Thomsen-Friedenreich antigens in bladder cancer: evaluation of their prognostic value

RESUMO: Introdução. O cancro de bexiga é uma patologia comum que representa o 6° e o 5° cancro mais incidente em Portugal e na Itália, respetivamente. Em mais de metade dos casos ocorre reincidência durante o primeiro ano, requerendo acompanhamento clínico ao longo da vida. A instilação intravesical de Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (uma estirpe atenuada do Mycobacterium bovis) representa uma imunoterapia eficaz no combate ao cancro de bexiga, no entanto, muitos aspetos da interação de BCG com as células tumorais bem como com as células do sistema imunitário permanecem por desvendar. As células tumorais de bexiga expressam frequentemente as formas sialiladas dos antigénios de Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). Contudo ainda se desconhece o significado da sua expressão na malignidade tumoral e se afeta a eficácia da terapêutica BCG. Objetivo do estudo. Investigar o papel dos antigénios sT e sTn no fenótipo maligno de células de cancro de bexiga bem como na resposta mediada pelo sistema imunitário à terapia com BCG. Metodologia. Para tal, foram utilizadas as linhas celulares de cancro da bexiga HT1376 e MCR, geneticamente modificadas por transdução com vetores codificantes para as sialiltransferases ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, de forma a expressar homogeneamente os antigénios sT ou sTn respetivamente. Estes modelos celulares foram estudados após confronto com BCG. O nível de BCG internalizado foi avaliado por citometria de fluxo. O perfil global de expressão genética dos modelos celulares antes e após incubação com BCG foi analisado pela tecnologia de microarray. O perfil de citocinas secretadas pelos modelos celulares após incubação com BCG, bem como de macrófagos estimulados pelo secretoma de células de cancro de bexiga que por sua vez foram estimuladas previamente por BCG, foi estudado pelo sistema multiplex de “imuno-esferas”. Resultados. A análise do transcritoma dos modelos celulares revelou que grupos de genes envolvidos em funções específicas foram modulados em paralelo nos dois modelos celulares, após transdução, independentemente da sialiltransferase expressa. Ou seja, em células que expressavam a sialiltransferase ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, os genes envolvidos na regulação da segregação cromossómica e na reparação do DNA foram consistentemente regulados negativamente. Genes descritos na literatura como marcadores para o cancro de bexiga foram também modulados. A incubação com BCG resultou numa tendência ao aumento da expressão de genes relevantes na preservação e estabilidade genómica e menor malignidade, no entanto, apenas em células que expressavam sT ou sTn. Entre as dez citocinas testadas, apenas a IL-6 e IL-8 foram expressas pelas linhas celulares de cancro da bexiga, com indução destas após estimulação com BCG, e principalmente em células que expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1. Em macrófagos, citocinas inflamatórias, tais como IL-1β, IL-6 e TNFα, e a citocina anti-inflamatória IL-10, foram induzidas apenas pelo secretoma de células de cancro da bexiga confrontadas com BCG, com maior relevância quando estas expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, prevendo a estimulação de macrófagos semelhantes aos de tipo M1 e uma melhor resposta à terapia com BCG. Conclusões. O efeito geral da expressão destas sialiltransferases e dos produtos enzimáticos sT ou sTn nas células de cancro de bexiga conduz a um fenótipo de maior malignidade. Contudo, a maior avidez de estas na produção de citocinas inflamatórias após confronto com BCG, bem como a maior capacidade de estimulação de macrófagos, predirá uma resposta à terapia com BCG mais eficaz em tumores que expressem os antigénios de TF sialilados. Tais conclusões são totalmente concordantes com os nossos mais recentes dados clínicos obtidos em colaboração, que mostram que em doentes com cancro de bexiga que expressam sTn respondem melhor a terapia BCG. ----------ABSTRACT: Background. Bladder cancer is a common malignancy representing the 6th and the 5th most incident cancer in Portugal and in Italy, respectively. More than half of the cases relapse within one year, requiring though a lifelong follow-up. Intravesical instillation of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (an attenuated strain of Mycobacterium bovis) represents an effective immunotherapy of bladder cancer, although many aspects of the interaction of BCG with cancer cells and host immune cells remain obscure. Bladder cancer cells often express the sialylated forms of the Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). However, it’s still unknown the sense of such expression in tumour malignancy and in the BCG therapy efficacy. Aim of the study. To investigate the role of the sT and sTn antigens on the malignant phenotype of bladder cancer cells and the immune mediated response to BCG therapy. Experimental. We have utilized populations of the bladder cancer cell lines HT1376 and MCR, genetically modified by transduction with the sialyltransferases ST3GAL1 or ST6GALNAC1 to express homogeneously sT or sTn antigens. The level of BCG internalized was assessed by flow cytometry. The whole gene expression profile of BCG-challenged or unchallenged bladder cancer cell lines was studied by microarray technology. The profile of cytokines secreted by BCG-challenged bladder cancer cells and that of macrophages challenged by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells was studied by multiplex immune-beads assay. Results. Transcriptome analysis of the sialyltransferase-transduced cells revealed that groups of genes involved in specific functions were regulated in parallel in the two cell lines, regardless the sialyltransferase expressed. Namely, in sialyltransferase-expressing cells, genes involved in the proper chromosomal segregation and in the DNA repair were consistently down-regulated, while genes reported in literature as markers for bladder cancer were modulated. BCG-challenging induced a tendency to up-regulation of the genes preserving genomic stability and reducing malignancy, but only in cells expressing either sT or sTn. Among the ten cytokines tested, only IL-6 and IL-8 were expressed by bladder cancer cell lines and up-regulated by BCG-challenging, mainly in sialyltransferases-expressing cells. In macrophages, inflammatory cytokines, such as IL-1β, IL-6 and TNFα, and the antinflammatory IL-10 were induced only by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells, particularly when expressing either sialyltransferase, predicting the stimulation of M1-like macrophages and a better response to BCG therapy. Conclusions. The general effect of the expression of the two sialyltransferases and their products in the bladder cancer cells is toward a more malignant phenotype. However, the stronger ability of sialyltransferase expressing cells to produce inflammatory cytokines upon BCG-challenging and to stimulate macrophages predicts a more effective response to BCG in tumours expressing the sialylated TF antigens. This is fully consistent with our recent clinical data obtained in collaboration, showing that patients with bladder cancer expressing sTn respond better to BCG therapy.

Cytokine expression in the duodenal mucosa of patients with visceral leishmaniasis

INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis (VL) is a neglected tropical disease with a complex immune response in different organs. This pattern of organ-specific immune response has never been evaluated in the gastrointestinal tract. The aim of this study was to determine the in situ immune response in duodenal biopsies on patients with VL. METHODS: A case-control study was conducted on 13 patients with VL in comparison with nine controls. The immune response was evaluated using immunohistochemistry, for CD4, CD8, CD68, IL-4, IFN-γ, TNF-α and IL-10. Histological findings from the villi, crypts and inflammatory process were analyzed. RESULTS: All the cases of VL presented Leishmania antigens. No antigen was detected in the control group. The villus size was greater in the VL patients (p < 0.05). CD68 (macrophages) and CD4 levels were higher in the VL patients (p < 0.05). No differences in the expression of CD8, TNF-α, IL-10 or IL-4 were demonstrated. The number of cells expressing IFN-γ was lower in the VL patients (p < 0.05). CONCLUSIONS: Low levels of cytokines were found in the gastrointestinal tract of patients with VL. This pattern was not found in other organs affected by the disease. Immunotolerance of this tissue against Leishmania could explain these findings, as occurs with intestinal bacteria.

Linfócitos CD4, CD8 e células NK no estroma da cérvice uterina de mulheres infectadas pelo papilomavírus humano

INTRODUÇÃO: A resposta imune pode ser um elemento chave para a progressão ou remissão da infecção pelo papilomavírus humano (HPV) no estroma da cérvice uterina. Este estudo objetivou quantificar no estroma cervical a presença de linfócitos T CD4, CD8 e células NK, por imunohistoquímica, em lesões de alto e baixo grau em pacientes infectadas por HPV MÉTODOS: Utilizou-se 56 amostras de biópsia da estroma cervical, sendo 43 amostras positivas para DNA de HPV de alto risco oncogênico e com diagnóstico histopatológico de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) de alto e baixo grau, ou negativa para lesão intraepitelial e malignidade (NILM), e 13 amostras de pacientes negativas para DNA de HPV com diagnóstico histopatológico NILM RESULTADOS: Maior quantidade de linfócitos T CD4 foi observada em amostras NIC II/III, carcinoma e NILM (p=0,04) e naquelas cuja carga viral esteve entre 10 e 1,000 RLU/PCB. O predomínio de linfócitos T CD8 ocorreu em maior proporção nas amostras NIC II/III (p=0,02) e em amostras com carga viral entre 100 e 1.000 RLU/PCB. As células NK prevaleceram nas amostras com lesões de baixo grau e com baixa carga viral CONCLUSÕES: Este estudo comprovou que nas fases iniciais da infecção, onde não há ainda alterações celulares de alto grau, não temos a presença de células que possam desencadear a fase efetora da resposta imune.

Immunophenotyping of circulating T cells in a mucosal leishmaniasis patient coinfected with HIV

HIV coinfection modifies the clinical course of leishmaniasis by promoting a Th2 pattern of cytokine production. However, little information is available regarding the lymphocytic response in untreated coinfected patients. This work presents the immunophenotyping of Leishmania-stimulated T cells from a treatment-naÏve HIV+ patient with ML. Leishmania braziliensis antigens induced CD69 expression on CD3+CD4+ and CD3+CD8+ cells. It also increased IL-4 intracellular staining on CD3+CD4+GATA3- population and decreased the percentage of CD3+CD4+IL-17+ cells. This suggests that modulations in the IL-4R/STAT6 pathway and the Th17 population may serve as parasitic evasion mechanisms in HIV/ML. Further studies are required to confirm these results.

Carbohydrate-rich high-molecular-mass antigens are strongly recognized during experimental Histoplasma capsulatum infection

INTRODUCTION: During histoplasmosis, Histoplasma capsulatum soluble antigens (CFAg) can be naturally released by yeast cells. Because CFAg can be specifically targeted during infection, in the present study we investigated CFAg release in experimental murine histoplasmosis, and evaluated the host humoral immune response against high-molecular-mass antigens (hMMAg. >150 kDa), the more immunogenic CFAg fraction. METHODS: Mice were infected with 2.2x10(4) H. capsulatum IMT/HC128 yeast cells. The soluble CFAg, IgG anti-CFAg, IgG anti-hMMAg, and IgG-hMMAg circulating immune complexes (CIC) levels were determined by enzymelinked immunosorbent assay, at days 0, 7, 14, and 28 post-infection. RESULTS: We observed a progressive increase in circulating levels of CFAg, IgG anti-CFAg, IgG anti-hMMAg, and IgG-hMMAg CIC after H. capsulatum infection. The hMMAg showed a high percentage of carbohydrates and at least two main immunogenic components. CONCLUSIONS: We verified for the first time that hMMAg from H. capsulatum IMT/HC128 strain induce humoral immune response and lead to CIC formation during experimental histoplasmosis.

Antigens of worms and eggs showed a differentiated detection of specific IgG according to the time of Schistosoma mansoni infection in mice

INTRODUCTION: The correlation between the immunological assay and the antibody titer can offer a tool for the experimental analysis of different phases of the disease. METHODS: Two simple immunological assays for Schistosoma mansoni in mice sera samples based on specific IgG detection for worms soluble antigens and eggs soluble antigens were standardized and evaluated in our laboratory. Fifty mice were used in negative and positive groups and the results obtained by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) assays were compared with the number of worms counted and the IgG titers at different times of infection. RESULTS: Data showed that ELISA using adult worm antigens (ELISA-SWAP) presented a satisfactory correlation between the absorbance value of IgG titers and the individual number of worms counted after perfusion technique (R²=0.62). In addition, ELISA-SWAP differentially detected positive samples with 30 and 60 days post infection (p=0.011 and 0.003, respectively), whereas ELISA using egg antigens (ELISA-SEA) detected samples after 140 days (p=0.03). CONCLUSIONS: These data show that the use of different antigens in immunological methods can be used as potential tools for the analysis of the chronological evolution of S. mansoni infection in murine schistosomiasis. Correlations with human schistosomiasis are discussed.

Evaluation of CD4+CD25+ T lymphocyte response time kinetics in patients with chronic Chagas disease after in vitro stimulation with recombinant Trypanosoma cruzi antigens

Introduction CD4+CD25+ T lymphocytes have been implicated in the regulation of host inflammatory response against Trypanosoma cruzi, and may be involved in the clinical course of the disease. Methods Peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic Chagas disease were cultured in the presence of T. cruzi recombinant antigens and assayed for lymphocytes at distinct time points. Results It was possible to differentiate clinical forms of chronic Chagas disease at days 3 and 5 according to presence of CD4+CD25+ T cells in cell cultures. Conclusions Longer periods of cell culture proved to be potentially valuable for prospective evaluations of CD4+CD25+ T lymphocytes in patients with chronic Chagas disease.

CD8+ T cells in situ in different clinical forms of human cutaneous leishmaniasis

Introduction Leishmania braziliensis infection induces a large spectrum of lesions that clinically manifest as nodules or papules that progress to ulcers. Although it is already known that T helper cells predominate in the lesions, cytotoxic T cells have also been reported to be present, and their role in leishmaniasis immunopathogenesis is not well known. This study investigated the amounts of CD8+ and granzyme B+ cells in different clinical forms of human cutaneous leishmaniasis (CL). Methods Forty tissue fragments from early (E-CL) and late CL (L-CL) lesions and from disseminated leishmaniasis (DL) - papules and ulcers - were characterized. The inflamed area per fragment was calculated, and the CD8 and granzyme B expression levels in the infiltrates were quantified by counting positive cells in 15 fields. The localization of CD8 and granzyme B was graded subjectively. Results Inflammation was higher in L-CL and DL ulcers. CD8 expression was increased in late ulcerated lesions compared to recent lesions. The increase in CD8+ cells also correlated with the duration of the lesion. Papules had a higher frequency of granzyme B+ cells than E-CL lesions, although the frequency was similar to those for late and DL ulcers. CD8+ cells were mostly found in the papillary dermis. Conclusions CD8+ T and granzyme B+ cells are present in the inflammatory infiltrates of CL and DL and may participate in the immunopathogenesis of Leishmania infection.

Understanding how dentritic cell glycans affect antitumor immune responses

RESUMO: As células dendríticas (DCs) têm a capacidade única de induzir respostas imunitárias contra as células tumorais, fagocitando antigénios tumorais e apresentando-os às células T, provocando respostas imunitárias específicas que conduzem à eliminação de células de tumorais. Por induzirem memória imunológica de longa duração, as DCs são uma estratégia atrativa para o tratamento e/ou prevenção do cancro. No entanto, os resultados terapêuticos obtidos em ensaios clínicos com DCs são escassos e pouco eficientes. O nosso grupo demonstrou que ácidos siálicos que contêm glicanos desempenham um papel funcional importante em DCs geradas ex vivo. Com o objetivo de estabelecer um modelo in vitro para avaliar a resposta anti-tumoral específica realizou-se um tratamento enzimático a DCs derivadas de monócitos (moDCs) com sialidase, enzima que cliva ácidos siálicos na superfície celular. O perfil de maturação de moDCs foi caracterizado por citometria de fluxo e expressão de citocinas. Os resultados mostram que a sialidase pode regular positivamente a expressão de moléculas co-estimuladoras na superfície de moDCs estimuladas com agonistas de Toll like receptors (TLRs). Para percebermos se o tratamento com sialidase afeta a sinalização dos TLRs foram usadas células HEK transfectadas de forma estável com TLRs 2, 4 and 7/8. Os dados mostraram que a desialilação não afeta a sinalização através estes recetores. Para investigar o impacto funcional da sialidase na capacidade de moDCs em apresentar um antigénio e ativar células T, moDCs foram tratadas, ou não, com sialidase e cultivadas com clones de células T CD8+ específicas para os péptidos derivados do antigénio tumoral gp100. Os resultados mostram que DCs HLA*02:01+ desialiladas exibem maior cross-presentation do péptido gp100280-288 às células T CD8+ específicas. Além disso o tratamento com sialidase também aumenta a capacidade de DCs de induzir a proliferação de células T CD4+. Em conjunto, os resultados indicam que moDCs com menos ácidos siálicos na superfície, têm melhor potencial imuno-estimulador, com maior capacidade de induzir respostas imunes anti-tumorais.--------------------- ABSTRACT: Dendritic cells (DCs) have a unique capacity to induce immune responses against tumor cells. They can phagocyte tumor antigens, maturate and present them to T cells, triggering antigen-specific immune responses that may lead to the elimination of tumor cells. Since they induce long-lasting immunological memory, DCs become an attractive strategy as cellular targets for vaccines in the treatment and/or prevention of cancer. However, the therapeutic results obtained in clinical trials with DCs are scarce and only few patients effectively respond to the DC vaccines. Our group has shown that sialic acid containing glycans play an important functional role in ex vivo generated DC. Here we aimed to establish an in vitro model to assess specific antitumor responses. To achieve this, an enzymatic treatment of monocyte-derived DCs (moDCs) was performed using sialidase to cleave surface sialic acids. The maturation profile of the moDCs was characterized by flow cytometry and cytokine expression. The results show that sialidase treatment can upregulate co-stimulatory molecules on surface of moDCs stimulated with Toll like receptor (TLR) agonists. To understand whether sialidase treatment affected the TLR signaling, we have used HEK cells stably transfected with TLRs 2, 4 and 7/8. The data showed that desialylation of moDCs does not affect the signaling via these receptors. To investigate the functional impact of sialidase treatment in the capacity of moDCs to present antigen and to activate antigen specific T cells, sialidase treated and untreated moDCs were co-cultured with CD8+ T cell clones specific for peptides derived from the gp100 tumor antigen. Our results show that desialylated HLA02:01+ DCs are superior in cross-presentation of the peptide to gp100280–288 specific CD8+ T cells. In addition, sialidase treatment also increased the DC capacity to induce CD4+ T cells proliferation. Together, these data indicate that moDCs with altered cell surface sialic acids, through a sialidase treatment, have a better immunostimulatory potential which could improve anti-tumor immune responses.

Analysis of human leukocyte antigens class II-DR in Brazilian children and adolescents with systemic lupus erythematosus

OBJECTIVE: To analyze the frequency of human leukocyte antigens class II-DR in children and adolescents with systemic lupus erythematosus. PATIENTS AND METHODS: Fifty-fiveBrazilian systemic lupus erythematosus children and adolescents and 308 healthy individuals were studied. Gender, race, and age of onset of systemic lupus erythematosus were recorded. The human leukocyte antigens typing of class II-DR was carried out by polymerase chain reaction amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP). Data were analyzed statistically using the chi square test with Yates' correction, Fisher's exact test, and Bonferroni's correction. RESULTS: Human leukocyte antigen-DR 15 was the most frequently detected antigen in this group of children and adolescents, and it also occurred more frequently in the female group, in children with onset of systemic lupus erythematosus between 0 and 9 years and between 10 to 14 years, and in the Black race group, but these associations were not statistically significants. CONCLUSION: In this group of children and adolescents with a high degree of racial admixture, we could not verify a significant association between human leukocyte antigens class II-DR and systemic lupus erythematosus.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO: O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ------------------------------------ ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites. 3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Human and murine clonal CD8+ T cell expansions arise during tuberculosis because of TCR selection

The immune system can recognize virtually any antigen, yet T cell responses against several pathogens, including Mycobacterium tuberculosis, are restricted to a limited number of immunodominant epitopes. The host factors that affect immunodominance are incompletely understood. Whether immunodominant epitopes elicit protective CD8+ T cell responses or instead act as decoys to subvert immunity and allow pathogens to establish chronic infection is unknown. Here we show that anatomically distinct human granulomas contain clonally expanded CD8+ T cells with overlapping T cell receptor (TCR) repertoires. Similarly, the murine CD8+ T cell response against M. tuberculosis is dominated by TB10.44-11-specific T cells with extreme TCRß bias. Using a retro genic model of TB10.44-11-specific CD8+ Tcells, we show that TCR dominance can arise because of competition between clonotypes driven by differences in affinity. Finally, we demonstrate that TB10.4-specific CD8+ T cells mediate protection against tuberculosis, which requires interferon-? production and TAP1-dependent antigen presentation in vivo. Our study of how immunodominance, biased TCR repertoires, and protection are inter-related, provides a new way to measure the quality of T cell immunity, which if applied to vaccine evaluation, could enhance our understanding of how to elicit protective T cell immunity.

