Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.

The checkpoint in cell development that controls successful T cell receptor (TCR) gene rearrangements remains poorly characterized. Using mice expressing a reporter gene 'knocked into' the Tcrd constant region gene, we have characterized many of the events that mark the life of early cells in the adult thymus. We identify the developmental stage during which the Tcrd locus 'opens' in early T cell progenitors and show that a single checkpoint controls cell development during the penultimate CD4-CD8- stage. Passage through this checkpoint required the assembly of TCR heterodimers on the cell surface and signaling via the Lat adaptor protein. In addition, we show that selection triggered a phase of sustained proliferation similar to that induced by the pre-TCR.

Epidermal Langerhans Cells are Dispensable for Humoral and Cell-Mediated Immunity Elicited by Gene Gun Immunization.

Gene gun immunization, i.e., bombardment of skin with DNA-coated particles, is an efficient method for the administration of DNA vaccines. Direct transfection of APC or cross-presentation of exogenous Ag acquired from transfected nonimmune cells enables MHC-I-restricted activation of CD8(+) T cells. Additionally, MHC-II-restricted presentation of exogenous Ag activates CD4(+) Th cells. Being the principal APC in the epidermis, Langerhans cells (LC) seem ideal candidates to accomplish these functions. However, the dependence on LC of gene gun-induced immune reactions has not yet been demonstrated directly. This was primarily hampered by difficulties to discriminate the contributions of LC from those of other dermal dendritic cells. To address this problem, we have used Langerin-diphtheria toxin receptor knockin mice that allow for selective inducible ablation of LC. LC deficiency, even over the entire duration of experiments, did not affect any of the gene gun-induced immune functions examined, including proliferation of CD4(+) and CD8(+) T cells, IFN-gamma secretion by spleen cells, Ab production, CTL activity, and development of protective antitumor immunity.

Skin Dendritic Cell Targeting via Microneedle Arrays Laden with Antigen-Encapsulated Poly-D, L-lactide-co-Glycolide Nanoparticles Induces Efficient Antitumor and Antiviral Immune Responses

The efficacious delivery of antigens to antigen-presenting cells (APCs), in particular, to dendritic cells (DCs), and their subsequent activation remains a significant challenge in the development of effective vaccines. This study highlights the potential of dissolving microneedle (MN) arrays laden with nanoencapsulated antigen to increase vaccine immunogenicity by targeting antigen specifically to contiguous DC networks within the skin. Following in situ uptake, skin-resident DCs were able to deliver antigen-encapsulated poly-d,l-lactide-co-glycolide (PGLA) nanoparticles to cutaneous draining lymph nodes where they subsequently induced significant expansion of antigen-specific T cells. Moreover, we show that antigen-encapsulated nanoparticle vaccination via microneedles generated robust antigen-specific cellular immune responses in mice. This approach provided complete protection in vivo against both the development of antigen-expressing B16 melanoma tumors and a murine model of para-influenza, through the activation of antigen-specific cytotoxic CD8(+) T cells that resulted in efficient clearance of tumors and virus, respectively. In addition, we show promising findings that nanoencapsulation facilitates antigen retention into skin layers and provides antigen stability in microneedles. Therefore, the use of biodegradable polymeric nanoparticles for selective targeting of antigen to skin DC subsets through dissolvable MNs provides a promising technology for improved vaccination efficacy, compliance, and coverage.

Th1 not Th17 cells drive spontaneous MS-like disease despite a functional regulatory T cell response

Multiple sclerosis is considered a disease of complex autoimmune etiology, yet there remains a lack of consensus as to specific immune effector mechanisms. Recent analyses of experimental autoimmune encephalomyelitis, the common mouse model of multiple sclerosis, have investigated the relative contribution of Th1 and Th17 CD4 T cell subsets to initial autoimmune central nervous system (CNS) damage. However, inherent in these studies are biases influenced by the adjuvant and toxin needed to break self-tolerance. We investigated spontaneous CNS disease in a clinically relevant, humanized, T cell receptor transgenic mouse model. Mice develop spontaneous, ascending paralysis, allowing unbiased characterization of T cell immunity in an HLA-DR15-restricted T cell repertoire. Analysis of naturally progressing disease shows that IFN?(+) cells dominate disease initiation with IL-17(+) cells apparent in affected tissue only once disease is established. Tregs accumulate in the CNS but are ultimately ineffective at halting disease progression. However, ablation of Tregs causes profound acceleration of disease, with uncontrolled infiltration of lymphocytes into the CNS. This synchronous, severe disease allows characterization of the responses that are deregulated in exacerbated disease: the correlation is with increased CNS CD4 and CD8 IFN? responses. Recovery of the ablated Treg population halts ongoing disease progression and Tregs extracted from the central nervous system at peak disease are functionally competent to regulate myelin specific T cell responses. Thus, in a clinically relevant mouse model of MS, initial disease is IFN? driven and the enhanced central nervous system responses unleashed through Treg ablation comprise IFN? cytokine production by CD4 and CD8 cells, but not IL-17 responses.

