Hidrólise de resíduos de couro curtido ao cromo

O grande volume de resíduos gerados nos curtumes durante a operação de rebaixamento do couro curtido tem motivado a pesquisa de novas alternativas tecnológicas para tratamento destes resíduos, atualmente dispostos em aterros sanitários controlados. Este trabalho aborda o processo de hidrólise enzimática da serragem de rebaixamento como alternativa de tratamento para este resíduo. Foi utilizada uma enzima do tipo protease de nome comercial Novocor SG. Os fatores controláveis analisados foram a granulometria do resíduo, a concentração de basificante, o tempo de basificação, a concentração de enzima, o tempo de incubação e a temperatura. O processo foi analisado através do emprego de um projeto de experimentos fatorial fracionado para a avaliação dos efeitos dos fatores controláveis e suas interações, buscando-se obter uma solução protéica com baixo teor de cromo. Foi confirmada a possibilidade de hidrólise enzimática da serragem de rebaixamento obtendo-se uma solução protéica com teores de cromo menores do que 0,56 ppm. Este fato demonstra que este processo pode ser empregado como uma alternativa tecnológica para o tratamento da serragem uma vez que a solução protéica obtida possui baixo teor de cromo e a torta de cromo remanescente poderá ser tratada para obtenção de cromo reciclado.

Estudo do papel do estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos submetidos ao modelo experimental de hiperprolinemia tipo II

A hiperprolinemia tipo II é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência severa na atividade da enzima ∆1 – pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, o que resulta em acúmulo tecidual de prolina. Muitos pacientes apresentam manifestações neurológicas como epilepsia e retardo mental. Embora as manifestações neurológicas sejam encontradas em um considerável número de pacientes hiperprolinêmicos, os mecanismos pelos quais estas ocorrem são pouco compreendidos. O estresse oxidativo é um importante processo que vem sendo relatado na patogênese de algumas condições que afetam o sistema nervoso central (SNC), como é o caso das doenças neurodegenerativas, epilepsia e demência. Este fato torna-se facilmente compreensível, visto que o SNC é altamente sensível ao estresse oxidativo, em face do alto consumo de oxigênio; do alto conteúdo lipídico, principalmente de ácidos graxos poliinsaturados, dos altos níveis de ferro e da baixa defesa antioxidante. Considerando que: a) pouco se sabe a respeito dos altos níveis de prolina no SNC, b) a prolina ativa receptores NMDA e é epileptogênica e c) o estresse oxidativo está associado com doenças que afetam o SNC, no presente estudo investigamos os efeitos in vivo e in vitro da prolina sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, como a quimiluminescência, o potencial antioxidante total (TRAP), e sobre as atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa peroxidase (GSH-Px) e superóxido dismutase (SOD) em córtex cerebral de ratos Wistar. Os resultados mostraram que a administração aguda de prolina aumentou significativamente a quimiluminescência e reduziu o TRAP em córtex cerebral de ratos de 10 e 29 dias. Em contraste, a administração crônica de prolina não alterou estes parâmetros. Todavia, a presença de prolina no homogeneizado de córtex cerebral de ratos de 10 e 29 dias aumentou significativamente a quimiluminescência e reduziu o TRAP em concentrações de prolina semelhantes àquelas encontradas nos tecidos de pacientes hiperprolinêmicos (0,5 – 1,0 mM). Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de prolina não alterou as atividades das enzimas GSH-Px e SOD em córtex cerebral de ratos de 10 e 29 dias, mas diminuiu significativamente a atividade da CAT em ratos de 29 dias. Por outro lado, a administração crônica de prolina não alterou a atividade da enzima SOD, mas significativamente aumentou a atividade da CAT e reduziu a atividade da GSH-Px. Em adição, a presença de prolina no homogeneizado de córtex cerebral reduziu significativamente a atividade da SOD em ratos de 10 dias, permanecendo as atividades da CAT e GSH-Px inalteradas. Todavia, as atividades das enzimas antioxidantes não foram alteradas na presença de prolina no homogeneizado de córtex cerebral de ratos de 29 dias. Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que o estresse oxidativo induzido pela prolina pode estar envolvido na disfunção cerebral observada na hiperprolinemia tipo II.

Alterações bioquímicas e comportamentais em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia

A homocistinúria é uma doença metabólica hereditária causada pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase e é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Retardo mental, deficiência cognitiva, isquemia, convulsões e aterosclerose são achados clínicos comuns em pacientes homocistinúricos. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença são pouco conhecidos. Modelos animais experimentais de erros inatos do metabolismo são úteis para compreender a fisiopatologia dessas doenças em humanos. No nosso laboratório, já foram criados alguns modelos animais de algumas doenças metabólicas hereditárias, como, por exemplo, fenilcetonúria e hiperprolinemia tipo II. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Essa enzima é inibida por radicais livres e sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. A diminuição de energia cerebral e o estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças que afetam o sistema nervoso central, como as doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington e isquemia cerebral. Por outro lado, a homocisteína tem sido considerada um fator de risco para o aparecimento dessas doenças. No sentido de ampliar o conhecimento das alterações bioquímicas envolvidas na gênese da disfunção neurológica característica da homocistinúria, esse trabalho teve como principal objetivo desenvolver um modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia em ratos. Utilizando esse modelo, verificamos a atividade da Na+,K+-ATPase e alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) em hipocampo de ratos. A aprendizagem e a memória na tarefa do labirinto aquático de Morris foram avaliadas em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia. Nesse trabalho, também estudamos o efeito in vitro dos metabólitos acumulados na homocistinúria, homocisteína e metionina, sobre a atividade da Na+,K+-ATPase e sobre alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividade da enzima citocromo c oxidase). Além disso, o efeito in vitro da homocisteína sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo (potencial antioxidante total (TRAP), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase) em hipocampo de ratos foi investigado. O tratamento crônico foi realizado do 6o ao 28o dia de vida, através de administrações subcutâneas de homocisteína, duas vezes ao dia, com intervalos de 8 horas. As doses de homocisteína administradas foram escolhidas com o objetivo de induzir concentrações plasmáticas de 0,4 a 0,5 mM, semelhantes àquelas encontradas em pacientes homocistinúricos. Através desse tratamento, também foram induzidas concentrações elevadas de homocisteína no cérebro de ratos. Os controles receberam solução salina em volumes semelhantes. Os resultados mostram que a administração crônica de homocisteína inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica, a produção de CO2 e a captação de glicose, assim como as atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase em hipocampo de ratos. Os animas tratados com homocisteína também apresentaram diminuição de memória na tarefa do labirinto aquático de Morris. Além disso, a homocisteína e a metionina inibiram a atividade da Na+,K+-ATPase de hipocampo de ratos in vitro. Estudos cinéticos sobre a inibição da Na+,K+-ATPase, causada pela homocisteína, também foram realizados. Os resultados mostraram que a homocisteína inibe a enzima de forma não-competitiva com o ATP como substrato. Também foi verificado que a incubação de homogeneizados de hipocampo com homocisteína diminuiu a atividade da Na+,K+-ATPase e que a incubação simultânea com alguns antioxidantes, tais como glutationa, ditiotreitol, cisteína e a enzima antioxidante superóxido dismutase preveniram esse efeito. Os metabólitos acumulados na homocistinúria também alteraram alguns parâmetros de metabolismo energético cerebral (produção de CO2 e lactato, captação de glicose e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) in vitro. Além disso, verificou-se que a homocisteína in vitro diminuiu o TRAP e aumentou a quantidade de TBARS, um marcador de lipoperoxidação, mas não alterou as atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase. Os achados sugerem que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase, a diminuição do metabolismo energético e o aumento do estresse oxidativo podem estar relacionados com as disfunções neurológicas características dos pacientes homocistinúricos.

O envolvimento do marcador inflamatório Heme Oxigenêse-1 na carciinogênese experimental de esôfago

Sabe-se que o refluxo crônico pode induzir lesão mucosa, estimular a proliferação de células e promover tumorigênese no esôfago distal. Ainda não é sabido por que apenas uma parcela dos pacientes com refluxo esofágico progrediram para uma metaplasia intestinal (Esôfago de Barrett) e adenocarcinoma. O estresse oxidativo parece exercer um papel importante nessa progressão . Assim sendo, examinamos o padrão de expressão da enzima Heme Oxigenase-1 (HO-1), enzima indutora do estresse oxidativo, em peças de esôfago obtidos de um estudo experimental com ratos que avaliou o papel do refluxo gástrico e duodenoesofágico na carcinogênese esofágica. Métodos: Uma amostra de três (3) peças de esôfago de cada grupo de ratos submetidos a tratamentos diferentes tiveram a expressão da enzima Heme Oxigenase-1 avaliada através de imunohistoquímica. Os ratos foram divididos nos seguintes grupos: (1) cardioplastia para induzir refluxo predominantemente gástrico, (2) anastomose esofagoduodenal para induzir refluxo duodenal, (3) sem tratamento, (4) cardioplastia+dietilnitrosamina (DEN), (5) anastomose esofagoduodenal +DEN, (6) DEN. Resultados: Não houve desenvolvimento de câncer ou metaplasia intestinal nos animais que não foram expostos ao refluxo de conteúdo duodenal. A expressão de HO-1 foi observada apenas em ratos submetidos à anastomose esofagoduodenal (Grupos 2 e 5) e a análise da média de intensidade de fluorescência demonstrou uma diferença significante de expressão de HO-1 (4,8 e 4,6 vezes respectivamente) comparando-se ao controle (Grupo 3) (p<0,05). O alvo principal para expressão da HO-1 foram as células inflamatórias dentro do tumor ou em áreas subepiteleiais. Os ratos expostos ao refluxo gástrico não desenvolveram tumores ou expressaram a HO-1. Conclusões: A esofagite de refluxo induzida por refluxo esofágico com conteúdo duodenal provocou estresse oxidativo considerável e pode desempenhar um papel importante na carcinogênese esofágica. O refluxo gástrico não foi suficiente para induzir estresse oxidativo neste modelo experimental.

Efeito in vitro de quinureninas sobre parâmetros bioquímicos do metabolismo enrgético em cérebro de ratos jovens

