The leaves of green plants as well as a cyanobacterium, a red alga, and fungi contain insulin-like antigens

We report the detection of insulin-like antigens in a large range of species utilizing a modified ELISA plate assay and Western blotting. We tested the leaves or aerial parts of species of Rhodophyta (red alga), Bryophyta (mosses), Psilophyta (whisk ferns), Lycopodophyta (club mosses), Sphenopsida (horsetails), gymnosperms, and angiosperms, including monocots and dicots. We also studied species of fungi and a cyanobacterium, Spirulina maxima. The wide distribution of insulin-like antigens, which in some cases present the same electrophoretic mobility as bovine insulin, together with results recently published by us on the amino acid sequence of an insulin isolated from the seed coat of jack bean (Canavalia ensiformis) and from the developing fruits of cowpea (Vigna unguiculata), suggests that pathways depending on this hormone have been conserved through evolution.

Isolation and intracellular localization of insulin-like proteins from leaves of Bauhinia variegata

Evidence based on immunological cross-reactivity and anti-diabetic properties has suggested the presence of insulin-like peptides in plants. The objective of the present study was to investigate the presence of insulin-like proteins in the leaves of Bauhinia variegata ("pata-de-vaca", "mororó"), a plant widely utilized in popular medicine as an anti-diabetic agent. We show that an insulin-like protein was present in the leaves of this plant. A chloroplast protein with a molecular mass similar to that of bovine insulin was extracted from 2-mm thick 15% SDS-PAGE gels and fractionated with a 2 x 24 cm Sephadex G-50 column. The activity of this insulin-like protein (0.48 mg/mL) on serum glucose levels of four-week-old Swiss albino (CF1) diabetic mice was similar to that of commercial swine insulin used as control. Further characterization of this molecule by reverse-phase hydrophobic HPLC chromatographic analysis as well as its antidiabetic activity on alloxan-induced mice showed that it has insulin-like properties. Immunolocalization of the insulin-like protein in the leaves of B. variegata was performed by transmission electron microscopy using a polyclonal anti-insulin human antibody. Localization in the leaf blades revealed that the insulin-like protein is present mainly in chloroplasts where it is also found associated with crystals which may be calcium oxalate. The presence of an insulin-like protein in chloroplasts may indicate its involvement in carbohydrate metabolism. This finding has strengthened our previous results and suggests that insulin-signaling pathways have been conserved through evolution.

Impact of marked weight loss induced by bariatric surgery on bone mineral density and remodeling

Data about the impact of bariatric surgery (BS) and subsequent weight loss on bone are limited. The objective of the present study was to determine bone mineral density (BMD), bone remodeling metabolites and hormones that influence bone trophism in premenopausal women submitted to BS 9.8 months, on average, before the study (OGg, N = 16). The data were compared to those obtained for women of normal weight (CG, N = 11) and for obese women (OG, N = 12). Eight patients in each group were monitored for one year, with the determination of BMD, of serum calcium, phosphorus, magnesium, parathyroid hormone, 25-hydroxyvitamin D, insulin-like growth factor-I (IGF-I) and osteocalcin, and of urinary calcium and deoxypyridinoline. The biochemical determinations were repeated every three months in the longitudinal study and BMD was measured at the end of the study. Parathyroid hormone levels were similar in the three groups. IGF-I levels (CG = 332 ± 62 vs OG = 230 ± 37 vs OGg = 128 ± 19 ng/mL) were significantly lower in the operated patients compared to the non-operated obese women. Only OGg patients presented a significant fall in BMD of 6.2% at L1-L4, of 10.2% in the femoral neck, and of 5.1% in the forearm. These results suggest that the weight loss induced by BS is associated with a significant loss of bone mass even at sites that are not influenced by weight overload, with hormonal factors such as IGF-I being associated with this process.