Characterization of NKR+ T-cell subsets in human bone marrow:implications for immunosurveillance of neoplasia

In addition to hematopoietic progenitors, human bone marrow contains mature T/NK lymphocytes. Valpha24Vbeta11 NKT-cells, a subset of NK receptor+ (NKR+) T-cells in humans, are rare in bone marrow, suggesting the presence of other NKR+ T-cells which may contribute to tumor surveillance. NKR+/- T-cells were examined in blood (PB), and bone marrow from donors (DM) and patients with active hematopoietic malignancy (PM), or in remission (PR). T-cells in PR & PM were enriched for CD56+ and CD57+ subsets, compared to DM. All marrow NKR+/- T-cell subsets were more activated than PB. PM and, surprisingly, PR marrow contained more activated cells than DM. CD8+ cells were significantly increased in all patient marrows and there was evidence of the formation of an effector/memory pool in malignant marrow. These data suggest that NKR+ T-cell enrichment in human bone marrow that has been exposed to neoplastic transformation is compatible with a role in localized tumor surveillance/eradication.

Notch1 and T-cell development: insights from conditional knockout mice.

Notch proteins influence cell-fate decisions in many developmental systems. Gain-of-function studies have suggested a crucial role for Notch1 signaling at several stages during lymphocyte development, including the B/T, alphabeta/gammadelta and CD4/CD8 lineage choices. Here, we critically re-evaluate these conclusions in the light of recent studies that describe inducible and tissue-specific targeting of the Notch1 gene.

Redirection of T cells by delivering a transgenic mouse-derived MDM2 tumor antigen-specific TCR and its humanized derivative is governed by the CD8 coreceptor and affects natural human TCR expression.

Retroviral transfer of T cell antigen receptor (TCR) genes selected by circumventing tolerance to broad tumor- and leukemia-associated antigens in human leukocyte antigen (HLA)-A*0201 (A2.1) transgenic (Tg) mice allows the therapeutic reprogramming of human T lymphocytes. Using a human CD8 x A2.1/Kb mouse derived TCR specific for natural peptide-A2.1 (pA2.1) complexes comprising residues 81-88 of the human homolog of the murine double-minute 2 oncoprotein, MDM2(81-88), we found that the heterodimeric CD8 alpha beta coreceptor, but not normally expressed homodimeric CD8 alpha alpha, is required for tetramer binding and functional redirection of TCR- transduced human T cells. CD8+T cells that received a humanized derivative of the MDM2 TCR bound pA2.1 tetramers only in the presence of an anti-human-CD8 anti-body and required more peptide than wild-type (WT) MDM2 TCR+T cells to mount equivalent cytotoxicity. They were, however, sufficiently effective in recognizing malignant targets including fresh leukemia cells. Most efficient expression of transduced TCR in human T lymphocytes was governed by mouse as compared to human constant (C) alphabeta domains, as demonstrated with partially humanized and murinized TCR of primary mouse and human origin, respectively. We further observed a reciprocal relationship between the level of Tg WT mouse relative to natural human TCR expression, resulting in T cells with decreased normal human cell surface TCR. In contrast, natural human TCR display remained unaffected after delivery of the humanized MDM2 TCR. These results provide important insights into the molecular basis of TCR gene therapy of malignant disease.

Development of a bifunctional CD1d-anti-HER2 scFv fusion molecule to redirect the iNKT cell-mediated immune response to the tumor site