A via das quinureninas é a principal rota de degradação do aminoácido triptofano. Os metabólitos dessa via, comumente chamados de quinureninas, estão envolvidos em vários processos fisiológicos e patológicos e, recentemente, algumas quinureninas foram relacionadas à fisiopatologia de várias doenças neurodegenerativas. Tendo em vista o pouco conhecimento a respeito do efeito das quinureninas sobre o metabolismo energético cerebral, e considerando que as concentrações de algumas quinureninas estão alteradas em várias doenças neurodegenerativas e que disfunção mitocondrial é uma importante característica dessas doenças, este trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro de alguns metabólitos da via das quinureninas, particularmente L-quinurenina, ácido quinurênico, 3-hidroxiquinurenina, ácido 3-hidroxi-antranílico, ácido antranílico e ácido quinolínico sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Verificamos que todas as quinureninas testadas, à exceção da L-quinurenina, aumentaram a captação de glicose e inibiram a produção de CO2 a partir de glicose, acetato e citrato em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Além disso, o ácido quinurênico inibiu a atividade da enzima sucinato desidrogenase, a 3-hidroxiquinurenina inibiu a atividade dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória, enquanto que o ácido 3-hidroxi-antranílico inibiu as atividades dos complexos I e II da cadeia respiratória e da enzima sucinato desidrogenase. Já o ácido antranílico inibiu as atividades do complexo I-III da cadeia respiratória e da enzima sucinato desidrogenase. Por outro lado, o ácido quinolínico inibiu apenas a atividade do complexo II, sem alterar as atividades dos outros complexos da cadeia transportadora de elétrons. Finalmente, observamos que nenhuma das substâncias testadas interferiu na atividade da enzima Na+,K+-ATPase. Esses resultados sugerem um bloqueio no ciclo do ácido cítrico, o qual poderia ser provocado pela inibição da cadeia respiratória ocasionada pelos metabólitos testados. Portanto nossos resultados sugerem que o metabolismo energético cerebral é inibido in vitro por algumas quinureninas. Caso esses achados se confirmem in vivo, é possível que um prejuízo no metabolismo energético possa colaborar, ao menos em parte, para o comprometimento cerebral dos pacientes afetados por doenças em que há alteração nas concentrações desses compostos.

Avaliação epidemiológica da triagem neonatal para fenilcetonúria no Rio Grande do Sul - 1986-2003 : um estudo de coorte

A fenilcetonúria clássica (PKU), que afeta 1: 10.000 nascimentos em populações caucasianas, é um erro inato do metabolismo determinado pela deficiência da enzima hepática fenilalaninahidroxilase (PAH), com o conseqüente bloqueio na conversão de fenilalanina (Phe) em Tirosina (Tyr) e aumento da concentração plasmática de Phe. A PKU foi descrita há 70 anos pelo médico norueguês Asbjörn Folling. Desde então muitas foram as descobertas a seu respeito, como a caracterização e mapeamento do seu gene, a identificação de mutações, a determinação da estrutura da enzima, características clínicas e bioquímicas dos afetados, correlações genótipo-fenótipo, a identificação do risco teratogênico quando da condição materna, o estabelecimento da triagem neonatal e ainda o seu tratamento. Se não diagnosticada e tratada precocemente, a PKU causa retardo mental, microcefalia, espasmos infantis, odor de rato na urina e hipopigmentação de pele, cabelos e olhos, além de outros sinais e sintomas. Com o objetivo de identificar a população submetida à triagem neonatal no Rio Grande do Sul (Brasil), a incidência de Fenilcetonúria e de outras hiperfenilalaninemias e correlacionar época do diagnóstico, início do tratamento e desfecho clínico, elaborou-se este estudo delineado como uma coorte ambispectiva que avaliou 54 pacientes fenilcetonúricos entre 6 meses a 16 anos de idade. Foram realizadas entrevistas telefônicas com os responsáveis indagando-se alguns dados demográficos e outros relativos à patologia. Crianças de 6 meses a 7 anos foram avaliadas com relação aos marcos do DNPM. Acima dessa idade, foram investigados sobre escolaridade e presença de sintomas neurológicos. Após análise estatística e estratificação da amostra por ano de nascimento, não se observou uma tendência histórica do diagnóstico ter se tornado mais precoce ou de o controle laboratorial ter se tornado melhor com o passar dos anos. Foi encontrada associação entre o controle de Phe e a cognição, mas não a entre a idade do diagnóstico e a evolução clínica.

Estudo dos efeitos do ATP extracelular e das ecto-nucleotidases no crescimento de gliomas

Glioblastomas são a forma mais comum de tumores cerebrais primários e, apesar do tratamento, os pacientes com estes tumores têm um prognóstico muito ruim. Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e também a adenosina possuem muitas funções importantes em condições fisiológicas e patológicas em vários organismos. O ATP é uma importante molécula sinalizadora no SNC, e os nucleotídeos e nucleosídeos podem induzir a proliferação de linhagens celulares de gliomas. Na invasão dos gliomas dois mecanismos podem liberar ATP: a morte excitotóxica do tecido adjacente e a lesão causada pela ressecção do tumor, que é o tratamento de primeira linha nestes casos. Neste estudo foram observados os efeitos do ATP extracelular na citotoxicidade em linhagens celulares de glioma humano U138 e na linhagem C6 de ratos, comparado com culturas organotícias de hipocampo. A citotoxicidade do ATP (0.1mM, 0.5mM, 5mM) foi medida usando os ensaios de incorporação de iodeto de propídeo e ensaio da lactato desidrogenase. O ensaio de caspases foi realizado para identificar à morte apoptótica. Os resultados mostraram que as células de gliomas apresentam resistência a morte induzida pelo ATP quando comparados com o tecido normal. Altas concentrações de ATP (5mM) induziram à morte celular após 24 h de tratamento em culturas organotípicas, mas não nas linhagens de gliomas estudados. Os nucleotídeos são hidrolisados muito lentamente pelas linhagens de gliomas, o que foi confirmado pela baixa expressão das enzimas NTPDases quando comparado com astrócitos. Portanto, para testar o papel do ATP extracelular no mecanismo de implante e crescimento dos gliomas, um milhão destas células de gliomas foram injetadas em 3µl de DMEM no estriado direito de ratos Wistar, e foi testada a co-injeção da enzima apirase no tratamento dos gliomas implantados. Após 20 dias, os ratos foram mortos e o cérebro foi seccionado e corado com hematoxilina e eosina. Nossos resultados mostraram que os ratos que sofreram co-injeção de apirase tiveram uma redução significativa no tamanho do tumor e menor índice mitótico (p<0,05), bem como menor imunodetecção para Ki67, VEGF e CD31 quando comparado com os grupos controle e controle apirase. A medida da hidrólise enzimática dos nucleotídeos no soro pode contribuir no diagnóstico de lesão celular em muitas condições patológicas. Com o objetivo de avaliar a atividade enzimática da ATPase, ADPase e AMPase in vivo, amostras de soro foram coletadas vinte dias após o implante dos gliomas em ratos. Os ratos com indução de gliomas mostraram um aumento significativo na hidrólise de ATP, ADP e AMP quando comparado com os respectivos controles. O tratamento com o fármaco temozolomida e com 10% dimetil sulfoxida diminuiu a hidrólise dos nucleotídeos. Nenhum dos animais incluídos neste trabalho apresentaram alterações significativas na atividade das enzimas alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e fosfatase alcalina. Nossos dados indicam que o ATP pode ter uma função importante no crescimento do glioma, pois quando liberado pode induzir a morte celular do tecido normal ao redor do tumor, abrindo espaço para o rápido crescimento e invasão do tumor. As avaliações da hidrólise dos nucleotídeos da adenina no soro podem ajudar no acompanhamento da progressão dos tumores cerebrais.