Supresión oral de la Encefalomielitis autoinmune experimental por antígenos sinaptosomales. Oral suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by sinaptosomal antigens.

La inducción de las manifestaciones clínicas de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) involucra una reacción inmune celular contra determinantes antigénicos del sistema nervioso central (SNC), principalmente contra la proteína básica de mielina (PBM). Atento a la reactividad inmunológica cruzada previamente descrita entre la PBM y la proteína neuronal Sinapsina I, estudiaremos el efecto de la administración oral de moléculas híbridas (LTBSC, LTBSABC) entre la subunidad B de la toxina lábil al calor de Escherichia coli (LTB) con péptidos de Sinapsina (dominios C y ABC de la molécula) sobre el desarrollo de la EAE en ratas Wistar. Se administrarán oralmente los antígenos híbridos de LTB, LTB y péptidos de sinapsina no acoplados previa o posteriormente a la inducción activa de la EAE. Se estudiará la aparición de las manifestaciones clínicas de la enfermedad y se caracterizará la respuesta histopatológica e inmunológica (reacción de DTH, activación de linfocitos T, respuesta inmune humoral, vías de activación de macrófagos, patrón de citocinas) y los eventos celulares e inmunes desencadenados a nivel local luego de administrar los antígenos recombinantes en sistemas in vivo e in vitro. Estos estudios acerca de la respuesta autoinmune contra componentes de mielina y sinaptosomales en EAE tienen como objetivo poder comprender los diferentes mecanismos subyacentes involucrados en el desarrollo y regulación de esta enfermedad experimental. Específicamente este proyecto relacionado a la supresión de los síntomas clínicos como así también las alteraciones neuropatológicas del SNC de la EAE a través de un proceso de supresión oral de la enfermedad no invasivo utilizando tanto antígenos mielínicos como sinaptosomales fusionados a subunidades B (atóxicas) de la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LTB), es de suma importancia para un estudio posterior en las patologías humanas relacionadas y su uso en el diagnóstico, pronóstico y/o terapia de las mismas.

Modulación de la activación de células dendríticas por antígenos de Fasciola hepatica y ligandos para receptores Toll: Potencial terapéutico en respuestas anti-inflamatorias. Fasciola hepatica antigens and TLR ligands modulate dendritic cells activation: therapeutic potential in anti-inflammatory responses.

Antecedentes: En nuestro laboratorio hemos demostrado que antígenos (Ags) de Fasciola hepatica inducen en células dendríticas murinas (CD), diferentes propiedades tolerogénicas como la incapacidad por si mismos de inducir la maduración de las células, la resistencia a la maduración por ligandos de TLR, el incremento en la producción de IDO y también la capacidad de esta estas células de dirigir la respuesta inmune hacia un perfil Th2 y T reg. Por otra parte ha sido bien documentado que CD con características tolerogénicas, ya sea inmaduras o semimaduras, son útiles para reducir respuestas inflamatorias excesivas tales como las que ocurren en enfermedades autoinmunes. Además hemos demostrado que CD tratadas con Ags del parásito en conjunto con un ligando Toll (CpG-ODN) producen altos niveles de citoquinas anti-inflamatorias (IL-10 y TGF-) bajos de citoquinas proinflamatorias (TNF, IL-6, IL-12). Hipótesis: El fenotipo semimaduro alcanzado en las CDpodría ser utilizado para reducir la inflamación en un modelo de enfermedad autoinmune en donde existe una exacerbada respuesta Th1 y Th17, ya que la producción elevada de IL-10 y TGF- podría inhibir o controlar estas respuestas de manera directa o a través de la inducción de células T regulatorias. Objetivos: En este proyecto nosotros proponemos la inmunización de animales susceptibles (ratones DBA1/j), al desarrollo de artritis inducida por colágeno (AIC) con CD tratadas con Ags de F. hepatica en conjunto con CpG-ODN para reducir los síntomas clínicos de la enfermedad. Materiales a utilizar: En nuestro laboratorio hemos desarrollado un modelo de artritis inducida por colágeno (AIC) mediante dos inmunizaciones de ratones DBA1/j con colágeno tipo II bovino y adyuvante de Freund. El modelo permitió establecer un índice clínico mediante la hinchazón en las patas de los animales. Doce días posteriores a la primera inmunización los animales serán inyectados con CD tratadas con: 1. PBS, 2.Extracto total de F.hepatica (TE) + CII, 3. CpG + CII, 4. TE+CpG+CII Se realizará la observación macroscópica diaria, a partir de los 7 días de la 2a inmunización Luego del sacrificio las articulaciones de las patas se prepararán para realizar un análisis histológico. Se detectará en suero los niveles de anticuerpos IgG1 (perfil Th2) y de IgG2a (perfil Th1) mediante la técnica de ELISA. Se detectará también el perfil de citoquinas en los nódulos drenantes por la técnica de ELISA y adicionalmente la poblaciónes celulares de células T regulatorias (Treg) CD4+CD25+Foxp3 o células Tr1. Resultados esperados: Pensamos que el tratamiento de los animales que desarrollan AIC con CD semimaduras (por el tratamiento con TE y CpG), serán capaces de migrar a los órganos linfaticos y secretar TGF-be(inductora de células T reg), IL-10 (inductoras de células Tr1), IDO inhibitoria de la respuesta de Li T y promotor de células T reg, también podría generarse una respuesta Th2 (por la presencia de antígenos del parásito), y estas respuestas aisladas o en forma sinérgica podrían inhibir las respuestas de tipo Th17 y Th1 asociadas a la patología en esta enfermedad. Importancia del proyecto: En el desarrollo de la artritis existe un aumento de la inmunidad mediada por células, asi como de la respuesta inmune humoral hacia componentes de la matriz del cartílago. El tratamiento convencional de la artritis recae en general en el uso de inmunosupresores no-específicos, los cuales poseen una variedad de efectos adversos y la inhibición de la respuesta inflamatoria no es específica. En este proyecto proponemos el uso de CD tratadas con antígenos del helminto F. hepatica y CpG ligando Tol que capacita a estas células para generar una respuesta adaptativa de tipo regulatoria, útil en la inhibición de las respuestas inflamatorias como la que ocurre durante la progresión de artritis reumatoidea en un modelo experimental en ratones. We have shown that F. hepatica Ags-treated dendritic cells (DC) together with a TLRl ligand (CpG-ODN) produce high levels of anti-inflammatory cytokines (IL-10 and TGF-Beta) and low of proinflammatory cytokines (TNF, IL-6, IL -12). Hypothesis: The semimature phenotype achieved by DC, could be used to reduce inflammation in a model of autoimmune disease. The high production of IL-10 and TGF-Beta by these cells could directly or through the induction of T reg cells inhibit the inflammatory response. Objective: In this project we propose the immunization of DBA1 / j mice, susceptible to the development of collagen-induced arthritis (CIA) with F. hepatica-treated DC in conjunction with CpG-ODN to reduce clinical signs of disease. Materials: In our laboratory, we developed the CIA model by two immunizations of DBA1 / j mice with bovine type II collagen and Freund's adjuvant. The model allowed to stablish a clinical index by swelling in the legs of animals. Twelve days after the first immunization the animals are injected with DC treated with: 1. PBS 2. F.hepatica Extract (TE) + CII, 3. CpG + CII, 4. TE + CpG + CII Macroscopic observation will take place daily from 7 days of the 2nd immunization. After sacrifice the joints of the legs will be prepared for histological analysis. Serum levels of IgG1 antibodies (Th2 profile) and IgG2a (Th1 profile) will be detected by ELISA. It will also detected the cytokine profile in draining lymph nodes by ELISA and additionally the cell populations of regulatory T cells (Treg) CD4 + CD25 + Foxp3 or Tr1 cells. Expected results: We believe that the treatment of animals that had developed CIA with DC will be able to migrate to lymphatic organs and secrete TGF-B (T reg cell-inducing), IL-10 (inducing Tr1 cells), IDO (inhibitory of T cells and inducing of T reg cells) could alone or in synergy inhibit Th17-type responses and Th1 associated with the pathology in this disease.