Abstract : Invariant natural killer T lymphocytes (iNKT) are a unique subpopulation of T lymphocytes recognizing glycolipid antigens in the context of the MHC class I-like molecule CD1d. Upon activation with the high affinity ligand α-galactosylceramide (αGalCer), iNKT cells rapidly produce large amounts of the pro-inflammatory cytokine interferon gamma (IFN-γ) and potently activate cells of the innate and adaptive immune response, such as dendritic cells (DCs), NK and T cells. In this context, iNKT cells have been shown to efficiently mediate antitumor activity, and recent research has focused on the manipulation of these cells for antitumor therapies. However, a major drawback of αGalCer as a free drug is that a single injection of this ligand leads to a short-lived iNKT cell activation followed by a long-term anergy, limiting its therapeutic use. In contrast, we demonstrate here that when αGalCer is loaded on a recombinant soluble CD1d molecule (αGalCer/sCD1d), repeated injections lead to a sustained iNKT and NK cell activation associated with IFN-γ secretion as well as with DC maturation. Most importantly, when the αGalCer/sCD1d is fused to an anti-HER2 scFv antibody fragment, potent inhibition of experimental lung metastasis and established subcutaneous tumors is obtained when systemic treatment is started two to seven days after the injection of HER2-expressing B16 melanoma cells, whereas at this time free αGalCer has no effect. The antitumor activity of the sCD1d-anti-HER2 fusion protein is associated with HER2-specific tumor localization and accumulation of iNKT, NK and T cells at the tumor site. Importantly, active T cell immunization combined with the sCD1d-anti-HER2 treatment leads to the accumulation of antigen-specific CD8 T cells exclusively in HER2-expressing tumors, resulting in potent tumor inhibition. In conclusion, sustained activation and tumor targeting of iNKT cells by recombinant αGalCer/sCD1d molecules thus may promote a combined innate and adaptive immune response at the tumor site that may prove to be effective in cancer immunotherapy. RESUME : Les lymphocytes «invariant Natural Killer T » (iNKT) forment une sous-population particulière de lymphocytes T reconnaissant des antigènes glycolipidiques présentés sur la molécule non-polymorphique CD1d, analogue aux protéines du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I. Après activation avec le ligand de haute affinité α-galactosylceramide (αGalCer), les cellules iNKT produisent des grandes quantités de la cytokine pro-inflammatoire interferon gamma (IFN-γ) et activent les cellules du système immunitaire inné et acquis, telles que les cellules dendritiques (DC), NK et T. En conséquence, on a montré que les cellules iNKT exercent des activités anti-tumorales et la recherche s'est intéressée à la manipulation de ces cellules pour développer des thérapies anti-tumorales. Néanmoins, le désavantage majeur de l'αGalCer, injecté seul, est qu'une seule dose de ce ligand aboutit à une activation des cellules iNKT de courte durée suivie par un état anergique prolongé, limitant l'utilisation thérapeutique de ce glycolipide. En revanche, l'étude présentée ici démontre que, si l'αGalCer est chargé sur des molécules récombinantes soluble CD1d (αGalCer/sCDld), des injections répétées aboutissent à une activation prolongée des cellules iNKT et NK associée avec la sécrétion d'IFN-γ et la maturation des cellules DC. Plus important, si on fusionne la molécule αGalCer/sCD1d avec un fragment single-chain (scFv) de l'anticorps anti-HER2, on observe une importante inhibition de métastases expérimentales aux poumons et de tumeurs sous-cutanées même lorsque le traitement systémique est commencé 2 à 7 jours après la greffe des cellules de mélanome B16 transfectées avec l'antigène HER2. Dans les mêmes conditions le traitement avec l'αGalCer seul est inefficace. L'activité anti-tumorale de la protéine sCDld-anti-HER2 est associée à son accumulation spécifique dans des tumeurs exprimant le HER2 ainsi qu'avec une accumulation des cellules iNKT, NK et T à la tumeur. De plus, une immunisation active combinée avec le traitement sCD1d-anti-HER2 aboutit à une accumulation des lymphocytes T CD8 spécifiques de l'antigène d'immunisation, ceci exclusivement dans des tumeurs qui expriment l'antigène HER2. Cette combinaison résulte dans une activité anti-tumeur accrue. En conclusion, l'activation prolongée des cellules iNKT redirigées à la tumeur par des molécules recombinantes αGalCer/sCDld conduit à l'activation de la réponse innée et adaptative au site tumoral, offrant une nouvelle stratégie prometteuse d'immunothérapie contre le cancer. RESUME POUR UN LARGE PUBLIC : Le cancer est une cause majeure de décès dans le monde. Sur un total de 58 millions de décès enregistrés au niveau mondial en 2005, 7,6 millions (soit 13%) étaient dus au cancer. Les principaux traitements de nombreux cancers sont la chirurgie, en