Efeito das prostaglandinas ciclopentenônicas sobre a expressão gênica do fator nuclear PPAR-γ, do receptor de scavenger CD36 e proteínas de apoptose em macrófagos : implicações para a fisiopatologia da aterosclerose

Considerando que as doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade e morbidade em países ocidentais, a aterosclerose se destaca pelo fato de predispor os pacientes ao infarto do miocárdio, a acidentes vasculares cerebrais e a doenças vasculares periféricas. Neste contexto, a oxidação de lipoproteínas do plasma, particularmente LDL, é um dos fatores de risco para eventos cardiovasculares, pois é reconhecida e internalizada por macrófagos, ocasionando a sua diferenciação em foam cells. Diversos fatores participam deste processo de diferenciação, como a expressão de receptores de scavenger CD 36, proporcionando aumento na captação de LDL oxidada, aumento na síntese endógena de colesterol e ativação de fatores nucleares que iniciam a transcrição de proteínas específicas e fatores de crescimento que disparam a aterogênese. Os fenômenos celulares relacionados à apoptose também são de especial importância, tanto no desenvolvimento da lesão aterosclerótica como na estabilidade da placa e formação de trombos. As prostaglandinas (PGs) ciclopentenônicas (CP-PGs), em particular a PGA2 e a 15-desóxi-∆12,14-PGJ2 são uma classe especial de PGs que, em diminutas concentrações, disparam a expressão das proteínas de choque térmico (hsp), que são citoprotetoras. Além disso, CP-PGs bloqueiam a ativação do fator nuclear pró-inflamatório NF-κB tornando-as potentes agentes antiinflamatórios. Embora as PGs das famílias A e J guardem uma série de características em comum, a 15-desóxi-∆12,14- PGJ2 é o ligante fisiológico do fator nuclear pró-aterogênico PPAR-γ, enquanto as PGs da família A ativam apenas a via citoprotetora das hsp. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das CP-PGs sobre a expressão gênica de fatores relacionados à diferenciação de macrófagos em foam cells, bem como proteínas reguladoras do processo de apoptose, em células da linhagem pró-monocítica humana U937. Para tal, as células foram tratadas com CPPGs em presença e/ou ausência de LDL nat e LDL ox, o RNA foi extraído para a realização de RT-PCR para PPAR-γ, CD 36, HMG-CoA redutase e proteínas de apoptose Caspase 3, p53 e Bcl-xL. O tratamento estatístico utilizado foi análise de variância (ANOVA one-way) e teste “t” de student, com resultados expressos como médias + desvios-padrão da média, com P<0,05. Os resultados obtidos demontraram que as CP-PGs PGA2 (20µM-24h) e PGJ2 (1,5µM-24h) inibiram a expressão gênica do fator nuclear PPAR- γ (64 % (PGA2), 88 % (15- d-PGJ2)) nas células U937, em presença de LDL oxidada, quando comparado ao controle. PGA2 inibiu a expressão de HMG-CoA redutase (33 %), enzima chave da síntese de colesterol intracelular, e o tratamento com as CP-PGs também inibiu a apoptose nas células tratadas em presença de LDL oxidada. Os dados sugerem que as CP-PGs apresentam grande potencial para o tratamento da aterosclerose, já que, além de apresentarem efeito antiinflamatório, inibem a expressão do fator nuclear pró-aterogênico PPAR-γ, do receptor de scavenger CD36 (apenas a 15-desóxi-∆12,14-PGJ2) e da enzima HMG-CoA redutase. O bloqueio da apoptose nas células estudadas pode estar relacionado à citoproteção oferecida por estas PGs. Embora investigações in vivo deste laboratório tenham mostrado a eficácia do tratamento com CP-PGs em camundongos portadores de aterosclerose, estudos adicionais são necessários para esclarecer-se o efeito antiaterogênico das mesmas.

