettant de mieux comprendre les différences entre le rôle de l’intestin et du foie sur l’effet de premier passage.

Modifications post-traductionnelles des canaux calciques cardiaques de type L : identification des résidus asparagine qui participent à la glycosylation de la sous-unité auxiliaire CaVα2δ1

Les canaux calciques de type L CaV1.2 sont principalement responsables de l’entrée des ions calcium pendant la phase plateau du potentiel d’action des cardiomyocytes ventriculaires. Cet influx calcique est requis pour initier la contraction du muscle cardiaque. Le canal CaV1.2 est un complexe oligomérique qui est composé de la sous-unité principale CaVα1 et des sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. CaVβ joue un rôle déterminant dans l’adressage membranaire de la sous-unité CaVα1. CaVα2δ1 stabilise l’état ouvert du canal mais le mécanisme moléculaire responsable de cette modulation n’a pas été encore identifié. Nous avons récemment montré que cette modulation requiert une expression membranaire significative de CaVα2δ1 (Bourdin et al. 2015). CaVα2δ1 est une glycoprotéine qui possède 16 sites potentiels de glycosylation de type N. Nous avons donc évalué le rôle de la glycosylation de type-N dans l’adressage membranaire et la stabilité de CaVα2δ1. Nous avons d’abord confirmé que la protéine CaVα2δ1 recombinante, telle la protéine endogène, est significativement glycosylée puisque le traitement à la PNGase F se traduit par une diminution de 50 kDa de sa masse moléculaire, ce qui est compatible avec la présence de 16 sites Asn. Il s’est avéré par ailleurs que la mutation simultanée de 6/16 sites (6xNQ) est suffisante pour 1) réduire significativement la densité de surface de! CaVα2δ1 telle que mesurée par cytométrie en flux et par imagerie confocale 2) accélérer les cinétiques de dégradation telle qu’estimée après arrêt de la synthèse protéique et 3) diminuer la modulation fonctionnelle des courants générés par CaV1.2 telle qu’évaluée par la méthode du « patch-clamp ». Les effets les plus importants ont toutefois été obtenus avec les mutants N663Q, et les doubles mutants N348Q/N468Q, N348Q/N812Q, N468Q/N812Q. Ensemble, ces résultats montrent que Asn663 et à un moindre degré Asn348, Asn468 et Asn812 contribuent à la biogenèse et la stabilité de CaVα2δ1 et confirment que la glycosylation de type N de CaVα2δ1 est nécessaire à la fonction du canal calcique cardiaque de type L.