association avec la radiothérapie et la chimiothérapie. Néanmoins, ces traitements nuisent aussi aux cellules normales de notre corps et parfois, ils ne suffisent pas pour éliminer définitivement une tumeur. L'immunothérapie est l'une des nouvelles approches pour la lutte contre le cancer et elle vise à exploiter la spécificité du système immunitaire qui peut distinguer des cellules normales et tumorales. Une cellule exprimant un marqueur tumoral (antigène) peut être reconnue par le système immunitaire humoral (anticorps) et/ou cellulaire, induisant une réponse spécifique contre la tumeur. L'immunothérapie peut s'appuyer alors sur la perfusion d'anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes tumoraux, par exemple les anticorps dirigés contre les protéines oncogéniques Her-2/neu dans le cancer du sein. Ces anticorps ont le grand avantage de spécifiquement se localiser à la tumeur et d'induire la lyse ou d'inhiber la prolifération des cellules tumorales exprimant l'antigène. Aujourd'hui, six anticorps monoclonaux non-conjugés sont approuvés en clinique. Cependant l'efficacité de ces anticorps contre des tumeurs solides reste limitée et les traitements sont souvent combinés avec de la chimiothérapie. L'immunothérapie spécifique peut également être cellulaire et exploiter par immunisation active le développement de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de détruire spécifiquement les cellules malignes. De telles «vaccinations »sont actuellement testées en clinique, mais jusqu'à présent elles n'ont pas abouti aux résultats satisfaisants. Pour obtenir une réponse lymphocytaire T cytotoxique antitumorale, la cellule T doit reconnaître un antigène associé à la tumeur, présenté sous forme de peptide dans un complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CHM I). Cependant les cellules tumorales sont peu efficace dans la présentation d'antigène, car souvent elles se caractérisent par une diminution ou une absence d'expression des molécules d'histocompatibilité de classe I, et expriment peu ou pas de molécules d'adhésion et de cytokines costimulatrices. C'est en partie pourquoi, malgré l'induction de fortes réponses CTL spécifiquement dirigés contre des antigènes tumoraux, les régressions tumorales obtenus grâce à ces vaccinations sont relativement rares. Les lymphocytes «invariant Natural Killer T » (iNKT) forment une sous-population particulière de lymphocytes T reconnaissant des antigènes glycolipidiques présentés sur la molécule non-polymorphique CD1d, analogue aux protéines CMH I. Après activation avec le ligand de haute affinité α-galactosylceramide (αGalCer), les cellules iNKT produisent des grandes quantités de la cytokine pro-inflammatoire interferon gamma (IFN-γ) et activent les cellules du système immunitaire inné et acquis, telles que les cellules dendritiques (DC), NK et T. En conséquence, on a montré que les cellules iNKT exercent des activités anti-tumorales et la recherche s'est intéressée à la manipulation de ces cellules pour développer des thérapies anti-tumorales. Néanmoins, le désavantage majeur de l'αGalCer, injecté seul, est qu'une seule dose de ce ligand aboutit à une activation des cellules iNKT de courte durée suivie par un état anergique prolongé, limitant l'utilisation thérapeutique de ce glycolipide. Notre groupe de recherche a donc eu l'idée de développer une nouvelle approche thérapeutique où la réponse immunitaire des cellules iNKT serait prolongée et redirigée vers la tumeur par des anticorps monoclonaux. Concrètement, nous avons produit des molécules récombinantes soluble CD1d (sCD1d) qui, si elles sont chargés avec l'αGalCer (αGalCer/sCDld), aboutissent à une activation prolongée des cellules iNKT et NK associée avec la sécrétion d'IFN-γ et la maturation des cellules DC. Plus important, si la molécule αGalCer/sCD1d est fusionnée avec un fragment single-chain (scFv) de l'anticorps anti-HER2, la réponse immunitaire est redirigée à la tumeur pour autant que les cellules cancéreuses expriment l'antigène HER2. Les molécules αGalCer/sCDld ainsi présentées activent les lymphocytes iNKT. Avec cette stratégie, on observe une importante inhibition de métastases expérimentales aux poumons et de tumeurs sous-cutanées, même lorsque le traitement systémique est commencé 2 à 7 jours après la greffe des cellules de mélanome B16 transfectées avec l'antigène HER2. Dans les mêmes conditions le traitement avec l'αGalCer seul est inefficace. L'activité anti-tumorale de la protéine sCDld-anti-HER2 est associée à son accumulation spécifique dans des tumeurs exprimant le HER2 ainsi qu'avec une accumulation des cellules iNKT, NK et T à la tumeur. En conclusion, l'activation prolongée des cellules iNKT redirigées à la tumeur par des molécules récombinantes αGalCer/sCD1d conduit à l'activation de la réponse innée et adaptative au site tumoral, offrant une nouvelle stratégie prometteuse d'immunothérapie contre le cancer.

