MARCH1 : new insights in the activation of B cells

L’implication des cellules B dans le développement de l’auto-immunité ne cesse d’être illustrée par de récentes publications. Les cellules présentent des peptides du soi aux cellules T auto-réactives ce qui mène à la production de cytokines pro-inflammatoires et d’anticorps auto-réactifs. Dans le présent document, nous explorons la présentation antigénique et la modification post-traductionnelle du complexe majeur d’histocompatibilité II (CMH-II). MARCH1 est une E3 ubiquitine ligase qui cible le CMH-II et le relocalise le complexe vers les endosomes de recyclage. Ainsi, MARCH1 est un inhibiteur de la présentation d’antigènes exogènes. Ici, nous démontrons que MARCH1 est exprimé seulement dans la sous-population des cellules B folliculaires et que cette expression est perdue lors de l’entrée dans les centres germinatifs. Nous proposons que MARCH1 établie une barrière de formation de centres germinatifs. Nous démontrons le lien entre MARCH1 et la hausse de CMH-II à la surface des cellules B à la suite d’un traitement à l’IL-10. De plus, nous avons testé plusieurs stimuli activateurs des cellules B et démontrons que MARCH1 est régulé à la baisse dans tous les cas. De plus, nous mettons en valeurs le rôle de la voie canonique d’activation de NF-κB dans cette régulation de MARCH1. Finalement, nous avons développé un système de lentivirus exprimant MARCH1 qui nous permet de forcer l’expression de MARCH1 dans des cellules réfractaires à la transfection. Nous discutons de l’implication de cette régulation du CMH-II par MARCH1 dans le développement de maladies auto-immunes.

Alternative splicing by hnRNP L as a new modulator of hematopoietic cell differentiation, survival and migration

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN messager (ARNm), comme l’épissage alternatif, jouent un rôle important dans la régulation du développement embryonnaire, de la fonction cellulaire et de l’immunité. De nouvelles évidences révèlent que l’épissage alternatif serait également impliqué dans la régulation de la maturation et de l’activation des cellules du système hématopoïétique. Le facteur hnRNP L a été identifié comme étant le principal régulateur de l’épissage alternatif du gène codant pour le récepteur CD45 in vitro. Le récepteur CD45 est une tyrosine phosphatase exprimée par toutes les cellules du système hématopoïétique qui contrôle le développement et l’activation des lymphocytes T. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction du facteur hnRNP L dans le développement des lymphocytes T et dans l’épissage de l’ARNm de CD45 in vivo en utilisant des souris dont le gène de hnRNP L a été supprimé spécifiquement dans les cellules T. La délétion de hnRNP L dans les thymocytes résulte en une expression aberrante des différents isoformes de CD45 avec une prédominance de l'isoforme CD45RA qui est généralement absent dans le thymus. Une conséquence de la délétion de hnRNP L est une diminution de la cellularité du thymus causée par un blocage partiel du développement des cellules pré-T au stade DN4. Cette réduction du nombre de cellules dans le thymus n’est pas liée à une hausse de la mort cellulaire. Les thymocytes déficients pour hnRNP L démontrent plutôt une prolifération augmentée comparée aux thymocytes sauvages due à une hyper-activation des kinases Lck, Erk1/2 et Akt. De plus, la délétion de hnRNP L dans le thymus cause une perte des cellules T en périphérie. Les résultats des expériences in vitro suggèrent que cette perte est principalement due à un défaut de migration des thymocytes déficients pour hnRNP L du thymus vers la périphérie en réponse aux chimiokines. L’épissage alternatif de CD45 ne peut expliquer ce phénotype mais l’identification de cibles par RNA-Seq a révélé un rôle de hnRNP L dans la régulation de l’épissage alternatif de facteurs impliqués dans la polymérisation de l’actine. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle de hnRNP L dans l’hématopoïèse en utilisant des souris dont la délétion de hnRNP L était spécifique aux cellules hématopoïétiques dans les foies fœtaux et la moelle osseuse. L’ablation de hnRNP L réduit le nombre de cellules progénitrices incluant les cellules progénitrices lymphocytaires (CLPs), myéloïdes (CMPs, GMPs) et mégakaryocytes-érythrocytaires (MEPs) et une perte des cellules hématopoïétiques matures. À l’opposé des cellules progénitrices multipotentes (MPPs) qui sont affectées en absence de hnRNP L, la population de cellules souches hématopoïétiques (HSCs) n’est pas réduite et prolifère plus que les cellules contrôles. Cependant, les HSCs n’exprimant pas hnRNP L sont positives pour l'Annexin V et expriment CD95 ce qui suggère une mort cellulaire prononcée. Comme pour les thymocytes, une analyse par RNA-Seq des foies fœtaux a révélé différents gènes cibles de hnRNP L appartenant aux catégories reliées à la mort cellulaire, la réponse aux dommages à l’ADN et à l’adhésion cellulaire qui peuvent tous expliquer le phénotype des cellules n’exprimant pas le gène hnRNP L. Ces résultats suggèrent que hnRNP L et l’épissage alternatif sont essentiels pour maintenir le potentiel de différenciation des cellules souches hématopoïétiques et leur intégrité fonctionnelle. HnRNP L est aussi crucial pour le développement des cellules T par la régulation de l’épissage de CD45 ainsi que pour leur migration.

Régulation du métabolisme des ARNm par les voies de signalisation MAPK et mTOR

Il est à ce jour bien établi que la régulation de l’expression génique dépend en grande partie des évènements post-transcriptionnels et que la traduction des ARNm tient un rôle de premier plan dans ces processus. Elle est particulièrement importante pour définir le protéome, maintenir l’homéostasie et contrôler la croissance et la prolifération cellulaire. De nombreuses pathologies humaines telles que le cancer découlent de dérèglements de la synthèse protéique. Ceci souligne l’importance d’une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires contribuant au contrôle de la traduction des ARNm. Le facteur d’initiation eIF4E est essentiel à la traduction et son activité est régulée par ses partenaires protéiques dont font partie les protéines 4E-BP et 4E-T. Les voies de signalisation PI3K/mTOR et MAPK qui sont fortement impliquées dans l’étiologie du cancer, contrôlent la traduction en modulant l’activité d’eIF4E via l’inhibition des protéines 4E-BP et la localisation de 4E-T. Afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes régulant la traduction des ARNm, nous avons utilisé plusieurs approches. Tout d’abord, nous avons caractérisé les mécanismes par lesquels le complexe mTORC1 est activé en réponse aux facteurs de croissance et avons déterminé que la kinase RSK, en aval de la voie Ras/ERK, contrôle directement l’activité de mTORC1 en phosphorylant Raptor, la sous-unité régulatrice du complexe mTORC1. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés au rôle joué par mTORC1 dans l’initiation de la traduction. Pour cela, nous avons réalisé un criblage protéomique dans le but d’identifier de nouveaux facteurs sous le contrôle de mTORC1 qui participent activement à la traduction. Ces travaux ont ainsi permis l’identification de la protéine de liaison à l’ARN LARP1 comme effecteur majeur de la traduction des ARNm et de la croissance cellulaire en aval de mTORC1. Finalement, notre étude de l’effet du stress oxydant dans la répression de la traduction nous a permis de montrer que la kinase JNK contrôle la localisation du répresseur 4E-T au sein des P-bodies, qui sont des granules cytoplasmiques concentrant des ARNm non traduits et des facteurs de la dégradation des ARNm. Nos travaux ont donc abouti à la découverte de mécanismes moléculaires cruciaux impliqués dans la régulation de la traduction des ARNm et de la synthèse protéique. Ces derniers étant largement impliqués dans la prolifération cellulaire et la croissance tumorale, nos recherches ouvrent sur un champ d’investigation plus large pour le développement de nouvelles molécules anti-cancéreuses.

Understanding the transcriptional control of EIF4E and its dysregulation in acute myeloid leukemia: role of NF-κB