Response of the growth plate of uremic rats to human growth hormone and corticosteroids

Children with chronic renal failure in general present growth retardation that is aggravated by corticosteroids. We describe here the effects of methylprednisolone (MP) and recombinant human growth hormone (rhGH) on the growth plate (GP) of uremic rats. Uremia was induced by subtotal nephrectomy in 30-day-old rats, followed by 20 IU kg-1 day-1 rhGH (N = 7) or 3 mg kg-1 day-1 MP (N = 7) or 20 IU kg-1 day-1 rhGH + 3 mg kg-1 day-1 MP (N = 7) treatment for 10 days. Control rats with intact renal function were sham-operated and treated with 3 mg kg-1 day-1 MP (N = 7) or vehicle (N = 7). Uremic rats (N = 7) were used as untreated control animals. Structural alterations in the GP and the expression of anti-proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and anti-insulin-like growth factor I (IGF-I) by epiphyseal chondrocytes were evaluated. Uremic MP rats displayed a reduction in the proliferative zone height (59.08 ± 4.54 vs 68.07 ± 7.5 µm, P < 0.05) and modifications in the microarchitecture of the GP. MP and uremia had an additive inhibitory effect on the proliferative activity of GP chondrocytes, lowering the expression of PCNA (19.48 ± 11.13 vs 68.64 ± 7.9% in control, P < 0.0005) and IGF-I (58.53 ± 0.96 vs 84.78 ± 2.93% in control, P < 0.0001), that was counteracted by rhGH. These findings suggest that in uremic rats rhGH therapy improves longitudinal growth by increasing IGF-I synthesis in the GP and by stimulating chondrocyte proliferation.

Beneficial effect of recombinant human growth hormone on the intestinal mucosa barrier of septic rats

The objective of the present study was to investigate the effects of recombinant human growth hormone (rhGH) on the intestinal mucosa barrier of septic rats and explore its possible mechanism. Female Sprague-Dawley rats were randomized into three groups: control, Escherichia coli-induced sepsis (S) and treatment (T) groups. Groups S and T were subdivided into subgroups 1d and 3d, respectively. Expression of liver insulin-like growth factor-1 (IGF-1) mRNA, Bcl-2 and Bax protein levels and the intestinal Bax/Bcl-2 ratio, and plasma GH and IGF-1 levels were determined. Histological examination of the intestine was performed and bacterial translocation was determined. rhGH significantly attenuated intestinal mucosal injuries and bacterial translocation in septic rats, markedly decreased Bax protein levels, inhibited the decrease of Bcl-2 protein expression and maintained the Bax/Bcl-2 ratio in the intestine. rhGH given after sepsis significantly improved levels of plasma GH (T1d: 1.28 ± 0.24; T3d: 2.14 ± 0.48 µg/L vs S1d: 0.74 ± 0.12; S3d: 0.60 ± 0.18 µg/L; P < 0.05) and IGF-1 (T1d: 168.94 ± 65.67; T3d: 201.56 ± 64.98 µg/L vs S1d: 116.72 ± 13.96; S3d: 107.50 ± 23.53 µg/L; P < 0.05) and expression of liver IGF-1 mRNA (T1d: 0.98 ± 0.20; T3d: 1.76 ± 0.17 vs S1d: 0.38 ± 0.09; S3d: 0.46 ± 0.10; P < 0.05). These findings indicate that treatment with rhGH had beneficial effects on the maintenance of the integrity of the intestinal mucosa barrier in septic rats.

Longitudinal evaluation of hepatic osteodystrophy in children and adolescents with chronic cholestatic liver disease

Bone mass loss is a major complication of chronic cholestatic liver disease (CCD). However, the long-term impact of CCD on bone mass acquisition is unknown. We longitudinally assessed bone mineral density (BMD) and factors involved in bone remodeling in 9 children and adolescents with CCD Child-Pugh A (5 boys/4 girls) and in 13 controls (6 boys/7 girls). The groups were evaluated twice, at baseline (T0) and after 3 years (T1), when osteocalcin, deoxypyridinoline, 25-hydroxyvitamin-D, parathyroid hormone, insulin-like growth factor-I (IGF-I), and BMD (L1-L4, proximal femur and total body) were determined. Serum levels of receptor activator for nuclear factor kB ligand (RANKL) and osteoprotegerin were measured only at T1. Lumbar spine BMD was reanalyzed twice: after adjustment for bone age and to compensate for the height factor. Volumetric density was also estimated mathematically in L2-L4. The BMD of L1-L4 was lower in the CCD group (Z-score at T0: control = -1.2 ± 0.8 vs CCD = -2.2 ± 1.4, P < 0.05; T1: control = -0.7 ± 0.8 vs CCD = -2.1 ± 1.1, P < 0.05). Osteocalcin and deoxypyridinoline were similar for the two groups. The CCD group presented lower IGF-I (Z-score at T1: control = 1.4 ± 2.8 vs CCD = -1.5 ± 1.0, P < 0.05) and RANKL (control = 0.465 ± 0.275 vs CCD = 0.195 ± 0.250 pM, P < 0.05) than control. Children with compensated CCD Child-Pugh A showed early impairment of bone acquisition, with the impact being more severe in an initial phase and then tapering in a slowly progressive way. Reduction in endocrine IGF-I has a crucial role in this process.