Padrões de atividade da ornitina decarboxilase (ODC) e sua regulação hormonal sob estresse de temperatura em Anastrepha fraterculus (Diptera, Tephritidae)

Ornitina decarboxilase (ODC) (EC 4.1.1.17) é a primeira enzima que desencadeia a síntese das poliaminas putrescina, espermidina e espermina nas células. As poliaminas são cátions alifáticos envolvidos no controle de crescimento e são requeridas para uma variedade de eventos biológicos como síntese de proteína, replicação do DNA e divisão celular. No presente estudo, a atividade da ODC foi medida em ovo, larva, pupa, fêmea jovem e adulta de Anastrepha fraterculus. Durante o desenvolvimento de A. fraterculus, a atividade da ODC apresentou flutuações. Entre os estágios anteriores à emergência, o ovo teve a mais alta atividade específica, provavelmente devido à embriogênese que é caracterizada pela alta taxa de divisão celular. A atividade da ODC foi também altamente significativa em ovários e corpo gorduroso de fêmeas jovens possivelmente devido ao avanço da oogênese e vitelogênese. Parâmetros cinéticos (Km app e Vmax) para atividade da ODC foram determinados em pupa, larva e ovário de fêmeas jovens e apresentaram grande variação. A guanosina trifosfato (GTP) demonstrou afetar grandemente estes parâmetros cinéticos, sugerindo estarem ocorrendo modificações pós-traducionais. Fêmeas jovens (4 dias) de A. fraterculus também foram analisadas quanto ao efeito do estresse de temperatura (6ºC e 20/6ºC) e da aplicação tópica do hormônio juvenil isolados ou em conjunto. . Os principais resultados foram que a concentração de 500 ng e os tempos de incubação de 3, 7 e 18 horas aumentaram a atividade da ODC. As fêmeas mantidas a 6ºC e 20/6ºC tiveram atividade da ODC mais alta do que as fêmeas mantidas a 25ºC. O tempo de incubação de 1 hora com o HJ aumentou a atividade da ODC no tratamento de 6ºC, quando comparado com fêmeas mantidas apenas com o estresse de temperatura sem a adição do hormônio (controle). No entanto, no tratamento das fêmeas mantidas a 20/6ºC, somente os tempos de 3 e 18 horas de incubação com o HJ demonstraram aumento na atividade da ODC quando comparadas com o tempo de incubação de 1 hora e com as fêmeas mantidas sem a adição do hormônio (controle). Os machos não apresentaram diferença na atividade da ODC quando submetidos ao estresse de temperatura de 6ºC, mas as medidas do apódema ejaculatório foram maiores a 25ºC que a 6ºC. Estes resultados podem ser considerados como parte de um processo adaptativo a mudanças ambientais. Por último, observamos que as medidas dos ovários (comprimento e largura) de fêmeas jovens mantidas com o inibidor da ODC, -difluormetilornitina (-DFMO; 50mM) são diferentes significativamente quando comparadas com às medidas das fêmeas controle sem o inibidor. O conjunto desses resultados indica a importância da relação entre ODC, HJ e estresse de temperatura para a A. fraterculus. Como esta mosca é uma das piores pragas para a fruticultura brasileira, estes dados, além de contribuírem para um maior conhecimento de sua biologia básica, poderão também ser usados para a escolha de melhores estratégias de controle populacional.

Efeito in vitro dos ácidos 2-metilacetoacético e 2-metil-3-hidroxibutírico sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens

As deficiências da β-cetotiolase mitocondrial e da 2-metil-3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (MHBD) são erros inatos do catabolismo da isoleucina. Os pacientes afetados pela deficiência da β-cetotiolase apresentam crises agudas de cetose e acidose metabólica, podendo apresentar convulsões que podem evoluir ao coma e morte. Bioquimicamente, são caracterizados por excreção urinária aumentada de ácido 2-metilacetoacético (MAA), 2-metil-3-hidroxibutírico (MHB) e tiglilglicina (TG). Alguns indivíduos apresentam acidemia láctica durante as crises de descompensação metabólica. Por outro lado, os indivíduos afetados pela deficiência da MHBD são caracterizados por retardo mental, convulsões e acidose láctica severa, apresentando excreção urinária aumentada de MHB e TG. O aumento do ácido láctico em ambas as enfermidades sugere um comprometimento do metabolismo energético. Tendo em vista que os mecanismos fisiopatogênicos de ambas desordens são totalmente desconhecidos e que os achados bioquímicos sugerem um déficit na produção de energia dos pacientes, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro do MAA e do MHB sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que o MAA inibiu a produção de CO2 a partir de glicose, acetato e citrato, indicando um bloqueio do ciclo do ácido cítrico. Em adição, o complexo II da cadeia respiratória bem como a enzima succinato desidrogenase foram inibidos na presença do MAA. Portanto, é possível que a inibição da cadeia respiratória tenha levado à inibição secundária do ciclo de Krebs. As enzimas Na+,K+-ATPase e creatina quinase (CK) não foram afetadas pelo MAA. O MHB inibiu a produção de CO2 a partir dos três substratos testados bem como o complexo IV da cadeia respiratória, sugerindo que a inibição da cadeia respiratória tenha levado à inibição da produção CO2 pelo ciclo de Krebs. A enzima Na+,K+- ATPase não foi afetada pelo ácido. No entanto, o MHB inibiu a atividade total da CK às custas da CK mitocondrial (mi-CK). A presença do inibidor da enzima óxido nítrico sintase L-NAME e do antioxidante glutationa reduzida (GSH) preveniram a inibição da atividade total da CK, enquanto que a GSH preveniu a inibição da mi-CK, sugerindo que os efeitos do MHB sobre a CK estejam relacionados à oxidação de grupamentos tióis essenciais à atividade enzimática. Tais resultados sugerem que o metabolismo energético cerebral é inibido in vitro pelo MAA e pelo MHB. Caso estes achados se confirmem nas deficiências da β-cetotiolase e da MHBD, é possível que um prejuízo no metabolismo energético causado pelo acúmulo destes metabólitos possa explicar, ao menos em parte, o dano neurológico encontrado nos pacientes portadores destas doenças.