Combined clonotyping and gene signatures of individual tumor-reactive CD8 T-cells define their functional relevance following peptide vaccination in melanoma patients

Novel cancer vaccines are capableto efficiently induce and boost humantumor antigen specific T-cells. However,the properties of these CD8T-cells are only partially characterized.For in depth investigation ofT-cells following Melan-A/MART-1peptide vaccination in melanoma patients,we conducted a detailed prospectivestudy at the single cell level.We first sorted individual human naiveand effector CD8 T-cells from peripheralblood by flow cytometry, andtested a modified RT-PCR protocolincluding a global amplification ofexpressed mRNAs to obtain sufficientcDNAfromsingle cells.We successfullydetected the expression ofseveral specific genes of interest evendown to 106-fold dilution (equivalentto 10-5 cell). We then analyzed tumor-specific effector memory (EM)CD8T-cell subpopulations ex vivo, assingle cells from vaccinated melanomapatients. To elucidate the hallmarksof effective immunity the genesignatures were defined by a panel ofgenes related to effector functions(e.g. IFN-, granzyme B, perforin),and individual clonotypes were identifiedaccording to the expression ofdistinct T-cell receptors (TCR). Usingthis novel single cell analysis approach,we observed that T-cell differentiationis clonotype dependent,with a progressive restriction in TCRBV clonotype diversity from EMCD28pos to EMCD28neg subsets. However,the effector function gene imprintingis clonotype-independent,but dependent on differentiation,since it correlates with the subset oforigin (EMCD28pos or EMCD28neg). We also conducted a detailedcomparative analysis after vaccinationwith natural vs. analog Melan-Apeptide. We found that the peptideused for vaccination determines thefunctional outcome of individualT-cell clonotypes, with native peptideinducing more potent effector functions.Yet, selective clonotypic expansionwith differentiation was preservedregardless of the peptide usedfor vaccination. In summary, the exvivo single cell RT-PCR approach ishighly sensitive and efficient, andrepresents a reliable and powerfultool to refine our current view of molecularprocesses taking place duringT-cell differentiation.

The antimicrobial peptide LL37 is a T-cell autoantigen in psoriasis.

Psoriasis is a common T-cell-mediated skin disease with 2-3% prevalence worldwide. Psoriasis is considered to be an autoimmune disease, but the precise nature of the autoantigens triggering T-cell activation remains poorly understood. Here we find that two-thirds of patients with moderate-to-severe plaque psoriasis harbour CD4(+) and/or CD8(+) T cells specific for LL37, an antimicrobial peptide (AMP) overexpressed in psoriatic skin and reported to trigger activation of innate immune cells. LL37-specific T cells produce IFN-γ, and CD4(+) T cells also produce Th17 cytokines. LL37-specific T cells can infiltrate lesional skin and may be tracked in patients blood by tetramers staining. Presence of circulating LL37-specific T cells correlates significantly with disease activity, suggesting a contribution to disease pathogenesis. Thus, we uncover a role of LL37 as a T-cell autoantigen in psoriasis and provide evidence for a role of AMPs in both innate and adaptive immune cell activation.

BTLA mediates inhibition of human tumor-specific CD8+ T cells that can be partially reversed by vaccination.

The function of antigen-specific CD8+ T cells, which may protect against both infectious and malignant diseases, can be impaired by ligation of their inhibitory receptors, which include CTL-associated protein 4 (CTLA-4) and programmed cell death 1 (PD-1). Recently, B and T lymphocyte attenuator (BTLA) was identified as a novel inhibitory receptor with structural and functional similarities to CTLA-4 and PD-1. BTLA triggering leads to decreased antimicrobial and autoimmune T cell responses in mice, but its functions in humans are largely unknown. Here we have demonstrated that as human viral antigen-specific CD8+ T cells differentiated from naive to effector cells, their surface expression of BTLA was gradually downregulated. In marked contrast, human melanoma tumor antigen-specific effector CD8+ T cells persistently expressed high levels of BTLA in vivo and remained susceptible to functional inhibition by its ligand herpes virus entry mediator (HVEM). Such persistence of BTLA expression was also found in tumor antigen-specific CD8+ T cells from melanoma patients with spontaneous antitumor immune responses and after conventional peptide vaccination. Remarkably, addition of CpG oligodeoxynucleotides to the vaccine formulation led to progressive downregulation of BTLA in vivo and consequent resistance to BTLA-HVEM-mediated inhibition. Thus, BTLA activation inhibits the function of human CD8+ cancer-specific T cells, and appropriate immunotherapy may partially overcome this inhibition.