EIF4E, le facteur d’initiation de la traduction chez les eucaryotes est un oncogène puissant et qui se trouve induit dans plusieurs types de cancers, parmi lesquels les sous-types M4 et M5 de la leucémie aiguë myéloblastique (LAM). EIF4E est régulé à plusieurs niveaux cependant, la régulation transcriptionnelle de ce gène est peu connue. Mes résultats montrent que EIF4E est une cible transcriptionnelle directe du facteur nucléaire « kappa-light- chain- enhancer of activated B cells » (NF-κB).Dans les cellules hématopoïétiques primaires et les lignées cellulaires, les niveaux de EIF4E sont induits par des inducteurs de NF-κB. En effet, l’inactivation pharmaceutique ou génétique de NF-κB réprime l’activation de EIF4E. En effet, suite à l’activation de NF-κB chez l’humain, le promoteur endogène de EIF4E recrute p65 (RelA) et c-Rel aux sites évolutionnaires conservés κB in vitro et in vivo en même temps que p300 ainsi que la forme phosphorylée de Pol II. De plus, p65 est sélectivement associé au promoteur de EIF4E dans les sous-types LAM M4/M5 mais non pas dans les autres sous-types LAM ou dans les cellules hématopoïétiques primaires normales. Ceci indique que ce processus représente un facteur essentiel qui détermine l’expression différentielle de EIF4E dans la LAM. Les analyses de données d’expressions par séquençage de l’ARN provenant du « Cancer Genome Atlas » (TCGA) suggèrent que les niveaux d’ARNm de EIF4E et RELA se trouvent augmentés dans les cas LAM à pronostic intermédiaire ou faible mais non pas dans les groupes cytogénétiquement favorables. De plus, des niveaux élevés d’ARNm de EIF4E et RELA sont significativement associés avec un taux de survie relativement bas chez les patients. En effet, les sites uniques κB se trouvant dans le promoteur de EIF4E recrutent le régulateur de transcription NF-κB p65 dans 47 nouvelles cibles prévues. Finalement, 6 nouveaux facteurs de transcription potentiellement impliqués dans la régulation du gène EIF4E ont été prédits par des analyses de données ChIP-Seq provenant de l’encyclopédie des éléments d’ADN (ENCODE). Collectivement, ces résultats fournissent de nouveaux aperçus sur le control transcriptionnel de EIF4E et offrent une nouvelle base moléculaire pour sa dérégulation dans au moins un sous-groupe de spécimens de LAM. L’étude et la compréhension de ce niveau de régulation dans le contexte de spécimens de patients s’avère important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’expression du gène EIF4E moyennant des inhibiteurs de NF-κB en combinaison avec la ribavirine.

Identification et regroupement de QTL influençant la pression artérielle en modules épistatiques et analyse de deux gènes candidats chez la souche Dahl Salt-Sensitive

L’hypertension essentielle étant un facteur majeur de morbidité, la compréhension de son l’étiologie est prépondérante. Ainsi, la découverte de nouvelles composantes ou mécanismes de régulation de la PA par l’identification de QTL et l’étude de leurs interactions s’avère une approche prometteuse. L’utilisation de souches congéniques de rats pour l’étude de l’hypertension est une stratégie payante puisqu’elle permet de masquer les effets de l’environnement, tout en gardant le caractère polygénique de la PA. Longtemps conçu comme un trait issu de l’accumulation des effets minimes des QTL, la PA est régulée par une architecture basée sur l’existence d’interactions épistatiques. L’analyse par paires de QTL individuels a permis d’établir une modularité dans l’organisation des QTL chez le rat Dahl Salt-sensitive en fonction de la présence ou de l’absence d’une interaction épistatique entre eux. Ainsi, deux modules épistatiques ont été établis; EM1 et EM2 où tous les QTL appartenant à EM1 sont épistatiques entre eux et agissent de façon additive avec les membres de EM2. Des hiérarchies dans la régulation peuvent alors être révélées si les QTL d’un même EM ont des effets opposés. L’identification de la nature moléculaire des candidats C18QTL4/Hdhd2 et C18QTL3/Tcof1, membres du EM1, et de l’interaction épistatique entre ces deux QTL, a permis, en plus, d’élucider une régulation séquentielle au sein du module. Hdhd2 pourrait agir en amont de Tcof1 et réguler ce dernier par une modification post-traductionnelle. Cette interaction est la première évidence expérimentale de la prédiction des relations entre QTL, phénomène établi par leur modularisation. Le dévoilement du fonctionnement de l’architecture génétique à la base du contrôle de la PA et la découverte des gènes responsables des QTL permettrait d’élargir les cibles thérapeutiques et donc de développer des traitements antihypertenseurs plus efficaces.

Low relative humidity triggers RNA-directed de novo DNA methylation and suppression of genes controlling stomatal development

Environmental cues influence the development of stomata on the leaf epidermis, and allow plants to exert plasticity in leaf stomatal abundance in response to the prevailing growing conditions. It is reported that Arabidopsis thaliana ‘Landsberg erecta’ plants grown under low relative humidity have a reduced stomatal index and that two genes in the stomatal development pathway, SPEECHLESS and FAMA, become de novo cytosine methylated and transcriptionally repressed. These environmentally-induced epigenetic responses were abolished in mutants lacking the capacity for de novo DNA methylation, for the maintenance of CG methylation, and in mutants for the production of short-interfering non-coding RNAs (siRNAs) in the RNA-directed DNA methylation pathway. Induction of methylation was quantitatively related to the induction of local siRNAs under low relative humidity. Our results indicate the involvement of both transcriptional and post-transcriptional gene suppression at these loci in response to environmental stress. Thus, in a physiologically important pathway, a targeted epigenetic response to a specific environmental stress is reported and several of its molecular, mechanistic components are described, providing a tractable platform for future epigenetics experiments. Our findings suggest epigenetic regulation of stomatal development that allows for anatomical and phenotypic plasticity, and may help to explain at least some of the plant’s resilience to fluctuating relative humidity.

Insulin modulates norepinephrine-mediated melatonin synthesis in cultured rat pineal gland

The mammalian pineal gland synthesizes melatonin in a circadian manner, peaking during the dark phase. This synthesis is primarily regulated by sympathetic innervations via noradrenergic fibers, but is also modulated by many peptidergic and hormonal systems. A growing number of studies reveal a complex role for melatonin in influencing various physiological processes, including modulation of insulin secretion and action. In contrast, a role for insulin as a modulator of mclatonin synthesis has not been investigated previously. The aim of the current study was to determine whether insulin modulates norepinephrine (NE)-mediated melatonin synthesis. The results demonstrate that insulin (10(-8)M) potentiated norepinephrine-mediated melatonin synthesis and tryptophan hydroxylase (TPOH) activity in ex vivo incubated pineal glands. When ex vivo incubated pineal glands were synchronized (12h NE-stimulation, followed by 12h incubation in the absence of NE), insulin potentiated NE-mediated melatonin synthesis and arylalkylamine-N-acetyltransferase (AANAT) activity. Insulin did not affect the activity of hydroxyindole-O-methyltranferase (HIOMT), nor the gene expression of tpoh, aanat, or hiomt, under any of the conditions investigated. We conclude that insulin potentiates NE-mediated melatonin synthesis in cultured rat pineal gland, potentially through post-transcriptional events. (C) 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.

Insulin temporal sensitivity and its signaling pathway in the rat pineal gland

Aims: In our previous work, we reported that the insulin potentiating effect on melatonin synthesis is regulated by a post-transcriptional mechanism. However, the major proteins of the insulin signaling pathway (ISP) and the possible pathway component recruited on the potentiating effect of insulin had not been characterized. A second question raised was whether windows of sensitivity to insulin exist in the pineal gland due to insulin rhythmic secretion pattern. Main methods: Melatonin content from norepinephrine(NE)-synchronized pineal gland cultures was quantified by high performance liquid chromatography with electrochemical detection and arylalkylamine-N-acetyltransferase (AANAT) activity was assayed by radiometry. Immunoblotting and immunoprecipitation techniques were performed to establish the ISP proteins expression and the formation of 14-3-3: AANAT complex, respectively. Key findings: The temporal insulin susceptibility protocol revealed two periods of insulin potentiating effect, one at the beginning and another one at the end of the in vitro induced ""night"". In some Timed-insulin Stimulation (TSs), insulin also promoted a reduction on melatonin synthesis, showing its dual action in cultured pineal glands. The major ISP components, such as IR beta, IGF-1R, IRS-1, IRS-2 and PI3K(p85), as well tyrosine phosphorylation of pp85 were characterized within pineal glands. Insulin is not involved in the 14-3-3:AANAT complex formation. The blockage of PI3K by LY 294002 reduced melatonin synthesis and AANAT activity. Significance: The present study demonstrated windows of differential insulin sensitivity, a functional ISP and the PI3K-dependent insulin potentiating effect on NE-mediated melatonin synthesis, supporting the hypothesis of a crosstalk between noradrenergic and insulin pathways in the rat pineal gland. (C) 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.