Cotransfected human chondrocytes: over-expression of IGF-I and SOX9 enhances the synthesis of cartilage matrix components collagen-II and glycosaminoglycans

Damage to cartilage causes a loss of type II collagen (Col-II) and glycosaminoglycans (GAG). To restore the original cartilage architecture, cell factors that stimulate Col-II and GAG production are needed. Insulin-like growth factor I (IGF-I) and transcription factor SOX9are essential for the synthesis of cartilage matrix, chondrocyte proliferation, and phenotype maintenance. We evaluated the combined effect of IGF-I and SOX9 transgene expression on Col-II and GAG production by cultured human articular chondrocytes. Transient transfection and cotransfection were performed using two mammalian expression plasmids (pCMV-SPORT6), one for each transgene. At day 9 post-transfection, the chondrocytes that were over-expressing IGF-I/SOX9 showed 2-fold increased mRNA expression of the Col-II gene, as well as a 57% increase in Col-II protein, whereas type I collagen expression (Col-I) was decreased by 59.3% compared with controls. The production of GAG by these cells increased significantly compared with the controls at day 9 (3.3- vs 1.8-times, an increase of almost 83%). Thus, IGF-I/SOX9 cotransfected chondrocytes may be useful for cell-based articular cartilage therapies.

Intracellular antioxidant and DNA repair enzymes as correlates of stress resistance and longevity in vertebrates

In animals, both stress resistance and longevity appear to be influenced by the insulin/insulin-like growth factor-l signaling (lIS) pathway, the basic organization of which is highly conserved from invertebrates to vertebrates. Reduced lIS or genetic disruption of the lIS pathway leads to the activation of forkhead box transcription factors, which is thought to upregulate the expression of genes involved in enhancing stress resistance, including perhaps key antioxidant enzymes as well as DNA repair enzymes. Enhanced antioxidant and DNA repair capacities may underlie the enhanced cellular stress resistance observed in long-lived animals, however little data is available that directly supports this idea. I used three. experimental approaches to test the association of intracellular antioxidant and DNA base excision repair (BER) capacities with stress resistance and longevity: (1) a comparison of multiple vertebrate endotherm species of varying body masses and longevities; (2) a comparison of long-lived Snell dwarf mice and their normallittermates; and (3) a comparison of hypometabolic animals undergoing hibernation or estivation with their active counterparts. The activities of the five major intracellular antioxidant enzymes as well as the two rate-limiting enzymes in the BER pathway, apurininc/apyrimidinic (AP) endonuclease and polymerase ~, were measured. These measurements were performed in one or more of the following: (1) cultured dermal fibroblasts; (2) brain tissue; (3) heart tissue; (4) liver tissue. My results indicate that antioxidant enzymes are not universally upregulated in association with enhanced stress resistance and longevity. I also did not find that BER enzyme activity was positively correlated with longevity, in an inter-species context, though there was evidence for enhanced BER in long-lived Snell dwarf mice. Thus, while there were instances in which enhanced antioxidant and BER enzyme activities were associated with increased stress resistance and/or longevity, this was not universally the case, indicating that other mechanisms must be involved. These results suggest the need to re-examine existing 'oxidative stress' hypotheses of longevity and probe further into the molecular physiology of longevity to discover its mechanistic basis.

Peptides vasoactifs endogènes dans la prolifération accrue des cellules musculaires lisses vasculaires de rats spontanément hypertendus: rôle des facteurs de croissance.