Efeito in vitro do guanidino acetato sobre as atividades da Na+, K+-ATPase e da acetilcolinesterase em cérebro de ratos jovens

A deficiência de guanidino acetato metiltransferase (GAMT) é um erro inato do metabolismo da creatina caracterizado por hipotonia muscular, movimentos extrapiramidais involuntários e epilepsia. A doença é bioquimicamente caracterizada por acúmulo de guanidino acetato e deficiência de creatina e fosfocreatina nos tecidos dos pacientes afetados. Os mecanismos de disfunção neurológica que ocorrem nessa doença ainda são desconhecidos. A Na+,K+-ATPase desempenha um papel fundamental no sistema nervoso central (SNC), sendo responsável pela manutenção dos gradientes iônicos e pela propagação do impulso nervoso, consumindo cerca de 50% do ATP formado no cérebro. A acetilcolinesterase (AChE) é uma importante enzima regulatória que controla a transmissão de impulsos nervosos através de sinapses colinérgicas pela hidrólise da acetilcolina, e apresenta um papel fundamental na cognição. Com o propósito de ampliar o conhecimento sobre os mecanismos fisiopatológicos da deficiência de GAMT, esse trabalho teve como objetivo investigar o efeito do guanidino acetato, o principal metabólito acumulado na deficiência de GAMT, sobre as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e AChE em estriado de ratos. A cinética de inibição da Na+,K+-ATPase causada pelo guanidino acetato também foi estudada. Além disso, investigamos o efeito in vitro do guanidino acetato sobre as atividades da Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e da AChE de hipocampo de ratos. Nossos resultados mostraram que o guanidino acetato não altera as atividades da AChE e Mg2+-ATPase. No entanto, a atividade da Na+,K+-ATPase foi inibida por esse composto guanidínico (CG), e a análise cinética mostrou uma inibição do tipo acompetitiva. Também foi demonstrada uma interação entre o guanidino acetato e o ácido arginínico, sugerindo um sítio comum de ligação entre esses dois compostos na Na+,K+-ATPase. Os resultados mostraram que, o guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase in vitro mas não alterou as atividades da Mg2+-ATPase e da AChE. Considerando que o guanidino acetato e outros compostos guanidínicos (CG) induzem a formação de espécies reativas de oxigênio e que a Na+,K+-ATPase e a AChE são inibidas por radicais livres, estudamos o efeito da pré-incubação de homogeneizado de hipocampo de ratos na presença de guanidino acetato sobre a atividade dessas enzimas. Além disso, o efeito da pré-incubação de homogeneizado de ratos com guanidino acetato foi investigado na presença e ausência de antioxidantes, tais como glutationa (GSH), trolox, taurina e L-NAME. A pré-incubação de homogeneizado de hipocampos na presença de guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase, mas não alterou a atividade da Mg2+-ATPase. No entanto, L-NAME e taurina foram capazes de prevenir tal efeito. Dessa forma, propõem-se que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase pelo guanidino acetato seja um dos mecanismos envolvidos na disfunção neuronal observada em pacientes com deficiência de GAMT.

Efeito in vitro das substâncias acumuladas na doença de Lesch-Nyhan sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em estriado de ratos

A doença de Lesch-Nyhan é um erro inato do metabolismo das purinas caracterizado pela deficiência na enzima hipoxantina- guanina fosforibosiltransferase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de hipoxantina, xantina e ácido úrico. A doença caracteriza-se por hiperuricemia, variado grau de retardo mental e motor, espasticidade e auto-mutilação. No sistema nervoso central, a Na+, K+ - ATPase é responsável pela manutenção da homeostase dos íons Na+ e K+, regulando o volume celular, a excitabilidade neuronal, o transporte de neurotransmissores e outras moléculas. Evidências na literatura demonstram que a redução na atividade da Na+, K+ - ATPase está relacionada com diversas doenças neurodegenerativas, tais como isquemia cerebral e doenças de Parkinson e de Alzheimer. No presente estudo, investigamos o efeito in vitro da hipoxantina, xantina e ácido úrico sobre a atividade da Na+, K+- ATPase em membrana plasmática sináptica de estriado de ratos. Estudamos, também, a cinética de inibição causada pela hipoxantina e de interação entre hipoxantina, xantina e ácido úrico. Nossos resultados demonstram que hipoxantina, xantina e ácido úrico inibem significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. O estudo dos mecanismos de inibição da atividade enzimática causados pela hipoxantina demonstrou um efeito inibitório não competitivo com o substrato ATP. Além disso, o estudo de interação cinética entre hipoxantina, xantina e ácido úrico sugere que esses compostos atuem em um mesmo sítio de ligação na enzima. Verificamos, também, o efeito da preincubação de homogeneizado de estriado de ratos na presença de hipoxantina (10 µM) sobre a atividade da Na+, K+- ATPase de membrana plasmática sináptica com a adição ou não de antioxidantes (glutationa e trolox), bem como alguns parâmetros de estresse oxidativo denominados TBARS (medida de lipoperoxidação) e TRAP (capacidade antioxidante tecidual não-enzimática) no intuito de verificar a participação do estresse oxidativo nos mecanismos de inibição enzimática provocados pela hipoxantina. Os resultados monstraram que a hipoxantina inibe significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. Adicionalmente, nossos resultados demonstraram que glutationa, mas não o trolox, na concentração de 1 mM, foi capaz de prevenir a inibição enzimática causada pela hipoxantina. Nossos resultados também mostraram que a hipoxantina, na mesma concentração, aumentou TBARS e diminuiu TRAP que essa substância induz o estresse oxidativo. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais as oxipurinas são neurotóxicas. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes portadores da doença de Lesch-Nyhan.