Symmetry in biology: from genetic code to stochastic gene regulation

Mathematical models, as instruments for understanding the workings of nature, are a traditional tool of physics, but they also play an ever increasing role in biology - in the description of fundamental processes as well as that of complex systems. In this review, the authors discuss two examples of the application of group theoretical methods, which constitute the mathematical discipline for a quantitative description of the idea of symmetry, to genetics. The first one appears, in the form of a pseudo-orthogonal (Lorentz like) symmetry, in the stochastic modelling of what may be regarded as the simplest possible example of a genetic network and, hopefully, a building block for more complicated ones: a single self-interacting or externally regulated gene with only two possible states: ` on` and ` off`. The second is the algebraic approach to the evolution of the genetic code, according to which the current code results from a dynamical symmetry breaking process, starting out from an initial state of complete symmetry and ending in the presently observed final state of low symmetry. In both cases, symmetry plays a decisive role: in the first, it is a characteristic feature of the dynamics of the gene switch and its decay to equilibrium, whereas in the second, it provides the guidelines for the evolution of the coding rules.

p38 MAPK regulates IL-1β induced IL-6 expression through mRNA stability in osteoblasts

Osteoblast-derived IL-6 functions in coupled bone turnover by supporting osteoclastogenesis favoring bone resorption instead of bone deposition. Gene regulation of IL-6 is complex occurring both at transcription and post-transcription levels. The focus of this paper is at the level of mRNA stability, which is important in IL-6 gene regulation. Using the MC3T3-E1 as an osteoblastic model, IL-6 secretion was dose dependently decreased by SB203580, a p38 MAPK inhibitor. Steady state IL-6 mRNA was decreased with SB203580 (2 μM) ca. 85% when stimulated by IL-1β (1-5 ng/ ml). These effects require de novo protein synthesis as they were inhibited by cycloheximide. p38 MAPK had minor effects on proximal IL-6 promoter activity in reporter gene assays. A more significant effect on IL-6 mRNA stability was observed in the presence of SB203580. Western blot analysis confirmed that SB203580 inhibited p38 MAP kinase, in response to IL-1β in a dose dependent manner in MC3T3-E1 cells. Stably transfected MC3T3-E1 reporter cell lines (MC6) containing green fluorescent protein (GFP) with the 3′untranslated region of IL-6 were constructed. Results indicated that IL-1β, TNFα, LPS but not parathyroid hormone (PTH) could increase GFP expression of these reporter cell lines. Endogenous IL-6 and reporter gene eGFP-IL-6 3′UTR mRNA was regulated by p38 in MC6 cells. In addition, transient transfection of IL-6 3′UTR reporter cells with immediate upstream MAP kinase kinase-3 and -6 increased GFP expression compared to mock transfected controls. These results indicate that p38 MAPK regulates IL-1β-stimulated IL-6 at a post transcriptional mechanism and one of the primary targets of IL-6 gene regulation is the 3′UTR of IL-6.

Age related obesity-induced shortening of GLUT4 mRNA poly(A) tail length in rat gastrocnemius skeletal muscle

Obese insulin resistant animals and humans have shown reduced GLUT4 gene expression. Yet, in skeletal muscle, discrepancy between mRNA and protein regulation has been frequently observed, suggesting a post-transcriptional modulation. We investigated the GLUT4 expression in adipose tissue and muscle of obese 12-month-old (12-mo) rats, comparing with lean 2-month-old (2-mo) animals. Obesity was accompanied by insulin resistance, and 65% reduction (P < 0.01) in GLUT4 mRNA and protein in adipose tissue. However, in muscle, despite increased (P < 0.05) mRNA content, GLUT4 protein was unchanged. RNase H and poly(A) test assays showed a reduction (P < 0.01) of ∼80 adenines in the GLUT4 mRNA poly(A) tail of muscle from 12-mo rats, recognizing that the poly(A) tail length correlates with translation efficiency. Concluding, age related obesity of 12-mo rats involves suppression of GLUT4 expression in adipose tissue; however, in muscle, GLUT4 mRNA content increases, but with a shorter poly(A) tail, thus unchanging the protein content. © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Luteinizing Hormone Receptor (LHR): basic concepts in cattle and other mammals. a review

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Balancing immunity and tolerance: genetic footprint of natural selection in the transcriptional regulatory region of HLA-G

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

In silico identification of conserved intercoding sequences in Leishmania genomes: Unraveling putative cis-regulatory elements

In silico analyses of Leishmania spp. genome data are a powerful resource to improve the understanding of these pathogens' biology. Trypanosomatids such as Leishmania spp. have their protein-coding genes grouped in long polycistronic units of functionally unrelated genes. The control of gene expression happens by a variety of posttranscriptional mechanisms. The high degree of synteny among Leishmania species is accompanied by highly conserved coding sequences (CDS) and poorly conserved intercoding untranslated sequences. To identify the elements involved in the control of gene expression, we conducted an in silico investigation to find conserved intercoding sequences (CICS) in the genomes of L major, L infantum, and L braziliensis. We used a combination of computational tools, such as Linux-Shell, PERL and R languages, BLAST, MSPcrunch, SSAKE, and Pred-A-Term algorithms to construct a pipeline which was able to: (i) search for conservation in target-regions, (ii) eliminate CICS redundancy and mask repeat elements, (iii) predict the mRNA's extremities, (iv) analyze the distribution of orthologous genes within the generated LeishCICS-clusters, (v) assign GO terms to the LeishCICS-clusters. and (vi) provide statistical support for the gene-enrichment annotation. We associated the LeishCICS-cluster data, generated at the end of the pipeline, with the expression profile oft. donovani genes during promastigote-amastigote differentiation, as previously evaluated by others (GEO accession: GSE21936). A Pearson's correlation coefficient greater than 0.5 was observed for 730 LeishCICS-clusters containing from 2 to 17 genes. The designed computational pipeline is a useful tool and its application identified potential regulatory cis elements and putative regulons in Leishmania. (C) 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

Efficient RNAi-induced Protein Knockdown in Somatic Cells Using Diced or Chemically Produced Small Interfering RNAs (siRNA)

Background: RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing process in which double-stranded RNA (dsRNA) directs the degradation of a specific corresponding target mRNA. The mediators of this process are small dsRNAs of approximately 21 to 23 bp in length, called small interfering RNAs (siRNAs), which can be prepared in vitro and used to direct the degradation of specific mRNAs inside cells. Hence, siRNAs represent a powerful tool to study and control gene and cell function. Rapid progress has been made in the use of siRNA as a means to attenuate the expression of any protein for which the cDNA sequence is known. Individual siRNAs can be chemically synthesized, in vitro-transcribed, or expressed in cells from siRNA expression vectors. However, screening for the most efficient siRNAs for post-transcriptional gene silencing in cells in culture is a laborious and expensive process. In this study, the effectiveness of two siRNA production strategies for the attenuation of abundant proteins for DNA repair were compared in human cells: (a) the in vitro production of siRNA mixtures by the Dicer enzyme (Diced siRNAs); and (b) the chemical synthesis of very specific and unique siRNA sequences (Stealth RNai (TM)). Materials, Methods & Results: For in vitro-produced siRNAs, two segments of the human Ku70 (167 bp in exon 5; and 249 bp in exon 13; NM001469) and Xrcc4 (172 bp in exon 2; and 108 bp in exon 6; NM003401) genes were chosen to generate dsRNA for subsequent "Dicing" to create mixtures of siRNAs. The Diced fragments of siRNA for each gene sequence were pooled and stored at -80 degrees C. Alternatively, chemically synthesized Stealth siRNAs were designed and generated to match two very specific gene sequence regions for each target gene of interest (Ku70 and Xrcc4). HCT116 cells were plated at 30% confluence in 24- or 6-well culture plates. The next day, cells were transfected by lipofection with either Diced or Stealth siRNAs for Ku70 or Xrcc4, in duplicate, at various doses, with blank and sham transfections used as controls. Cells were harvested at 0, 24, 48, 72 and 96 h post-transfection for protein determination. The knockdown of specific targeted gene products was quantified by Western blot using GAPDH as control. Transfection of gene-specific siRNA to either Ku70 or Xrcc4 with both Diced and Stealth siRNAs resulted in a down regulation of the targeted proteins to approximately 10 to 20% of control levels 48 h after transfection, with recovery to pre-treatment levels by 96 h. Discussion: By transfecting cells with Diced or chemically synthesized Stealth siRNAs, Ku70 and Xrcc4, two highly expressed proteins in cells, were effectively attenuated, demonstrating the great potential for the use of both siRNA production strategies as tools to perform loss of function experiments in mammalian cells. In fact, down-regulation of Ku70 and Xrcc4 has been shown to reduce the activity of the non-homologous end joining DNA pathway, a very desirable approach for the use of homologous recombination technology for gene targeting or knockout studies. Stealth RNAi (TM) was developed to achieve high specificity and greater stability when compared with mixtures of enzymatically-produced (Diced) siRNA fragments. In this study, both siRNA approaches inhibited the expression of Ku70 and Xrcc4 gene products, with no detectable toxic effects to the cells in culture. However, similar knockdown effects using Diced siRNAs were only attained at concentrations 10-fold higher than with Stealth siRNAs. The application of RNAi technology will expand and continue to provide new insights into gene regulation and as potential applications for new therapies, transgenic animal production and basic research.