Contribuant à la pathophysiologie des maladies vasculaires comme dans le cas de l’hypertension, le remodelage vasculaire est associé à une altération de la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) (prolifération, taille, etc.). Or la prolifération des CMLV est augmentée par les peptides vasoactifs tels que l’angiotensine II (AngII) et l’endothéline-1 (ET-1). Ces peptides étant surexprimés lors de l’hypertension, cette étude fut entreprise pour déterminer leur contribution endogène ainsi que celles du facteur de croissance épidermique (EGF), du facteur de croissance insulinique (IGF-1) et du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) à la prolifération accrue des CMLV et aux mécanismes sous-jacents. Des CMLV A-10 et des CMLV de rats WKY et SHR âgés de 12 semaines ont été utilisées pour cette étude. La prolifération cellulaire fut déterminée par incorporation de [3H]thymidine. La phosphorylation de ERK 1/2 et du récepteur de EGF fut déterminée par immunobuvardage. Les CMLV de SHR, comparées à celles de WKY, ont montré une prolifération accrue qui fut atténuée par le losartan, un antagoniste du récepteur AT1 de l’AngII et par le BQ-123 et le BQ-788, antagonistes des récepteurs ETA et ETB de l’ET-1. La prolifération accrue des CMLV de SHR fut ramenée à celle des WKY par les inhibiteurs des récepteurs au PDGF (AG-1295), au IGF-1 (AG-1024) et au EGF (AG-1478). La phosphorylation du récepteur au EGF, accrue dans les CMLV de rats SHR comparée à celle des WKY, fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et l’AG-1478, mais ne fut pas atténuée par l’AG-1295 et l’AG-1024. De plus, la phosphorylation accrue de ERK 1/2 dans les CMLV de rats SHR fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et les inhibiteurs des récepteurs aux facteurs de croissance. Parallèlement, le rôle de la transactivation de EGF-R dans la prolifération accrue induite par AngII et ET-1 fut aussi examiné dans les CMLV A-10. L’augmentation, induite par AngII et ET-1, de la prolifération et de la phosphorylation de ERK 1/2 dans les CMLV A-10 fut ramenée au niveau contrôle par AG-1478. Ces données suggèrent que les peptides vasoactifs endogènes induisent la prolifération accrue des CMLV par la signalisation des MAP kinases résultant de la transactivation de EGF-R.

Role of receptor and non-receptor protein tyrosine kinases in vasoactive peptide-induced signaling

L'endothéline-1 (ET-1) et l'angiotensine II (Ang II) jouent un rôle important dans le maintien de la pression artérielle et l'homéostasie vasculaire. Une activité accrue de ces peptides vasoactifs est présumée contribuer au développement de pathologies vasculaires, telles que l'hypertension, l'athérosclérose, l'hypertrophie et la resténose. Ceci est causé par une activation excessive de plusieurs voies de signalisation hypertrophiques et prolifératives, qui incluent des membres de la famille des Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK), ainsi que la famille phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) / protéine kinase B (PKB). Bien que l'activation de ces voies de signalisation soit bien élucidée, les éléments en amont responsables de l'activation des MAPK et de la PKB, induite par l'ET-1 et Ang II, demeurent mal compris. Durant les dernières années, le concept de la transactivation de récepteurs et/ou non-récepteurs protéines tyrosine kinases (PTK) dans le déclenchement des événements de signalisation induits par les peptides vasoactifs a gagné beaucoup de reconnaissance. Nous avons récemment démontré que la PTK Insulin-like Growth Factor type-1 Receptor (IGF-1R) joue un rôle dans la transduction des signaux induits par l‟H2O2, menant à la phosphorylation de la PKB. Étant donné que les peptides vasoactifs génèrent des espèces réactives d'oxygène, telles que l‟H2O2 lors de leur signalisation, nous avons examiné le rôle de d‟IGF-1R dans la phosphorylation de la PKB et les réponses hypertrophiques dans les cellules muscle lisse vasculaires (CMLV) induites par l'ET-1 et Ang II. AG-1024, un inhibiteur spécifique de l'IGF-1R, a atténué la phosphorylation de la PKB induite à la fois par l'ET-1 et Ang II. Le traitement des CMLVs avec l‟ET-1 et Ang II a également induit une phosphorylation des résidus tyrosine dans les sites d'autophosphorylation d'IGF-1R, celle-ci a été bloquée par l‟AG-1024. En outre, l‟ET-1 et l‟Ang II on tous les deux provoqué la phosphorylation de c-Src, une PTK non-récepteur, bloqué par PP-2, inhibiteur spécifique de la famille Src. La PP-2 a également inhibé la phosphorylation de PKB et d‟IGF-1R induite par l‟ET-1 et l‟Ang II. De plus, la synthèse de protéines ainsi que d‟ADN, marqueurs de la prolifération cellulaire et de l'hypertrophie, ont également été atténuée par l‟AG-1024 et le PP-2. Bien que ce travail démontre le rôle de c-Src dans la phosphorylation PKB induite par l'ET-1 et Ang II, son rôle dans l'activation des MAPK induit par l'ET-1 dans les CMLVs reste controversé. Par conséquent, nous avons examiné l'implication de c-Src dans l'activation de ERK 1/2, JNK et p38MAPK, par l'ET-1 et Ang II, ainsi que leur capacité à régulariser l'expression du facteur de transcription Early growth transcription factor-1 « Egr-1 ». ET-1 et Ang II ont induit la phosphorylation de ERK 1/2, JNK et p38 MAPK, et ont amplifié l'expression d'Egr-1 dans les CMLVs. Cette augmentation de la phosphorylation des MAPK a été diminuée par la PP-2, qui a aussi atténué l'expression d'Egr-1 induite par l'ET-1 et l'Ang II. Une preuve supplémentaire du rôle de c-Src dans ce processus a été obtenue en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en c-Src (Src -/- MEF). L'expression d'Egr-1, ainsi que l'activation des trois MAPKs par l'ET-1 ont été atténuées dans les cellules Src -/- par rapport au MEF exprimant des taux normaux Src. En résumé, ces données suggèrent que l'IGF-1R et c-Src PTK jouent un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation de PKB et des MAPK dans l‟expression d'Egr-1, ainsi que dans les réponses hypertrophiques et prolifératives induites par l'ET-1 et Ang II dans les CMLVs.

