Développement des marqueurs moléculaires spécifiques pour l'identification et la quantification de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires en utilisant la PCR en temps réel

Les champignons mycorhizien à arbuscules (CMA) sont des organismes pouvant établir des symbioses avec 80% des plantes terrestres. Les avantages d'une telle symbiose sont de plus en plus caractérisés et exploités en agriculture. Par contre, jusqu'à maintenant, il n'existe aucun outil permettant à la fois l'identification et la quantification de ces champignons dans le sol de façon fiable et rapide. Un tel outil permettrait, entre autres, de mieux comprendre les dynamiques des populations des endomycorhizes dans le sol. Pour les producteurs d'inoculum mycorhiziens, cela permettrait également d'établir un suivi de leurs produits en champs et d'avoir un contrôle de qualité de plus sur leurs inoculants. C'est ce que nous avons tenté de développer au sein du laboratoire du Dr. Hijri. Depuis environ une trentaine d'années, des outils d'identification et/ou de quantification ont été développés en utilisant les profiles d'acides gras, les isozymes, les anticorps et finalement l'ADN nucléaire. À ce jour, ces méthodes d’identification et de quantification sont soit coûteuses, soit imprécises. Qui plus est, aucune méthode ne permet à la fois la quantification et l’identification de souches particulières de CMA. L’ADN mitochondrial ne présente pas le même polymorphisme de séquence que celui qui rend l’ADN nucléaire impropre à la quantification. C'est pourquoi nous avons analysé les séquences d’ADN mitochondrial et sélectionné les régions caractéristiques de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA). C’est à partir de ces régions que nous avons développé des marqueurs moléculaires sous forme de sondes et d’amorces TaqMan permettant de quantifier le nombre de mitochondries de chacune de ces espèces dans un échantillon d’ADN. Nous avons ensuite tenté de déterminer une unité de quantification des CMA, soit un nombre de mitochondries par spore. C’est alors que nous avons réalisé que la méthode de préparation des échantillons de spores ainsi que la méthode d’extraction d’ADN avaient des effets significatifs sur l’unité de quantification de base. Nous avons donc optimisé ces protocoles, avant d’en e tester l’application sur des échantillons de sol et de racines ayant été inoculés avec chacune des deux espèces cibles. À ce stade, cet outil est toujours semi-quantificatif, mais il permet 9 l’identification précise de deux espèces de CMA compétentes dans des milieux saturés en phosphore inorganique. Ces résultats , en plus d’être prometteurs, ont permis d’augmenter les connaissances méthodologiques reliées à la quantification des CMA dans le sol, et suggèrent qu’à cause de leurs morphologies différentes, l’élaboration d’un protocole de quantification standardisé pour toutes les espèces de CMA demeure un objectif complexe, qui demande de nouvelles études in vivo.

Evaluation of Quantitative RT-PCR Using Nonamplified and Amplified RNA

Quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) is a standard assay in molecular medicine for gene expression analysis. Samples from incisional/needle biopsies, laser-microdissected tumor cells and other biologic sources, normally available in clinical cancer studies, generate very small amounts of RNA that are restrictive for expression analysis. As a consequence, an RNA amplification procedure is required to assess the gene expression levels of such sample types. The reproducibility and accuracy of relative gene expression data produced by sensitive methodology as qRT-PCR when cDNA converted from amplified (A) RNA is used as template has not yet been properly addressed. In this study, to properly evaluate this issue, we performed 1 round of linear RNA amplification in 2 breast cell lines (C5.2 and HB4a) and assessed the relative expression of 34 genes using cDNA converted from both nonamplified (NA) and A RNA. Relative gene expression was obtained from beta actin or glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase normalized data using different dilutions of cDNA, wherein the variability and fold-change differences in the expression of the 2 methods were compared. Our data showed that 1 round of linear RNA amplification, even with suboptimal-quality RNA, is appropriate to generate reproducible and high-fidelity qRT-PCR relative expression data that have similar confidence levels as those from NA samples. The use of cDNA that is converted from both A and NA RNA in a single qRT-PCR experiment clearly creates bias in relative gene expression data.