Regulation of the memory T cell development and islet beta-cell survival by DAPK-related apoptosis-inducing protein kinase 2 (Drak2)

Drak2 est un membre de la famille des protéines associées à la mort et c’est une sérine/thréonine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne présentent aucune défectuosité apparente en apoptose induite par activation, après stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation réduit, comparées aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre étude, l’analyse d’hybridation in situ a révélé que l’expression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie d’une expression plus focale dans les divers organes pendant la période périnatale et l’âge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la médullaire surrénale, l’estomac, la peau et les testicules. Nous avons créé des souris transgéniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularité et leur poids spléniques étaient inférieurs comparé aux souris de type sauvage. Après activation TCR, la réponse proliférative des cellules T Tg Drak2 était normale, même si leur production d’interleukine (IL)-2 et IL-4 mais non d’interféron-r était augmentée. Les cellules T Tg Drak2 activées ont démontré une apoptose significativement accrue en présence d’IL-2 exogène. Au niveau moléculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifesté une augmentation moins élevée des facteurs anti-apoptotiques durant l’activation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnérables aux attaques subséquentes d’IL-2. L’apoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a été associée à un nombre réduit de cellules T ayant le phénotype des cellules mémoires (CD62Llo) et avec des réactions secondaires réprimées des cellules T dans l’hypersensibilité de type différé. Ces résultats démontrent que Drak2 s’exprime dans le compartiment des cellules T mais n’est pas spécifique aux cellules T; et aussi qu’il joue des rôles déterminants dans l’apoptose des cellules T et dans le développement des cellules mémoires T. En outre, nous avons recherché le rôle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabète. L’ARNm et la protéine Drak2 ont été rapidement induits dans les cellules beta de l’îlot après stimulation exogène par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est présente de façon endogène dans le diabète, qu’il soit de type 1 ou de type 2. La régulation positive de Drak2 a été accompagnée d’une apoptose accrue des cellules beta. L’apoptose des cellules beta provoquée par les stimuli en question a été inhibée par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a mené à l’apoptose aggravée des cellules beta déclenchée par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les îlots a compromis l’augmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expériences in vivo ont démontré que les souris Tg Drak2 étaient sujettes au diabète de type 1 dans un modèle de diabète provoqué par de petites doses multiples de streptozotocine et qu’elles étaient aussi sujettes au diabète de type 2 dans un modèle d’obésité induite par la diète. Nos données montrent que Drak2 est défavorable à la survie des cellules beta. Nous avons aussi étudié la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouvé que Drak2 purifiée pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entraîné l’augmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que l’abaissement de Drak2 dans ces cellules a réduit la phosphorylation. Ces recherches mécanistes ont prouvé que p70S6 kinase était véritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette étude a découvert les fonctions importantes de Drak2 dans l’homéostasie des cellules T et le diabète. Nous avons prouvé que p70S6 kinase était un substrat de Drak2. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 à l’intérieur des systèmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rôles de Drak2 dans le développement des cellules mémoires T et la survie des cellules beta pourraient être explorées pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabète.

Étude fonctionnelle et génétique d'une population de lymphocytes T CD4-CD8- impliquée dans la résistance au diabète auto-immun chez la souris