La régulation du gène CYP19A1 dans les cellules de granulosa bovine in vitro

L’oestradiol joue un rôle important dans la reproduction en général, particulièrement dans la croissance folliculaire chez la vache. La production de l’œstradiol nécessite l’expression du gène CYP19A1 suite à la stimulation des cellules de granulosa par l’hormone folliculostimulante (FSH) ou le facteur de croissance insulinique de type 1 (IGF-1). Chez la vache, il existe six promoteurs (1.1 ; 1.2 ; 1.3 ; 1.4 ; 1.5 et 2) qui dirigent la transcription du gène CYP19A1 dans les cellules de la granulosa. Le principal promoteur qui dirige la transcription au niveau de l’ovaire (cellules de granulosa) est le promoteur 2 (P2). Cependant, l’effet de la FSH et de l’IGF-1 sur l’activation de ces promoteurs d’aromatase demeure mal connu. De plus, la demi-vie du transcrit CYP19A1 est très courte avec une région 3’UTR relativement longue. L’analyse de la séquence 3’UTR montre la présence des motifs ARE (séquence riche en AU), des études antérieur montrent que ces séquences impliquent dans la régulation de la stabilité ou la dégradation de l’ARNm, ce qui est fort probable que la courte demi-vie de l’ARNm CYP19A1 est sous le contrôle post-transcriptionel. L’objectif de la thèse visait à étudier la régulation de l’expression du gène CYP19A1 chez la vache. Il y a deux thèmes soit étude de la régulation transcriptionnelle ciblant le promoteur et soit étude de la régulation post-transcriptionnelle impliquant la région 3’non traduite (3’UTR). Le premier objectif vise à étudier la régulation transcriptionnelle du gène CYP19A1. Nous avons étudié l'activité du promoteur ovarien bovin dans deux modèles de cellules de la granulosa, les cellules lutéinisées et nonlutéinisées in vitro, suite à une stimulation des cellules par la FSH ou IGF-1. Nous avons également évalué la voie de signalisation impliquée dans la régulation des différents promoteurs en utilisant un RT-PCR et un gène rapporteur (les différents promoteurs d’aromatase ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en amont du gène exprimant la luciférase). Les résultats de RT-PCR démontrent que la FSH et l’IGF-1 augmentent les concentrations d’ARNm provenant des deux promoteurs 2 et 1.1 dans les cellules de la granulosa non lutéinisées. Des expériences subséquentes ont montré que la FSH stimule le promoteur 2 via la voie PKA tandis que l'IGF-1 stimule le promoteur 2 via la voie PKC. La FSH et l’IGF-1 stimulent l’expression du promoteur 1.1 via la voie PI3K. L’analyse de l’activité luciférase démontre que dans les cellules de granulosa lutéinisées, la FSH stimule le promoteur 1.1 de façon dose dépendante et ne semble y avoir aucun effet significatif sur le promoteur 2. Nous avons donc comparé l’activité du promoteur PII/P2 humain, du rat, de la chèvre et de la vache dans les cellules de granulosa bovine lutéinisées. Le résultat le plus significatif est que le promoteur 2 bovine (et caprine) dépend de plusieurs facteurs de transcription (NR5A2, FOXL2) comparé au promoteur PII humain et celui du promoteur proximal du rat qui dépendent principalement de l'AMPc. En effet, nos résultats ont démontré une expression raisonnablement robuste du P2 bovine lorsque les cellules sont traitées à la forskoline, NR5A2 et FOXL2. Le facteur FOXL2 semble déterminer l'activité du promoteur 2 chez le ruminant. Le deuxième objectif vise à étudier la régulation post-transcriptionnelle du gène CYP19A1. Pour ce faire, nous avons déterminé la séquence minimale de l'ARNm CYP19A1 requise pour la régulation de sa demi-vie. Différents séquences de la région 3’UTR ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en aval du gène exprimant la luciférase ou soit dans le vecteur pGEMTeasy. Le vecteur pGL3promoter a été transfecté dans les cellules de granulosa lutéinisées pour évaluer l'impact de la séquence 3'UTR sur l'expression du gène rapporteur de la luciférase, alors que le vecteur pGEMTeasy a été utilisé pour la transcription in vitro afin de générer de l’ARNm. Ce dernier sera utilisé en réaction croisée au UV avec des extraits protéiques pour démontrer l’association du complexe ARNm/protéine. L’analyse de l’activité luciférase a permis d’identifier une séquence de 200 pb située entre 926 et 1134 pb de la région 3'UTR de l’ARNm CYP19A1 qui a réduit significativement l’activité de la luciférase. Selon les analyses de la réaction croisée au UV, une ou plusieurs protéines de 66 et 80 kDA se lient spécifiquement à la séquence de 200 pb qui réduit l’activité de luciférase. Cette protéine s'exprime dans les cellules de granulosa, mais n’a pas été détectée dans d'autres tissus comme le foie et le cœur. Par ailleurs, l’utilisation du gène rapporteur sensible à la FSH a suscité l’intérêt d'une compagnie pharmaceutique qui vend de l’equine chorionic gonadotropin (eCG) pour lui permettre de distinguer facilement l’eCG ayant une forte activité FSH et donc, avoir un produit commercial plus efficace et de meilleure qualité. Dans cette étude, nous avons développé un système de bioessai à la FSH basé sur la transfection des cellules avec un récepteur à la FSH et un gène rapporteur colorimètrique qui permet d’estimer l’activité de la FSH dans le sérum de la jument et qui pourrait être applicable au niveau de la ferme/industrie.

The inflammatory role of angiogenic growth factors : a neutrophil perspective

De par sa présence dans tous les vaisseaux sanguins, l'endothélium joue un rôle clef dans le processus d’hémostase, tant par sa libération de facteurs anticoagulants que par ses changements protéiques qui permettent à l’organisme de déclencher la réparation tissulaire. La fonction anticoagulante de l’endothélium peut être mise en défaut en cas d’atteinte de son intégrité, entrainant la formation de thrombus, le rejet précoce de greffes ou encore l’induction de l’athérosclérose. L’intégrité de l’endothélium est donc capitale pour la prévention de nombreuses maladies cardiovasculaires. Chez l’adulte, les cellules endothéliales (CE), normalement quiescentes, sont rapidement activées en cas d’hypoxie ou d’inflammation, leur permettant ainsi d’amorcer le processus angiogénique comme suit: Tout d’abord, l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire permet l’extravasation des protéines plasmatiques. Ensuite, la dégradation de la lame basale par des métalloprotéases permet aux CE de se détacher, de proliférer, de migrer et de s’organiser pour former l’ébauche du futur vaisseau. La dernière étape consiste en la maturation du vaisseau, c’est-à-dire son recouvrement par des cellules murales, telles que les cellules musculaires lisses et les péricytes. Ces processus sont régulés par de nombreux facteurs angiogéniques tels que les membres de la famille Notch, du vascular endothelial growth factor (VEGF), du fibroblast growth factor (FGF), des angiopoïétines, et des matrix metalloproteases (MMP). L’angiogenèse pathologique, soit une insuffisance ou un excès de vascularisation, est impliquée dans les blessures chroniques, les accidents cardiovasculaires, les pathologies coronariennes artérielles, les pathologies tumorales, l’arthrite rhumatoïde, la rétinopathie diabétique, l’athérosclérose, le psoriasis et l’asthme. Ces pathologies sont souvent issues d’une dérégulation de l’activité endothéliale, fréquemment observée conjointement à l’expression continue de molécules d’adhésion leucocytaires, à l’augmentation de la perméabilité vasculaire, et aux anomalies de la vasoréactivité. L’activation non-contrôlée de l’endothélium entraîne ainsi une inflammation chronique et la formation de structures vasculaires anarchiques. Les premiers leucocytes à répondre à l’appel inflammatoire sont les neutrophiles. Equippées d’une panoplie de produits antibactériens puissants mais aussi nocifs pour les tissus qui les entourent, ces cellules polylobées participent à chaque étape du processus inflammatoire, depuis l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire jusqu’à la résolution. En effet, grâce à leurs récepteurs, les neutrophiles détectent et interprètent les signaux biochimiques présents dans la circulation et à la surface de l’endothélium, et libèrent aussi leurs propres médiateurs tels le VEGF, les MMP, et l’interleukine-8 (IL-8), dont les effets sont à la fois paracrines et autocrines. Existent-ils d’autres modulateurs typiques de la fonction endothéliale capables d’influencer le comportement des neutrophiles? En effet, notre laboratoire a démontré que chez l’humain, une stimulation directe aux angiopoïétines incitait les neutrophiles à adhérer aux CE, à migrer, à synthétiser et à relâcher l’IL-8, voire même à vivre plus longtemps. La présence du récepteur des angiopoïétines, Tie2, à la surface des neutrophiles laisse présager que la famille possèderait d’autres fonctions leucocytaires encore non-identifiées. Par ailleurs, dans un modèle classique de l’angiogenèse in vivo (matrigel), nous avons observé que sous l’effet du FGF1 et 2, les ébauches des nouveaux vaisseaux étaient parfois accompagnées d’une infiltration de cellules granulocytaires. Ainsi, en partant de ces observations, l’objectif de nos études (présentées ci-après) était d’approfondir nos connaissances sur la relation entre neutrophiles et facteurs angiogéniques, notamment les FGF et les angiopoïétines. Par tests in vitro, nous avons confirmé que les neutrophiles humains exprimaient plusieurs récepteurs du FGF (FGFR1-4) d’une façon hétérogène, et qu’ils migraient vers un gradient des ligands FGF1 et 2. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés aux voies de signalisation inflammatoires activées par les ligands FGF1, FGF2, Ang1 et Ang2. Grâce à une stratégie génique ciblant 84 gènes inflammatoires, nous avons identifié plusieurs cibles d’intérêt touchées par Ang1, dont certains membres de la famille de l’IL-1, alors qu’aucun des gènes testés n’avait changé de façon significative sous l’effet des FGF ou d’Ang2. Suite à des cinétiques approfondies, nous avons démontré qu’Ang1 stimulait la transcription de l’ARN messager de l’IL-1β, et augmentait simultanément la quantité de protéine immature (pro-IL-1β; inactive) et clivée (IL-1β « mature »; active). En parallèle, Ang1 augmentait la sécrétion de l’antagoniste naturel de l’IL-1β, l’IL-1RA, sans pour autant stimuler la relâche de l’IL-1β. A l’instar des endotoxines bactériennes dont les effets liés à l’IL-1 dépendaient de la kinase p38, ceux d’Ang1 découlaient presque entièrement des voies de signalisation du p42/44.