Simple telemedicine for developing regions: Camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis

This article describes a prototype system for quantifying bioassays and for exchanging the results of the assays digitally with physicians located off-site. The system uses paper-based microfluidic devices for running multiple assays simultaneously, camera phones or portable scanners for digitizing the intensity of color associated with each colorimetric assay, and established communications infrastructure for transferring the digital information from the assay site to an off-site laboratory for analysis by a trained medical professional; the diagnosis then can be returned directly to the healthcare provider in the field. The microfluidic devices were fabricated in paper using photolithography and were functionalized with reagents for colorimetric assays. The results of the assays were quantified by comparing the intensities of the color developed in each assay with those of calibration curves. An example of this system quantified clinically relevant concentrations of glucose and protein in artificial urine. The combination of patterned paper, a portable method for obtaining digital images, and a method for exchanging results of the assays with off-site diagnosticians offers new opportunities for inexpensive monitoring of health, especially in situations that require physicians to travel to patients (e.g., in the developing world, in emergency management, and during field operations by the military) to obtain diagnostic information that might be obtained more effectively by less valuable personnel.

Molecular assay optimized by Taguchi experimental design method for venous thromboembolism investigation

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Análise da expressão de genes relacionados à resistência a Meloidogyne javanica em soja, através da técnica de PCR em tempo real

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Expressão de IL-18 por PCR em tempo real em membranas corioamnióticas de gentantes com rotura prematura de membrans pré-termo

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Enumeração celular pela quantificação absoluta por PCR em tempo real de culturas de bradirrizóbios

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Metabolismo respiratório de bradirrizóbios em processos “in vitro” e simbióticos analisado por PCR quantitativo em tempo real

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeito da terapia periodontal na microbiota subgengival: parâmetros clínicos e microbiológicos comparativos de PCR semi quantitativo e PCR em tempo real

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Desenvolvimento da técnica de RT-PCR em tempo real para detecção e diferenciação de estirpes do vírus da bronquite infecciosa das galinhas

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Carga proviral do HTLV-1 e HTLV-2: um método simples através da PCR quantitativa em tempo real

Os vírus linfotrópicos de células T humanas, quando integrados ao genoma da célula hospedeira, provírus, têm como marcador de replicação seu DNA proviral. A carga proviral parece ser um importante fator no desenvolvimento de patologias associadas a estes retrovírus. Neste estudo foi desenvolvida uma metodologia para quantificação absoluta da carga proviral dos HTLV-1 e HTLV-2 através da PCR em tempo real. Cinqüenta e três amostras de doadores de sangue com teste de ELISA reagente foram submetidas à metodologia, que utilizou o sistema TaqMan® para três seqüências alvo: HTLV-1, HTLV-2 e albumina. A quantificação proviral absoluta foi determinada através da proporção relativa entre o genoma do HTLV e o genoma da célula hospedeira, levando em consideração o número de leucócitos. O método apresentado é sensível (215 cópias/mL), prático e simples para quantificação proviral, além de eficiente e adequado para confirmação e discriminação da infecção pelos tipos virais.

Discriminação alélica do fator V da coagulação por PCR em tempo real: diagnóstico simples e preciso

Dentre as doenças cardiovasculares, a trombose venosa (TV) destaca-se pela associação entre fatores de riscos adquiridos e fatores genéticos. A resistência hereditária à proteína C ativada tem sido identificada como a principal causa dos casos de trombose venosa, sendo frequentemente associada à mutação fator V Leiden (G1694A). Em indivíduos homozigotos, o risco de trombose venosa é 50 a 100 vezes maior que em pacientes homozigotos normais, enquanto em pacientes heterozigotos o risco é de 5 a 10 vezes. Baseado na necessidade de avaliação e acompanhamento de pacientes com casos de trombose venosa e prevenção de seus respectivos familiares, foi desenvolvido um método simples de discriminação alélica do fator V da coagulação utilizando PCR em tempo real. Foram selecionados 67 pacientes com histórico de TV e 51 indivíduos sem histórico de TV. Primeiramente, a discriminação alélica do fator V foi realizada através de PCR convencional seguida de digestão enzimática (Mnl). Posteriormente, o diagnóstico foi realizado por PCR em tempo real. Ambos os métodos foram baseados no polimorfismo G1691A, sendo no segundo utilizado fluoróforos VIC e FAM para marcar os nucleotídeos G e A, respectivamente. A técnica de PCR-RFLP foi utilizada para diagnosticar 95 indivíduos homozigotos normais, 21 heterozigotos e 2 homozigotos FVL. Utilizando PCR em tempo real foram obtidos os mesmos resultados. A máxima similaridade entre os resultados obtidos por PCR em tempo real e PCR-RFLP indicou precisão significativa do novo método de discriminação e visualização alélica do fator V.

Estudo por PCR em tempo real de três polimorfismos em genes envolvidos na resposta imune em pacientes infectados por Plasmodium vivax da população de Belém-PA

A malária é uma doença infecciosa que atinge aproximadamente 40% da população mundial em mais de 100 países e consiste em um grave problema de saúde pública. As citocinas são moléculas importantes na resposta imune contra a malária e atuam através do estímulo ou inibição da ativação, proliferação e/ ou diferenciação de células, além de regularem a secreção de anticorpos e de outras citocinas. Nesse trabalho investigamos três polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) que podem influenciar em uma maior ou menor síntese das citocinas TNF-a e IFN-g. Em relação à malária, os polimorfismos já foram associados com a malária grave, malária cerebral e anemia grave e também com outras doenças infecciosas, auto-imunes e com o câncer. Foram incluídos no estudo oitenta e um (81) pacientes com malária por Plasmodium vivax (primeira infecção) e cento e trinta (130) indivíduos sadios, ambos da população de Belém – PA. As freqüências genotípicas e alélicas foram pesquisadas através da técnica de discriminação alélica por PCR em tempo real e os resultados foram comparados entre os dois grupos. Parâmetros clínicos foram utilizados para tentar associar uma maior gravidade das manifestações da malária e a presença dos polimorfismos entre os pacientes. As freqüências foram semelhantes entre os dois grupos estudados. O alelo TNF-238*A não mostrou relação com nenhum dos parâmetros clínicos enquanto o alelo TNF-376*A estava relacionado com menores níveis plasmáticos de TNF-a e com uma menor intensidade dos sintomas. Os pacientes portadores do alelo IFN+874*A apresentaram menor intensidade da parasitemia. Assim os resultados obtidos não indicam associação dos polimorfismos com a ocorrência da malária na população estudada, mas com alguns dos parâmetros clínicos investigados, e podem auxiliar futuros estudos para tentar esclarecer como as mutações nos genes de citocinas podem influenciar na ocorrência e na evolução clínica da malária e de outras doenças infecciosas e parasitárias.

Direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in bovine and bubaline tissues through nested-PCR

Post-mortem bacterial culture and specific biochemical tests are currently performed to characterize the etiologic agent of bovine tuberculosis. Cultures take up to 90 days to develop. A diagnosis by molecular tests such as PCR can provide fast and reliable results while significantly decreasing the time of confirmation. In the present study, a nested-PCR system, targeting rv2807, with conventional PCR followed by real-time PCR, was developed to detect Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) organisms directly from bovine and bubaline tissue homogenates. The sensitivity and specificity of the reactions were assessed with DNA samples extracted from tuberculous and non-tuberculous mycobacteria, as well as other Actinomycetales species and DNA samples extracted directly from bovine and bubaline tissue homogenates. Regarding the analytical sensitivity, DNA of the M. bovis AN5 strain was detected up to 1.5 pg by nested-PCR, whereas DNA of M. tuberculosis H37Rv strain was detected up to 6.1 pg. The nested-PCR system showed 100% analytical specificity for MTC when tested with DNA of reference strains of non-tuberculous mycobacteria and closely-related Actinomycetales. A clinical sensitivity level of 76.7% was detected with tissues samples positive for MTC by means of the culture and conventional PCR. A clinical specificity of 100% was detected with DNA from tissue samples of cattle with negative results in the comparative intradermal tuberculin test. These cattle exhibited no visible lesions and were negative in the culture for MTC. The use of the nested-PCR assay to detect M. tuberculosis complex in tissue homogenates provided a rapid diagnosis of bovine and bubaline tuberculosis.

Detecção de Cryptosporidium serpentis em amostras fecais de serpentes utilizando PCR em tempo real

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)