(E)-2-Nonenal determination in brazilian beers using headspace solid-phase microextraction and gas chromatographic coupled mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS)

(E)-2-nonenal is considered an important off-flavor of beer, related to the flavor of beer staling. In this study, a new method for determination of (E)-2-nonenal in beer using headspace solid-phase microextraction and gas chromatographic coupled mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS) was developed and applied in Brazilian beer samples. The extractions were carried out in CAR-PDMS (carboxen-polydimethylsiloxane) fiber and the best results were found with 15 minutes of equilibrium and 90 minutes of extraction at 50 °C. The method was linear in the range from 0.02 to 4.0 μg.L-1 with correlation coefficient of 0.9994. The limits of detection and quantification were 0.01 and 0.02 μg.L-1, respectively. 96.5% of recovery and 4% precision (RSD) were obtained in the fortification of beer samples with 2.0 μg.L-1 of (E)-2-nonenal. The developed method proved to be simple, efficient and highly sensitive to the determination of this analyte being easily applied in the quality control of the brewery. (E)-2-nonenal was found in all beer samples analyzed with levels between 0.17 and 0.42 μg.L-1.

Development and validation of a method for detection and quantification of ochratoxin A in green coffee using liquid chromatography coupled to mass spectrometry

A method using Liquid Chromatography Tanden Mass Spectrometry (LC-MS/MS) with matrix-matched calibration curve was developed and validated for determining ochratoxin A (OTA) in green coffee. Linearity was found between 3.0 and 23.0 ng.g-1. Mean recoveries ranged between 90.45% and 108.81%; the relative standard deviation under repeatability and intermediate precision conditions ranged from 5.39% to 9.94% and from 2.20% to 14.34%, respectively. The limits of detection and quantification were 1.2 ng.g-1 and 3.0 ng.g-¹, respectively. The method developed was suitable and contributed to the field of mycotoxin analysis, and it will be used for future production of the Certified Reference Material (CRM) for OTA in coffee.

Construction of a supercritical fluid extraction (SFE) equipment: validation using annatto and fennel and extract analysis by thin layer chromatography coupled to image

Abstract The present work describes setting up a laboratory unit for supercritical fluid extraction. In addition to its construction, a survey of cost was done to compare the cost of the homemade unit with that of commercial units. The equipment was validated using an extraction of annatto seeds’ oil, and the extraction and fractionation of fennel oil were used to validate the two separators; for both systems, the solvent was carbon dioxide. The chemical profiles of annatto and fennel extracts were assessed using thin layer chromatography; the images of the chromatographic plates were processed using the free ImageJ software. The cost survey showed that the homemade equipment has a very low cost (~US$ 16,000) compared to commercial equipment. The extraction curves of annatto were similar to those obtained in the literature (yield of 3.8% oil). The separators were validated, producing both a 2.5% fraction of fennel seed extract rich in essential oils and another extract fraction composed mainly of oleoresins. The ImageJ software proved to be a low-cost tool for obtaining an initial evaluation of the chemical profile of the extracts.

Continuous hydride generation in the presence of L- cysteine for the determination of arsenic, bismuth, antimony and tin in steels by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry

Arsenic, bismuth, germanium, antimony and tin were simultaneously determined by continuous hydride generation and inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry . I Hydrides were introduced into four different types of gas-liquid separators. Two of the gas-liquid separators were available in-house. A third was developed for this project and a fourth was based on a design used by CET AC. The best signal intensity was achieved by the type II frit-based gas-liquid separator, but the modified Cetac design gave promise for the future, due to low relative standard deviation. A method was developed for the determination of arsenic, bismuth, antimony and tin in low-alloy steels. Four standard reference materials from NIST were dissolved in 10 mL aqua regia without heat. Good agreement was obtained between experimental values and certified values for arsenic, bismuth, antimony and tin. The method was developed to provide the analyst with the opportunity to determine the analytes by using simple aqueous standards to prepare calibration lines. Within the limits of the samples analyzed, the method developed is independent of matrix.