Optimization of carbon and nitrogen sources and growth factors for the production of an aquaculture probiotic (Pseudomonas MCCB 103) using response surface methodology

Aim: To develop a new medium for enhanced production of biomass of an aquaculture probiotic Pseudomonas MCCB 103 and its antagonistic phenazine compound, pyocyanin. Methods and Results: Carbon and nitrogen sources and growth factors, such as amino acids and vitamins, were screened initially in a mineral medium for the biomass and antagonistic compound of Pseudomonas MCCB 103. The selected ingredients were further optimized using a full-factorial central composite design of the response surface methodology. The medium optimized as per the model for biomass contained mannitol (20 g l)1), glycerol (20 g l)1), sodium chloride (5 g l)1), urea (3Æ3 g l)1) and mineral salts solution (20 ml l)1), and the one optimized for the antagonistic compound contained mannitol (2 g l)1), glycerol (20 g l)1), sodium chloride (5Æ1 g l)1), urea (3Æ6 g l)1) and mineral salts solution (20 ml l)1). Subsequently, the model was validated experimentally with a biomass increase by 19% and fivefold increase of the antagonistic compound. Conclusion: Significant increase in the biomass and antagonistic compound production could be obtained in the new media. Significance and Impact of the Study: Media formulation and optimization are the primary steps involved in bioprocess technology, an attempt not made so far in the production of aquaculture probiotics.

Optimization of carbon and nitrogen sources and growth factors for the production of an aquaculture probiotic (Pseudomonas MCCB 103) using response surface methodology

Aim: To develop a new medium for enhanced production of biomass of an aquaculture probiotic Pseudomonas MCCB 103 and its antagonistic phenazine compound, pyocyanin. Methods and Results: Carbon and nitrogen sources and growth factors, such as amino acids and vitamins, were screened initially in a mineral medium for the biomass and antagonistic compound of Pseudomonas MCCB 103. The selected ingredients were further optimized using a full-factorial central composite design of the response surface methodology. The medium optimized as per the model for biomass contained mannitol (20 g l)1), glycerol (20 g l)1), sodium chloride (5 g l)1), urea (3Æ3 g l)1) and mineral salts solution (20 ml l)1), and the one optimized for the antagonistic compound contained mannitol (2 g l)1), glycerol (20 g l)1), sodium chloride (5Æ1 g l)1), urea (3Æ6 g l)1) and mineral salts solution (20 ml l)1). Subsequently, the model was validated experimentally with a biomass increase by 19% and fivefold increase of the antagonistic compound. Conclusion: Significant increase in the biomass and antagonistic compound production could be obtained in the new media. Significance and Impact of the Study: Media formulation and optimization are the primary steps involved in bioprocess technology, an attempt not made so far in the production of aquaculture probiotics

Lymphoid organ cell culture system from Penaeus monodon (Fabricius) as a platform for white spot syndrome virus and shrimp immune-related gene expression

Shrimp cell lines are yet to be reported and this restricts the prospects of investigating the associated viral pathogens, especially white spot syndrome virus (WSSV). In this context, development of primary cell cultures from lymphoid organs was standardized. Poly-l-lysine-coated culture vessels enhanced growth of lymphoid cells, while the application of vertebrate growth factors did not, except insulin-like growth factor-1 (IGF-1). Susceptibility of the lymphoid cells to WSSV was confirmed by immunofluoresence assay using monoclonal antibody against the 28 kDa envelope protein of WSSV. Expression of viral and immunerelated genes in WSSV-infected lymphoid cultures could be demonstrated by RT-PCR. This emphasizes the utility of lymphoid primary cell culture as a platform for research in virus–cell interaction, virus morphogenesis, up and downregulation of shrimp immune-related genes, and also for the discovery of novel drugs to combat WSSV in shrimp culture