Validação de questionário específico para refluxo gastroesofágico em pacientes com tosse crônica

O refluxo gastresofágico (RGE) constitui entidade clínica reconhecida na literatura médica atual, sendo associado a uma variedade de sintomas respiratórios, entre os quais inclui-se tosse crônica. Foram analisados prospectivamente 68 pacientes de ambos os sexos com queixas de tosse crônica (mais de 3 semanas). Realizou-se um questionário desenvolvido na Clínica da Tosse do Pavi¬lhão Pereira Filho da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, contendo dez questões sobre hiper-reatividade brônquica, dez sobre sinusopatia, quinze sobre refluxo gastresofágico, dez sobre rinite, duas sobre bronquiectasias, três sobre etiologia psicogênica e uma relacionada ao uso de inibidor da enzima conver¬sora da angiotensina (ECA). As questões utilizadas no estudo foram somente 15 que abrangem os mais freqüentes sinais e sintomas característicos do RGE, adotando como padrão áureo do diagnóstico a pHmetria esofágica de 24 horas (doravante citada como pHmetria). As manifestações clínicas mais freqüentes foram: rouquidão em 46 pacien¬tes (67,6%), azia em 42 (61,8%), piora da tosse após as refeições em 38 (55,9%), regur¬gitação em 34 (50,0%), eructação em 32 (47,8) e dor no peito em 25 (42,6%). A pHmetria foi realizada em 68 pacientes, sendo positiva em 55 (80,9%) e negativa em 13 (19,1%). A avaliação dos resultados permitiu concluir que o questionário aplicado revelou que o conjunto das manifestações clínicas mostrou-se bom preditor de pro¬babilidade quanto ao RGE, medido à pHmetria. A análise particularizada para cada quesito, entretanto, revelou que as manifestações isoladamente não se mostraram significativas, com exceção de náuseas, gases e eructação. Dos 13 pacientes com pHmetria esofágica normal, o questionário, analisa¬do pelo modelo de regressão logística classificou corretamente 7 pacientes (53,8%) deles. Dos 55 pacientes com pHmetria esofágica positiva, ou, em última análise, com presença de RGE, 53 pacientes (96,4%) foram corretamente classificados pela análise de regressão logística atra¬vés das manifestações clínicas do questionário. O rendimento do questionário mostrou associação significativa entre sin¬tomas clínicos de RGE e a probabilidade de o teste de pHmetria ser positivo. Portanto, na ausência deste equipamento, em pacientes com tosse crônica, é sugerida a aplicação do questionário, pois em apenas 8 pacientes (11,7%) da amos¬tra as pergun¬tas do questionário, analisadas segundo o modelo de regressão logísti¬ca, não foram boas preditoras da presença ou ausência de RGE.

Alterações urinárias assintomáticas em portadores do anticorpo para virus da hepatite C

Vários estudos associam a infecção crônica pelo vírus da hepatite C a manifestação extra-hepáticas incluindo glomerulonefrite membranoproliferativa. A prevalência de anormalidades urinárias associadas a esta infecção ainda é controversa. Este trabalho tem por objetivo investigar a prevalência de alterações urinárias assintomáticas em doadores de sangue com anti VHC positivo. No período de Julho de 1997 a Março de 1998 foram avaliados 58 doadores de sangue anti VHC + (41 homens e 17 mulheres; com idade média de 34 anos) e 128 doadores VHC -, considerado grupo controle (93 homens e 35 mulheres; com idade média de 31 anos). Todos foram questionados quanto à história prévia de doenças sistêmicas, do trato urinário, uso de drogas (incluindo AINE e uso de analgésico ), transfusão de sangue, fumo e uso de álcool. O anti VHC foi medido pela técnica de enzima imunoensaio, de segunda geração (Abbot Laboratories). As amostras de urina foram inicialmente rastreadas utilizando-se fitas Combur 10 (Boehringer). A microalbuminuria foi medida pela imunoturbidimetria (Bayer, kit 6813) e a NAG foi medida pela técnica de espectrofotometria ( SIGMA N 9376 ). Hematúria assintomática foi definida como > 5 hemácias no sedimento urinário, proteinúria com o aparecimento de 1+ na fita reagente; cilindrúria quando foi visualizado qualquer tipo de cilindro; microalbuminúria alterada quando foi >16 mg/l; relação microalbuminúria/creatininúria elevada quando >15mg/g e a NAG urinária elevada, quando os valores estavam > 5,6U/g de creatinina na urina. Na análise estatística utilizou-se um nível de significância de 95% (p=0,05). Verificou-se que a cor branca e o sexo masculino predominaram nos dois grupos, o grupo VHC + apresentou uma freqüência significativamente aumentada em relação ao uso de AINE (p= 0,003), álcool p< 0,001), transfusão (p= 0,006) e drogas (p< 0,001) quando comparado ao grupo VHC -. No grupo VHC + as enzimas hepáticas estavam significativamente mais elevadas (AST p=0,004, ALT p< 0,001), assim como as médias de GGT (p= 0,004). Concluímos que o grupo anti VHC + em estudo não apresenta anormalidades urinárias significativas comparativamente com o grupo controle. A prevalência de hematúria e proteinúria nos grupos VHC + e VHC – foi respectivamente 12,0% x 9,4% e 5,4% x 5,5%, sem diferença estatística entre os dois grupos. As médias da microalbuminúria nos dois grupos foram respectivamente (10,5 + 22,5 ; 8,7 +12,2 , p= 0,560) e a da NAG (3,2 + 1,8 ; 4,2 + 3,3 , p= 0,232). Constatamos uma associação estatisticamente significativa entre a presença de hematúria e proteinúria (p= 0,011), proteinúria e cilindrúria ( p< 0,001), proteinúria e índice de elevado de microalbuminúria ( p<0,001), NAG e índice de microalbuminúria elevado (p= 0,02); hematúria e sexo feminino (p<0,001), níveis de GT elevados nos indivíduos com proteinúria (p=0,038) e uma associação entre NAG e tabagismo ( p=0,004).