Le diabète auto-immun résulte de la destruction des cellules bêta pancréatiques sécrétrices d’insuline par les lymphocytes T du système immunitaire. Il s’ensuit une déficience hormonale qui peut être comblée par des injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, toutefois il demeure à ce jour impossible de guérir les patients atteints de la maladie. De façon générale, un système immunitaire sain reconnaît une multitude d’antigènes différents et assure ainsi notre défense à l’égard de différents pathogènes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons génétiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent s’activer de façon aberrante suite à la reconnaissance d’antigènes provenant du soi. C’est ce bris de tolérance qui mène au développement de pathologies auto-immunes telles que le diabète auto-immun. Afin de limiter l’auto-immunité, des mécanismes de sélection stricts permettent d’éliminer la majorité des lymphocytes T présentant une forte affinité envers des antigènes du soi lors de leur développement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes réussissent toutefois à échapper à l’apoptose et migrent en périphérie afin d’y circuler en quête d’un antigène spécifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mécanismes périphériques assurent le maintien de la tolérance immunitaire en faisant obstacle à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs. L’une des avenues afin d’inhiber le développement de réponses immunitaires aberrantes est la génération de lymphocytes T régulateurs. Ces cellules, d’origine thymique ou périphérique, peuvent arborer différents phénotypes et agissent via de multiples mécanismes afin d’inactiver et/ou éliminer les cellules impliquées dans l’apparition de pathologies auto-immunes. L’utilisation de modèles murins transgéniques a permis la mise en évidence d’une population peu caractérisée de lymphocytes T au potentiel régulateur. En effet, la proportion de ces cellules T n’exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8 (double négatives, DN) a été inversement corrélée à la prédisposition à l’auto-immunité chez ces ii souris. L’objectif principal de cette thèse est de démontrer la fonction immuno-régulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs génétiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observé que les lymphocytes T DN exercent une activité cytotoxique à l’égard des lymphocytes B de façon spécifique à l’antigène, via la libération de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons établi qu’un unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin d’inhiber le développement du diabète auto-immun chez des hôtes transgéniques prédisposés à la maladie. Le recours à des souris déficientes pour l’expression du gène CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prédisposition au diabète auto-immun Idd13, qui contient le gène Sirp, a été identifié pour son rôle dans la régulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse génétique a révélé que d’autres intervalles génétiques sont impliqués dans le contrôle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situé en région proximale du chromosome 12 a été validé grâce à la création de souris congéniques. Grâce aux résultats présentés dans cette thèse, notre compréhension de la biologie ainsi que de la régulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la création de thérapies cellulaires novatrices permettant de prévenir et de guérir diverses pathologies auto-immunes.

Function of the immunoregulatory CD4-CD8- T cells in the context of autoimmune diabetes

La tolérance immunitaire dépend de la distinction entre le soi et le non soi par le système immunitaire. Un bris dans la tolérance immunitaire mène à l'auto-immunité, qui peut provoquer la destruction des organes, des glandes, des articulations ou du système nerveux central. Le diabète auto-immun, également connu sous le nom diabète juvénile et diabète de type 1, résulte d'une attaque auto-immune sur les cellules β pancréatiques sécrétrices d’insuline, localisées au niveau des îlots de Langerhans du pancréas. Bien que le diabète auto-immun soit traitable par une combinaison d’injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, de régime et d'exercices, beaucoup de complications chroniques peuvent se manifester chez les patients, y compris, mais non limitées à, la cécité, les maladies cardiovasculaires, l’insuffisance rénale et l'amputation. En raison des nombreuses complications liées au diabète auto-immun à long terme, la recherche continue afin de mieux comprendre tous les facteurs impliqués dans la progression de la maladie dans le but de développer de nouvelles thérapies qui empêcheront, renverseront et/ou traiteront cette maladie. Un rôle primordial dans la génération et l'entretien de la tolérance immunitaire a été attribué au nombre et à la fonction des sous-populations de cellules régulatrices. Une de ces populations est constituée de cellules T CD4-CD8- (double négatives, DN), qui ont été étudiées chez la souris et l'humain pour leur contribution à la tolérance périphérique, à la prévention des maladies et pour leur potentiel associé à la thérapie cellulaire. En effet, les cellules de T DN sont d'intérêt thérapeutique parce qu'elles montrent un potentiel immunorégulateur antigène-spécifique dans divers cadres expérimentaux, y compris la prévention du diabète auto-immun. D’ailleurs, en utilisant un système transgénique, nous avons démontré que les souris prédisposées au diabète auto-immun présentent peu de cellules T DN, et que ce phénotype contribue à la susceptibilité au diabète auto-immun. En outre, un transfert des cellules T DN est suffisant pour empêcher la progression vers le diabète chez les souris prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats suggèrent que les cellules T DN puissent présenter un intérêt thérapeutique pour les patients diabétiques. Cependant, nous devons d'abord valider ces résultats en utilisant un modèle non-transgénique, qui est plus physiologiquement comparable à l'humain. L'objectif principal de cette thèse est de définir la fonction immunorégulatrice des cellules T DN, ainsi que le potentiel thérapeutique de celles-ci dans la prévention du diabète auto-immun chez un modèle non-transgénique. Dans cette thèse, on démontre que les souris résistantes au diabète auto-immun présentent une proportion et nombre absolu plus élevés de cellules T DN non-transgéniques, lorsque comparées aux souris susceptibles. Cela confirme une association entre le faible nombre de cellules T DN et la susceptibilité à la maladie. On observe que les cellules T DN éliminent les cellules B activées in vitro par une voie dépendante de la voie perforine et granzyme, où la fonction des cellules T DN est équivalente entre les souris résistantes et prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats confirment que l'association au diabète auto-immun est due à une insuffisance en terme du nombre de cellules T DN, plutôt qu’à une déficience fonctionnelle. On démontre que les cellules T DN non-transgéniques éliminent des cellules B chargées avec des antigènes d'îlots, mais pas des cellules B chargées avec un antigène non reconnu, in vitro. Par ailleurs, on établit que le transfert des cellules T DN activées peut empêcher le développement du diabète auto-immun dans un modèle de souris non-transgénique. De plus, nous observons que les cellules T DN migrent aux îlots pancréatiques, et subissent une activation et une prolifération préférentielles au niveau des ganglions pancréatiques. D'ailleurs, le transfert des cellules T DN entraîne une diminution d'auto-anticorps spécifiques de l'insuline et de cellules B de centres germinatifs directement dans les îlots, ce qui corrèle avec les résultats décrits ci-dessus. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de démontrer la fonction des cellules T DN in vitro et in vivo, ainsi que leur potentiel lié à la thérapie cellulaire pour le diabète auto-immun.

Étude de la différenciation des lymphocytes T CD8+ effecteurs et mémoires : rôle de la cellule présentatrice d’antigène et de la voie de signalisation Notch

Lors d’une infection par un pathogène, des lymphocytes T CD8+ naïfs (LTn) spécifiques de l’antigène sont activés, prolifèrent et se différencient en LT effecteurs (LTe). Les LTe produisent différentes cytokines et acquièrent une activité cytotoxique menant à l’élimination du pathogène. Seulement 5 à 10 % des LTe survivront et se différencieront en LT mémoires (LTm), qui sont capables de répondre plus rapidement lors d’une seconde infection par le même pathogène, contribuant au succès de la vaccination. Toutefois, la compréhension de l’ensemble des mécanismes régulant le développement des LTe et des LTm demeure incomplète. Afin de mieux comprendre les signaux requis pour la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immune, nous avons posé deux hypothèses. Nous avons d’abord proposé que différentes cellules présentatrices d’antigène (CPA) fournissent différents signaux au moment de la reconnaissance antigénique influençant ainsi le devenir des LT CD8+. Vu leur potentiel d’utilisation en immunothérapie, nous avons comparé la capacité d’activation des LT CD8+ par les lymphocytes B activés via le CD40 (CD40-B) et les cellules dendritiques (CD). Nous avons montré que l’immunisation avec des CD40-B induit une réponse effectrice mais, contrairement à l’immunisation avec des CD, pratiquement aucun LTm n’est généré. Les LTe générés sont fonctionnels puisqu’ils sécrètent des cytokines, ont une activité cytotoxique et contrôlent une infection avec Listeria monocytogenes (Lm). Nous proposons qu’une sécrétion plus faible de cytokines par les CD40 B ainsi qu’une interaction plus courte et moins intime avec les LT CD8+ comparativement aux CD contribuent au défaut de différenciation des LTm observé lors de la vaccination avec les CD40-B. Ensuite, nous posé l’hypothèse que, parmi les signaux fournis par les CPA au moment de la reconnaissance antigénique, la voie de signalisation Notch influence le développement des LTe, mais aussi des LTm CD8+ en instaurant un programme génétique particulier. D’abord, grâce à un système in vitro, le rôle de la signalisation Notch dans les moments précoces suivant l’activation du LT CD8+ a été étudié. Ce système nous a permis de démontrer que la voie de signalisation Notch régule directement l’expression de la molécule PD-1. Ensuite, grâce à des souris où il y a délétion des récepteurs Notch1 et Notch2 seulement chez les LT CD8+ matures, un rôle de la voie de signalisation Notch dans la réponse immune des LT CD8+ a été démontré. Nos résultats démontrent que suite à une infection avec Lm ou à une immunisation avec des CD, la signalisation Notch favorise le développement de LTe, exprimant fortement KLRG1 et faiblement CD127, destinés à mourir par apoptose. Toutefois, la signalisation Notch n’a pas influencé la génération de LTm. De façon très intéressante, l’expression des récepteurs Notch influence la production d’IFN- en fonction du contexte d’activation. En effet, suite à une infection avec Lm, l’absence des récepteurs Notch n’affecte pas la production d’IFN- par les LTe, alors qu’elle est diminuée suite à une immunisation avec des CD suggérant un rôle dépendant du contexte pour la voie de signalisation Notch. Nos résultats permettent une meilleure compréhension des signaux fournis par les différentes CPA et de la voie de signalisation Notch, donc des mécanismes moléculaires régulant la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immunitaire, ce qui pourrait ultimement permettre d’améliorer les stratégies de vaccination.