Development and characterization of concentric capillary nebulizer used in inductively coupled plasma analysis /

A simple, low-cost concentric capillary nebulizer (CCN) was developed and evaluated for ICP spectrometry. The CCN could be operated at sample uptake rates of 0.050-1.00 ml min'^ and under oscillating and non-oscillating conditions. Aerosol characteristics for the CCN were studied using a laser Fraunhofter diffraction analyzer. Solvent transport efficiencies and transport rates, detection limits, and short- and long-term stabilities were evaluated for the CCN with a modified cyclonic spray chamber at different sample uptake rates. The Mg II (280.2nm)/l\/lg 1(285.2nm) ratio was used for matrix effect studies. Results were compared to those with conventional nebulizers, a cross-flow nebulizer with a Scott-type spray chamber, a GemCone nebulizer with a cyclonic spray chamber, and a Meinhard TR-30-K3 concentric nebulizer with a cyclonic spray chamber. Transport efficiencies of up to 57% were obtained for the CCN. For the elements tested, short- and long-term precisions and detection limits obtained with the CCN at 0.050-0.500 ml min'^ are similar to, or better than, those obtained on the same instrument using the conventional nebulizers (at 1.0 ml min'^). The depressive and enhancement effects of easily ionizable element Na, sulfuric acid, and dodecylamine surfactant on analyte signals with the CCN are similar to, or better than, those obtained with the conventional nebulizers. However, capillary clog was observed when the sample solution with high dissolved solids was nebulized for more than 40 min. The effects of data acquisition and data processing on detection limits were studied using inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry. The study examined the effects of different detection limit approaches, the effects of data integration modes, the effects of regression modes, the effects of the standard concentration range and the number of standards, the effects of sample uptake rate, and the effect of Integration time. All the experiments followed the same protocols. Three detection limit approaches were examined, lUPAC method, the residual standard deviation (RSD), and the signal-to-background ratio and relative standard deviation of the background (SBR-RSDB). The study demonstrated that the different approaches, the integration modes, the regression methods, and the sample uptake rates can have an effect on detection limits. The study also showed that the different approaches give different detection limits and some methods (for example, RSD) are susceptible to the quality of calibration curves. Multicomponents spectral fitting (MSF) gave the best results among these three integration modes, peak height, peak area, and MSF. Weighted least squares method showed the ability to obtain better quality calibration curves. Although an effect of the number of standards on detection limits was not observed, multiple standards are recommended because they provide more reliable calibration curves. An increase of sample uptake rate and integration time could improve detection limits. However, an improvement with increased integration time on detection limits was not observed because the auto integration mode was used.

Application of thermal ion-molecule reactions in tackling spectroscopic inferences in inductively coupled plasma mass spectrometry

Part I: Ultra-trace determination of vanadium in lake sediments: a performance comparison using O2, N20, and NH3 as reaction gases in ICP-DRC-MS Thermal ion-molecule reactions, targeting removal of specific spectroscopic interference problems, have become a powerful tool for method development in quadrupole based inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) applications. A study was conducted to develop an accurate method for the determination of vanadium in lake sediment samples by ICP-MS, coupled with a dynamic reaction cell (DRC), using two differenvchemical resolution strategies: a) direct removal of interfering C10+ and b) vanadium oxidation to VO+. The performance of three reaction gases that are suitable for handling vanadium interference in the dynamic reaction cell was systematically studied and evaluated: ammonia for C10+ removal and oxygen and nitrous oxide for oxidation. Although it was able to produce comparable results for vanadium to those using oxygen and nitrous oxide, NH3 did not completely eliminate a matrix effect, caused by the presence of chloride, and required large scale dilutions (and a concomitant increase in variance) when the sample and/or the digestion medium contained large amounts of chloride. Among the three candidate reaction gases at their optimized Eonditions, creation of VO+ with oxygen gas delivered the best analyte sensitivity and the lowest detection limit (2.7 ng L-1). Vanadium results obtained from fourteen lake sediment samples and a certified reference material (CRM031-040-1), using two different analytelinterference separation strategies, suggested that the vanadium mono-oxidation offers advantageous performance over the conventional method using NH3 for ultra-trace vanadium determination by ICP-DRC-MS and can be readily employed in relevant environmental chemistry applications that deal with ultra-trace contaminants.Part II: Validation of a modified oxidation approach for the quantification of total arsenic and selenium in complex environmental matrices Spectroscopic interference problems of arsenic and selenium in ICP-MS practices were investigated in detail. Preliminary literature review suggested that oxygen could serve as an effective candidate reaction gas for analysis of the two elements in dynamic reaction cell coupled ICP-MS. An accurate method was developed for the determination of As and Se in complex environmental samples, based on a series of modifications on an oxidation approach for As and Se previously reported. Rhodium was used as internal standard in this study to help minimize non-spectral interferences such as instrumental drift. Using an oxygen gas flow slightly higher than 0.5 mL min-I, arsenic is converted to 75 AS160+ ion in an efficient manner whereas a potentially interfering ion, 91Zr+, is completely removed. Instead of using the most abundant Se isotope, 80Se, selenium was determined by a second most abundant isotope, 78Se, in the form of 78Se160. Upon careful selection of oxygen gas flow rate and optimization ofRPq value, previous isobaric threats caused by Zr and Mo were reduced to background levels whereas another potential atomic isobar, 96Ru+, became completely harmless to the new selenium analyte. The new method underwent a strict validation procedure where the recovery of a suitable certified reference material was examined and the obtained sample data were compared with those produced by a credible external laboratory who analyzed the same set of samples using a standardized HG-ICP-AES method. The validation results were satisfactory. The resultant limits of detection for arsenic and selenium were 5 ng L-1 and 60 ng L-1, respectively.

Methoxypyrazine removal in grape juice: Development of a removal system using odorant and pheromone binding proteins coupled with bentonite fining

Multicoloured Asian Lady Beetles (MALB) and 7-spot Lady Beetles that infect vineyards can secrete alkyl-methoxypyrazines when they are processed with the grapes, resulting in wines containing a taint. The main methoxypyrazine associated with this taint is 3-isopropyl-2-methoxypyrazine (IPMP). The wines are described as having aroma and flavours of peanut butter, peanut shells, asparagus and earthy which collectively, have become known as “ladybug taint”. To date, there are no known fining agents used commercially added to juice or wine that are effective in removing this taint. The goal of this project was to use previously identified proteins with an ability to bind to methoxypyrazines at low pH, and subsequently develop a binding assay to test the ability of these proteins to bind to and remove methoxypyrazines from grape juice. The piglet odorant binding protein (plOBP) and mouse major urinary protein (mMUP) were identified, cloned and expressed in the Pichia pastoris expression system. Protein expression was induced using methanol and the proteins were subsequently purified from the induction media using anion exchange chromatography. The purified proteins were freeze-dried and rehydrated prior to use in the methoxypyrazine removal assay. The expression and purification system resulted in yields of approximately 78% of purified plOBP and 62% of purified mMUP from expression to rehydration. Purified protein values were 87 mg of purified plOPB per litre of induction media and 19 mg of purified mMUP per litre of induction medium. In order to test the ability of the protein to bind to the MPs, an MP removal assay was developed. In the assay, the purified protein is incubated with either IPMP or 3-isobutyl-2-methoxypyrazine (IBMP) for two hours in either buffer or grape juice. Bentonite is then used to capture the protein-MP complex and the bentonite-protein-MP complex is then removed from solution by filtration. Residual MP is measured in solution following the MP removal assay and compared to that in the starting solution by Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC/MS). GC/MS results indicated that the mMUP was capable of removing IBMP and IPMP from 300 ng/L in buffer pH 4.0, buffer pH 3.5 and Riesling Juice pH 3.5 down to the limit of quantification of the instrument, which is 6ng/L and 2ng/L for IBMP and IPMP, respectively. The results for the plOBP showed that although it could remove some IBMP, it was only approximately 50-70 ng/L more than bentonite treatment followed by filtration, resulting in approximately 100 ng/L of the MPs being left in solution. pIOBP was not able to remove IPMP in buffer pH 3.5 using this system above that removed by bentonite alone. As well, the pIOBP was not able to remove any additional MPs from Chardonnay juice pH 3.5 above that already removed by the bentonite and filtration alone. The mouse MUP was shown to be a better candidate protein for removal of MPs from juice using this system.

Influence of timing of milk consumption coupled with endurance training on body composition and endurance training adaptations in humans.

Consumption of low-fat milk (LFM) after resistance training has been shown to have positive influences on body composition and training adaptations; however, little research has examined the effects of LFM consumption following endurance training. The purpose of the study was to look at the effects of combining additional servings of LFM following endurance exercise on body composition, bone health, and training adaptations. 40 healthy males were recruited. Individuals were randomized into 4 groups – DEI (750mL LFM immediately post exercise), DEA (750mL LFM 4 hrs prior to or 6 hrs post exercise), CEI (750mL carbohydrate beverage immediately post-exercise), and CEA (750mL carbohydrate beverage immediately post-exercise). Participants took part in a 12-week endurance training intervention (1 h/day, 3 d/wk, ~60% max HR). 22 participants completed the study. Analysis showed significant increases in lean mass, spinal bone mineral content, relative VO2peak, and a decrease in Trap 5β across all groups (p < 0.05).

Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation du développement des circuits d’interneurones GABAergiques dans le néocortex : rôle de la molécule d’adhésion cellulaire neurale (NCAM)

Les interneurones GABAergiques constituent une population mineure de cellules par rapport aux neurones glutamatergiques dans le néocortex. Cependant ils contrôlent fortement l'excitabilité neuronale, la dynamique des réseaux neuronaux et la plasticité synaptique. L'importance des circuits GABAergiques dans le processus fonctionnel et la plasticité des réseaux corticaux est soulignée par des résultats récents qui montrent que des modifications très précises et fiables des circuits GABAergiques sont associées à divers troubles du développement neurologique et à des défauts dans les fonctions cérébrales. De ce fait, la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliquant le développement des circuits GABAergiques est la première étape vers une meilleure compréhension de la façon dont les anomalies de ces processus peuvent se produire. La molécule d’adhésion cellulaire neurale (NCAM) appartient à la super-famille des immunoglobulines de reconnaissance cellulaire et est impliquée dans des interactions homophiliques et hétérophiliques avec d’autres molécules. Même si plusieurs rôles de NCAM ont été démontrés dans la croissance neuronale, la fasciculation axonale, la formation et la maturation de synapses, de même que dans la plasticité cellulaire de plusieurs systèmes, le rôle de NCAM dans la formation des synapses GABAergiques reste inconnu. Ce projet visait donc à déterminer le rôle précis de NCAM dans le processus de maturation des synapses GABAergiques dans le néocortex, en modulant son expression à différentes étapes du développement. L’approche choisie a été de supprimer NCAM dans des cellules GABAergiques à paniers avant la maturation des synapses (EP12-18), pendant la maturation (EP16-24), ou durant le maintien de celles-ci (EP24-32). Les méthodes utilisées ont été le clonage moléculaire, l’imagerie confocale, la culture de coupes organotypiques et des techniques morphométriques de quantification de l’innervation GABAergique. Nos résultats montrent que l’inactivation de NCAM durant la phase de maturation des synapses périsomatiques (EP16-24) cause une réduction du nombre de synapses GABAergiques périsomatiques et du branchement de ces axones. En revanche, durant la phase de maintien (EP26-32), l’inactivation de NCAM n’a pas affecté ces paramètres des synapses GABAergiques. Or, il existe trois isoformes de NCAM (NCAM120, 140 et 180) qui pourraient jouer des rôles différents dans les divers types cellulaires ou à des stades développementaux différents. Nos données montrent que NCAM120 et 140 sont nécessaires à la maturation des synapses périsomatiques GABAergiques. Cependant, NCAM180, qui est l’isoforme la plus étudiée et caractérisée, ne semble pas être impliquée dans ce processus. De plus, l’inactivation de NCAM n’a pas affecté la densité des épines dendritiques ou leur longueur. Elle est donc spécifique aux synapses périsomatiques GABAeriques. Finalement, nos résultats suggèrent que le domaine conservé C-terminal KENESKA est essentiel à la maturation des synapses périsomatiques GABAergiques. Des expériences futures nous aiderons à mieux comprendre la mécanistique et les différentes voies de signalisation impliquées.

Dynamique spatio-temporelle de circuits de réentrée chez le sujet humain et dans un modèle d'infarctus du myocarde chez le chien

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Bounding of switching activity in logic circuits

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Investigation des circuits neuronaux de la lecture à l’aide de la spectroscopie près du spectre de l’infrarouge

Pour la plupart des gens, la lecture est une activité automatique, inhérente à leur vie quotidienne et ne demandant que peu d’effort. Chez les individus souffrant d’épilepsie réflexe à la lecture, le simple fait de lire déclenche des crises épileptiques et les personnes doivent alors renoncer à la lecture. Les facteurs responsables du déclenchement de l’activité épileptique dans l’épilepsie réflexe à la lecture demeurent encore mal définis. Certains auteurs suggèrent que le nombre ainsi que la localisation des pointes épileptiques seraient en lien avec la voie de lecture impliquée. Des études en imagerie cérébrale, menées auprès de populations sans trouble neurologique, ont dévoilé que la lecture active un réseau étendu incluant les cortex frontaux, temporo-pariétaux et occipito-temporaux bilatéralement avec des différences dans les patrons d’activation pour les voies de lecture lexicale et phonologique. La majorité des études ont eu recours à des tâches de lecture silencieuse qui ne permettent pas d'évaluer la performance des participants. Dans la première étude de cette thèse, qui porte sur une étude de cas d'un patient avec épilepsie réflexe à la lecture, nous avons déterminé les tâches langagières et les caractéristiques des stimuli qui influencent l'activité épileptique. Les résultats ont confirmé que la lecture était la principale tâche responsable du déclenchement de l’activité épileptique chez ce patient. En particulier, la fréquence des pointes épileptiques était significativement plus élevée lorsque le patient avait recours au processus de conversion grapho-phonémique. Les enregistrements électroencéphalographiques (EEG) ont révélé que les pointes épileptiques étaient localisées dans le gyrus précentral gauche, indépendamment de la voie de lecture. La seconde étude avait comme objectif de valider un protocole de lecture à voix haute ayant recours à la spectroscopie près du spectre de l’infrarouge (SPIR) pour investiguer les circuits neuronaux qui sous-tendent la lecture chez les normo-lecteurs. Douze participants neurologiquement sains ont lu à voix haute des mots irréguliers et des non-mots lors d’enregistrements en SPIR. Les résultats ont montré que la lecture des deux types de stimuli impliquait des régions cérébrales bilatérales communes incluant le gyrus frontal inférieur, le gyrus prémoteur et moteur, le cortex somatosensoriel associatif, le gyrus temporal moyen et supérieur, le gyrus supramarginal, le gyrus angulaire et le cortex visuel. Les concentrations totales d’hémoglobine (HbT) dans les gyri frontaux inférieurs bilatéraux étaient plus élevées dans la lecture des non-mots que dans celle des mots irréguliers. Ce résultat suggère que le gyrus frontal inférieur joue un rôle dans la conversion grapho-phonémique, qui caractérise la voie de lecture phonologique. Cette étude a confirmé le potentiel de la SPIR pour l’investigation des corrélats neuronaux des deux voies de lecture. Une des retombées importantes de cette thèse consiste en l’utilisation du protocole de lecture en SPIR pour investiguer les troubles de la lecture. Ces investigations pourraient aider à mieux établir les liens entre le fonctionnement cérébral et la lecture dans les dyslexies développementales et acquises.

Effect of levodopa on cortico-striatal and cortico-cerebellar circuits in Parkinson's disease

La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus commune. Les symptômes principalement observés chez les patients atteints de la MP sont la rigidité, les tremblements, la bradykinésie et une instabilité posturale. Leur sévérité est souvent asymétrique. La cause principale de ces symptômes moteurs est la dégénérescence du circuit dopaminergique nigro-striatal qui mène à un débalancement d’activité du circuit cortico-striatal. Ce débalancement de circuits est le point essentiel de cette thèse. Dans les protocoles de recherche décrits ici, des patients atteints de la MP (avant et après une dose de levodopa) et des participants contrôles sains ont effectué des mouvements auto-initiés ou en réponse à des stimulis externes pendant que l’on mesurait leur activité cérébrale en imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf). Dans cette thèse, nous abordons et mettons en évidence quatre (4) points principaux. En première partie (chapitre 2), nous présentons un recensement de la littérature sur les cicruits cortico-striataux et cortico-cérébelleux dans la MP. En utilisant des méthodes de neuroimagerie, des changements d’activité cérébrale et cérébelleuse ont été observés chez les patients atteints de la MP comparés aux participants sains. Même si les augmentations d’activité du cervelet ont souvent été attribuées à des mécanismes compensatoires, nos résultats suggèrent qu’elles sont plus probablement liées aux changements pathophysiologiques de la MP et à la perturbation du circuit cortico-cérébelleux. En général, nous suggérons (1) que le circuit cortico-cérébelleux est perturbé chez les patients atteints de la MP, et que les changements d’activité du cervelet sont liés à la pathophysiologie de la MP plutôt qu’à des mécanismes compensatoires. En deuxième partie (chapitre 3), nous discutons des effets de la levodopa sur les hausses et baisses d’activité observés chez les patients atteints de la MP, ainsi que sur l’activité du putamen pendant les mouvements d’origine interne et externe. De nombreuses études en neuroimagerie ont montré une baisse d’activité (hypo-activité) préfrontale liée à la déplétion de dopamine. En revanche, l’utilisation de tâches cognitives a montré des augmentations d’activité (hyper-activité) corticale chez les patients atteints de la MP comparés aux participants sains. Nous avons suggéré précédemment que ces hypo- et hyper-activités des régions préfrontales dépendent de l’implication du striatum. Dans cette thèse nous suggérons de plus (2) que la levodopa ne rétablit pas ces hyper-activations, mais plutôt qu’elles sont liées à la perturbation du circuit méso-cortical, et aussi possiblement associées à l’administration de médication dopaminergique à long terme. Nous montrons aussi (3) que la levodopa a un effet non-spécifique à la tâche sur l’activité du circuit cortico-striatal moteur, et qu’elle n’a pas d’effet sur l’activité du circuit cortico-striatal cognitif. Nous montrons enfin (chapitre 4) que la levodopa a un effet asymétrique sur les mouvements de la main droite et gauche. À peu près 50% des patients atteints de la MP démontrent une asymétrie des symptômes moteurs, et ceci persiste à travers la durée de la maladie. Nos résultats suggèrent (4) que la levodopa pourrait avoir un plus grand effet sur les patrons d’activations des mouvements de la main la plus affectée.

Étude du système dopaminergique pré- et postsynaptique : régulation de l'autorécepteur D2 par la neurotensine et formation des synapses excitatrices dans le striatum

La dopamine (DA) est un neurotransmetteur impliqué dans la modulation de fonctions essentielles du cerveau telles que le contrôle des mouvements volontaires, le système de récompense et certains aspects de la cognition. Depuis sa découverte, la DA a attiré énormément d'attention scientifique en partie à cause des pathologies majeures associées aux dysfonctions du système DAergique, comme la maladie de Parkinson, la schizophrénie et la toxicomanie. On retrouve la majorité des neurones qui synthétisent la DA au niveau du mésencéphale ventral, dans les noyaux de la substance noire compacte (SNc) et de l'aire tegmentaire ventrale (ATV). Ces neurones projettent leurs axones dans un très dense réseau de fibres qui s'organisent en trois voies DAergiques classiques: la voie nigrostriée, la voie mésolimbique et la voie mésocorticale. La transmission DAergique s'effectue par l'activation de récepteurs de la DA qui font partie de la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs). Les récepteurs de la DA sont abondamment exprimés aussi bien par les neurones DAergiques que par les neurones des régions cibles, ce qui implique que la compréhension de la signalisation et des fonctions particulières des récepteurs de la DA pré- et postsynaptiques représente un enjeu crucial dans l'étude du système DAergique. Cette thèse de doctorat se sépare donc en deux volets distincts: le premier s'intéresse à la régulation du récepteur D2 présynaptique par la neurotensine (NT), un neuropeptide intimement lié à la modulation du système DAergique; le deuxième s'intéresse au côté postsynaptique du système DAergique, plus particulièrement à la ségrégation de l'expression des récepteurs de la DA dans le striatum et aux fonctions de ces récepteurs dans l'établissement des circuits neuronaux excitateurs prenant place dans cette région. Dans la première partie de cette thèse, nous démontrons que l'activation du récepteur à haute affinité de la NT, le NTR1, provoque une internalisation hétérologue du récepteur D2, avec une amplitude et une cinétique différente selon l'isoforme D2 observé. Cette internalisation hétérologue dépend de la protéine kinase C (PKC), et nous montrons que la surexpression d'un récepteur D2 muté sur des sites de phosphorylation par la PKC ii ainsi que l'inhibition de l'expression de β-arrestine1 par ARNs interférents dans des neurones DAergiques bloquent complètement l'interaction fonctionnelle entre le NTR1 et le D2. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous démontrons d'abord que la ségrégation de l'expression des récepteurs D1 et D2 dans le striatum est déjà bien établie dès le 18e jour embryonnaire, bien qu'elle progresse encore significativement aux jours 0 et 14 postnataux. Nos résultats témoignent aussi d'un maintien complet de cette ségrégation lorsque les neurones striataux sont mis en culture aussi bien en présence ou en absence de neurones corticaux et/ou mésencéphaliques. Ensuite, nous montrons que la présence de neurones mésencéphaliques stimule la formation d’épines et de synapses excitatrices sur les neurones striataux épineux exprimant le récepteur D2 (MSN-D2). Le co-phénotype glutamatergique des neurones dopaminergiques semble nécessaire à une grande partie de cet effet. Par ailleurs, le nombre total de terminaisons excitatrices formées sur les MSN-D2 par les neurones corticaux et mésencéphaliques apparaît être régit par un équilibre dynamique. Finalement, nous démontrons que le blocage de la signalisation des récepteurs D1 et D2 de la DA n'est pas nécessaire pour la formation des synapses excitatrices des MSN-D2, alors que l'antagonisme des récepteurs glutamatergiques ionotropes diminue la densité d'épines dendritiques et contrôle de façon opposée le nombre de terminaisons excitatrices corticales et mésencéphaliques. Globalement, ce travail représente une contribution significative pour une meilleure compréhension du fonctionnement normal du système DAergique. Ces découvertes sont susceptibles d’être utiles pour mieux comprendre les dysfonctions de ce système dans le cadre de pathologies du cerveau comme la maladie de Parkinson.

Use of cellular impedance to characterize ligand functional selectivity at G protein-coupled receptors

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) représentent la plus grande famille de cibles thérapeutiques pour le traitement d’une panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs décennies de recherche aient permis de façonner nos connaissances sur ces protéines membranaires, notre compréhension des déterminants moléculaires de leur activité signalétique reste encore limitée. De ces domaines de recherche, une avancée récente a mis à jour un nouveau phénomène, appelé sélectivité fonctionnelle des ligands, qui a bouleversé les paradigmes décrivant leu fonctionnement de ces récepteurs. Ce concept émane d’observations montrant que l’activité pharmacologique de certains ligands n’est pas nécessairement conservée sur tout le répertoire signalétiques connu du récepteur et peu se restreindre à l'activation sélective d’un sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modèle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilités pour la découverte de médicaments plus efficace et sûr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molécules modulant spécifiquement les voies signalétiques d’intérêt thérapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener à des effets secondaires indésirables ou de la tolérance. Cette thèse décrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, basée sur la mesure du changement l'impédance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, l’adhésion et/ou la redistribution des macromolécules, cette approche permet de mesurer de façon simultanée l'activité de plusieurs voies de signalisation impliqués dans ces réponses. Utilisant le récepteur β2-adrénergique (β2AR) comme modèle, nous avons démontré que les variations dans l’impédance cellulaire étaient directement liées à l’activation de multiples voies de signalisation suite à la stimulation du récepteur par son ligand. L’agoniste type du β2AR, l’isoprotérénol, s’est avéré induire une réponse d’impédance dose-dépendante constituée, dans le temps, de plusieurs caractéristiques distinctes pouvant être bloquées de façon compétitive par l’antagoniste ICI118,551 Par l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs, nous avons été en mesure de déterminer la contribution de plusieurs voies signalétiques canoniques, comme les voies dépendantes de Gs et Gi, la production d’AMPc et l’activation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la réponse d’impédance a permis d’identifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant à la réponse globale des changements initiés par la stimulation du β2AR. Dans une autre étude, nous avons rapporté que la réponse calcique induite par le β2AR serait attribuable à une transactivation Gs-dépendant du récepteur purinergique P2Y11, lui-même couplé à la protéine Gq. La mesure d’impédance permettant de distinguer et de décrire une pléiade d’activités signalétiques, nous avons émis l’hypothèse que des ligands arborant des profils signalétiques différents généreraient des réponses d’impédance distinctes. Le criblage d’une librairie de ligands spécifiques au β2AR a révélé une grande variété de signatures d’impédance. Grâce au développement d’une approche computationnelle innovatrice, nous avons été en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composés, un regroupement qui s’est avéré hautement corrélé avec le profil signalétique des différents ligands. Nous avons ensuite combiné le criblage de composés par impédance avec l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de voies signalétiques afin d’augmenter la résolution du regroupement. En évaluant l’impact d’une voie signalétique donnée sur la signature d’impédance, nous avons été en mesure de révéler une plus grande variété de textures parmi les ligands. De plus, cette méthode s’est avérée efficace pour prédire le profil signalétique d’une librairie de composés non caractérisés, ciblant le β2AR. Ces travaux ont mené à l’élaboration d’une méthode permettant d’exprimer visuellement la sélectivité fonctionnelle de ligands et ont révélé de nouvelles classes de composés pour ce récepteur. Ces nouvelles classes de composés ont ensuite été testées sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composés regroupés dans différentes classes produisent des effets distincts sur la contractilité de ces cellules. Globalement, ces travaux démontrent la pertinence de l’utilisation de l’impédance cellulaire pour une évaluation précise des différences fonctionnelles parmi les composés ciblant les RCPGs. En fournissant une représentation pluridimensionnelle de la signalisation émanant des RCPGs à l’aide d’un seul essai ne requérant pas de marquage, les signatures d’impédance représentent une stratégie simple et innovante pour l’évaluation de la fonctionnalité sélective des ligands. Cette méthode pourrait être d’une grande utilité dans le processus de découverte de nouveaux médicaments.