Estudo das características bioquímicas da β-glicosidase humana em indivíduos homozigotos e heterozigotos para a doença de Gaucher com mutações pré-determinadas : comparação com indivíduos normais

A Doença de Gaucher (DG) é a doença de depósito mais comum. É causada pela deficiência da enzima -glicosidase (-gli), necessária para o catabolismo intralisossômico do glicocerebrosídio, sendo herdada de modo autossômico recessivo. Esta deficiência resulta em um acúmulo de glicocerebrosídio nos lisossomos de macrófagos derivados de monócitos em tecidos do sistema reticuloendotelial. No período de janeiro de 1982 a outubro de 2003 foram analisadas, bioquimicamente, 1081 amostras de sangue de pacientes com suspeita de DG. Nestas amostras foram medidas as atividades das enzimas -gli e quitotriosidase (QT). Foram diagnosticados 412 casos de DG (38,1%), sendo na sua grande maioria DG tipo 1. As regiões brasileiras de maior concentração destes pacientes foram as regiões sudeste, sul e nordeste. A idade média destes pacientes ao diagnóstico foi de 19 anos. A atividade da -gli de indivíduos com DG foi em média 10,7% daquela apresentada pelos indivíduos normais. A QT apresentou-se em média 269 vezes mais elevada no grupo de pacientes com DG. Nos 669 casos em que não foi confirmada a presença de DG, houve pacientes com Doença de Niemann-Pick tipos A, B ou C (44 casos), possíveis heterozigotos para DG (59 casos), pacientes com outras DL (19 casos) e outros EIM (3 casos) Em 508 casos não foi encontrado nenhum distúrbio metabólico. Foram analisadas as mutações de 128 indivíduos com DG, sendo que o genótipo N370S/L444P foi o mais freqüente (48,4%). Este estudo mostra que o protocolo bioquímico empregado foi eficiente para a detecção de DG, uma doença que se mostra bastante freqüente também no Brasil. Neste estudo também foi possível caracterizar o comportamento do pH ótimo, termoestabilidade, Km e Vmax da -gli em leucócitos de pacientes com DG e heterozigotos obrigatórios com diferentes genótipos comparando-os com indivíduos normais. Os resultados mostraram um comportamento diferente da enzima nos três grupos analisados. Esse comportamento variou conforme a mutação presente nos indivíduos. Não foi observado somente um único pH ótimo nos 3 grupos. A enzima de indivíduos normais mostrou uma faixa de pH de 5,0 a 5,4, a de heterozigotos, um único pH ou uma estreita faixa e a de indivíduos com DG, 2 picos de pH ótimo. O Km e a Vmax da enzima de heterozigotos variou desde igual até maior que aquele da enzima normal. Quando comparamos a enzima de indivíduos normais com aquela de pacientes com DG, observamos que nos genótipos N370S/N370S e N370S/IVS2+1 o Km foi maior e no grupo N370S/L444P o Km foi significativamente menor. A Vmax nos indivíduos com DG apresentou valores menores em relação aos indivíduos normais. A enzima de leucócitos de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG, foi inativada a 60ºC. As diferenças de comportamento entre as enzimas dos três grupos analisados permitiram discriminá-los, ou seja, a enzima de indivíduos homozigotos apresentou uma maior atividade residual após 60 minutos de pré-incubação, sendo mais termoestável que os grupos de indivíduos normais e heterozigotos. . A mutação N370S produziu uma enzima mais estável e cataliticamente mais ativa que aquela da mutação L444P. Esta por sua vez, foi mais estável e ativa do que a mutação D409H. O mesmo aconteceu com os indivíduos homozigotos para DG, onde o comportamento bioquímico da b-gli foi determinado pela presença do alelo N370S. Portanto há um gradiente de estabilidade que vai de uma condição mais estável a uma condição menos estável. Este gradiente assemelha-se aquele da classificação do fenótipo clínico da DG. Os resultados nos permitem correlacionar diretamente a mutação N370S, mais estável cineticamente, com a forma clínica não neurológica da doença e a mutação menos estável cataliticamente (D409H) com a forma clínica neurológica da DG. Através deste trabalho foi possível obter informações sobre o comportamento da proteína em cada mutação estudada, seja ela em homo ou em heterozigose e estes dados podem colaborar para uma melhor distinção entre a enzima de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG.