NO EVIDENCE OF PATHOLOGICAL AUTOIMMUNITY FOLLOWING MYCOBACTERIUM LEPRAE HEAT-SHOCK PROTEIN 65-DNA VACCINATION IN MICE

Heat-shock proteins (HSPs) are currently one of the most promising targets for the development of immunotherapy against tumours and autoimmune disorders. This protein family has the capacity to activate or modulate the function of different immune system cells. They induce the activation of monocytes, macrophages and dendritic cells, and contribute to cross-priming, an important mechanism of presentation of exogenous antigen in the context of MHC class I molecules, These various immunological properties of HSP have encouraged their use in several clinical trials. Nevertheless, an important issue regarding these proteins is whether the high homology among HSPs across different species may trigger the breakdown of immune tolerance and induce autoimmune diseases. We have developed a DNA vaccine codifying the Mycobacterium leprae Hsp65 (DNAhsp65), which showed to be highly immunogenic and protective against experimental tuberculosis. Here, we address the question of whether DNAhsp65 immunization could induce pathological autoimmunity in mice. Our results show that DNAhsp65 vaccination induced antibodies that can recognize the human Hsp60 but did not induce harmful effects in 16 different organs analysed by histopathology up to 210 days after vaccination. We also showed that anti-DNA antibodies were not elicited after DNA vaccination. The results are important for the development of both HSP and DNA-based immunomodulatory agents.

Comprehensive gene expression profiling in lungs of mice infected with Mycobacterium tuberculosis following DNAhsp65 immunotherapy

Background The continued increase in tuberculosis (TB) rates and the appearance of extremely resistant Mycobacterium tuberculosis strains (XDR-TB) worldwide are some of the great problems of public health. In this context, DNA immunotherapy has been proposed as an effective alternative that could circumvent the limitations of conventional drugs. Nonetheless, the molecular events underlying these therapeutic effects are poorly understood. Methods We characterized the transcriptional signature of lungs from mice infected with M. tuberculosis and treated with heat shock protein 65 as a genetic vaccine (DNAhsp65) combining microarray and real-time polymerase chain reaction analysis. The gene expression data were correlated with the histopathological analysis of lungs. Results The differential modulation of a high number of genes allowed us to distinguish DNAhsp65-treated from nontreated animals (saline and vector-injected mice). Functional analysis of this group of genes suggests that DNAhsp65 therapy could not only boost the T helper (Th)1 immune response, but also could inhibit Th2 cytokines and regulate the intensity of inflammation through fine tuning of gene expression of various genes, including those of interleukin-17, lymphotoxin A, tumour necrosis factor-cl, interleukin-6, transforming growth factor-beta, inducible nitric oxide synthase and Foxp3. In addition, a large number of genes and expressed sequence tags previously unrelated to DNA-therapy were identified. All these findings were well correlated with the histopathological lesions presented in the lungs. Conclusions The effects of DNA therapy are reflected in gene expression modulation; therefore, the genes identified as differentially expressed could be considered as transcriptional biomarkers of DNAhsp65 immunotherapy against TB. The data have important implications for achieving a better understanding of gene-based therapies. Copyright (C) 2008 John Wiley & Sons, Ltd.

Desenvolvimento e padronização de um método para determinação da sensibilidade do mycobacterium tuberculosis a fármacos contra tuberculose

A resistência a fármacos antituberculose tem constituído uma grande ameaça ao controle da tuberculose em âmbito mundial. A sua detecção precoce permite ao médico instituir um esquema de tratamento mais adequado ao paciente e consequentemente quebrar a cadeia de transmissão dos bacilos. Os testes de sensibilidade a antimicrobianos atuais, embora eficientes, são caros e/ou demorados e/ou trabalhosos. Com base nesta premissa, nos propusemos a desenvolver e padronizar um método fenotípico direto para determinação da sensibilidade do Mycobacterium tuberculosis a antimicrobianos de primeira linha do tratamento da tuberculose. Para o desenvolvimento deste novo teste, utilizaram-se os princípios do método das proporções e do exame de cultura pelo método de Ogawa–Kudoh. O estudo foi dividido em duas fases. A primeira, caracterizada pelo desenvolvimento e padronização do método proposto e a segunda, pela análise da concordância entre o método desenvolvido e o método do MGIT (padrão-ouro). Na primeira fase, foram realizados diversos ensaios para definir: os volumes de absorção e de liberação de líquidos de diferentes tipos de swab, o meio de cultura, as concentrações dos antimicrobianos e o tempo de leitura/interpretação das culturas. Além disso, foi verificado se a amostra deveria ou não ser diluída. Com base nos resultados destes ensaios, padronizou-se o método com: swab comercial, em meio de cultura Ogawa- Kudoh contendo separadamente 0,2 μg/mL de isoniazida, 40,0 μg/mL de rifampicina, 10,0 μg/mL de estreptomicina e 500,0 μg/mL de ácido para-nitrobenzóico. Padronizou-se ainda a inoculação da amostra de escarro de forma direta, ou seja, sem diluir e a leitura/interpretação do resultado do teste no período entre 21 e 28 dias. A análise comparativa entre este método e o teste de sensibilidade a antimicrobianos no sistema MGIT realizada na segunda fase do projeto indicou um índice kappa igual a 1,000, ou seja, uma concordância muito boa em relação ao padrão-ouro. Diante desses resultados promissores, acreditamos que o método desenvolvido apresente um grande potencial para ser utilizado em laboratórios com pouca infra-estrutura, por ser de baixo custo, fácil execução e relativamente rápido.

Participação da apolipoproteína-E na atividade microbicida “in vitro” contra o Mycobacterium tuberculosis

A parede celular de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) é constituída por 60% de lipídios, impedindo a passagem de uma grande quantidade de substâncias, além de desempenhar um importante papel na imunopatogênese. A apresentação desses antígenos aos linfócitos se dá por meio de moléculas do tipo CD1.Por sua vez a Apolipoproteína-E (ApoE), glicoproteína amplamente distribuída nos tecidos, pode facilitar a apresentação de lipídios pelo CD1. A ApoE possui três principais alelos ApoE- 2, 3 e 4, que codificam três isoformas de proteínas, tipos 2, 3 e 4, que possuem diferentes estruturas e funções. A presença de determinadas isoformas da ApoE está associada a doenças infecciosas, como herpes labial, dano hepático severo causado pelo vírus da hepatite C, diarréia infantil e tuberculose pulmonar. Neste contexto, avaliamos a participação da ApoE na atividade microbicida in vitro frente ao Mtb. Para tanto, foram arrolados 13 indivíduos PPD-, 17 indivíduos PPD+ e 4 indivíduos com tuberculose pulmonar ativa. O uso de plasma humano depletado de ApoE nos experimentos de atividade microbicida in vitro mostraram um aumento significante (p=0,02) no número de micobactérias (431.5 ± 81.92 UFC) quando comparado ao grupo controle (313.0 ± 74.61 UFC). Esses resultados foram confirmados por um modelo experimental utilizando esplenócitos de camundongos de camundongos C57BL/6 (815.9 ± 76.32 UFC) e animais APOE nocaute (1133 ± 86.85 UFC) (p = 0.021). Quanto à produção de IL-10, no grupo PPD+, observamos que o grupo com depleção de ApoE (866.7 ± 447.8) apresentou uma produção menor desta citocina com relação ao controle infectado (1089 ± 481.3) (p=0,023). Já em relação ao IFN-, em ambos os grupos observou-se, após 72 horas, uma tendência à diminuição da produção dessa citocina no grupo com depleção, com relação ao grupo controle. Esses dados sugerem que a ApoE tem papel distinto na ativação da resposta imune e sua ausência pode prejudicar a resposta imune frente à tuberculose

Infeccão tuberculosa natural e o uso do BCG oral e intradérmico em escolares de Laranjal Paulista, SP, Brasil

Foi pesquisado no 2.° semestre de 1969, o índice de infecção tuberculosa nos escolares de nível primário da sede municipal de Laranjal Paulista, SP, com faixa etária de 7 a 15 anos. Utilizou-se PPD RT23 com 2UT (0,04 mcg) de acordo com a 2.ª recomendação do Serviço Nacional de Tuberculose, sendo encontrado nível de 8% de reatores fortes o que sugere necessidade de intensificação local do controle da tuberculose. Houve diferenças significativas a 5% quanto à cor e grupo etário, predominando nos "não brancos" e nos de 11 a 15 anos, o mesmo não ocorrendo, entretanto, quanto ao sexo. Os reatores e seus conviventes foram encaminhados ao Dispensário de Tuberculose. Foi também pesquisada a viragem tuberculínica pelo BCG oral e intradérmico, comparados com grupo controle, encontrando-se resultados significantes. O resultado verificado no grupo que tomou BCG por via intradérmica foi quase duas vezes maior que os observados no grupo de BCG oral. Não houve diferenças quanto ao sexo e grupo etário, mas o grupo "não branco" mostrou-se mais reativo. Não foram definidas estatisticamente as reações pós-vacinais e a expectativa populacional foi considerada dentro da esperada para atividades desse tipo.

Nível de infecção tuberculosa e viragem tuberculínica pelo BCG intradérmico em escolares de Botucatu, SP (Brasil) em 1969

Procurou-se determinar, no 2.° semestre de 1969, o nível de infecção tuberculosa nos escolares da sede municipal de Botucatu, nas idades de 7 a 15 anos (exclusive) e o efeito do BCG intradérmico e da própria prova em si na viragem tuberculínica. Utilizamos PPD RT23 com 2UT (0,04 mcg) de acordo com a recomendação do Serviço Nacional de Tuberculose. A prevalência desta infecção se situou em torno de 6%, a qual, embora aparentemente baixa, ainda sugere ser a tuberculose problema de Saúde Pública local, com necessidade de melhor controle. Não houve diferença estatística significante entre os níveis encontrados nos grupos bases (A + B) e o controle, C, mas em relação aos atributos considerados, ela predominou na faixa etária de 11 a 15 anos, nos não brancos e no sexo masculino, com aumento significante de nível entre as provas realizadas num período de 90 dias. Não houve diferença significativa para os resultados encontrados entre a primeira e segunda provas realizadas no grupo B o que, entretanto se apresentou evidente no grupo A, após a utilização do BCG intradérmico, sugerindo forte estímulo alérgico para o mesmo. Os resultados foram encaminhados ao Dispensário Regional de Tuberculose para as necessárias medidas de controle.

Duas epidemias de tuberculose em crianças menores de três anos de idade, vacinadas com BCG oral, numa creche do município de São Paulo, Brasil

São descritas duas epidemias de tuberculose em crianças menores de 3 anos de idade vacinadas com BCG oral, ocorridas numa creche para crianças menores de 5 anos de idade, no município de São Paulo, nos anos de 1967 e 1969. Em 1967 havia no estabelecimento 96 crianças, inicialmente não reatoras ao teste tuberculínico padronizado (PPD, Rt-23, 2 UT). Foram encontrados 19 reatores, sendo 12 reatores fortes (63,2%) e 7 reatores fracos (36,8%) e imagens radiológicas indicativas de anormalidade pulmonar em 15 crianças ou 78,9% dos reatores. Em 1969 havia no estabelecimento mais 62 crianças não reatoras, que foram acompanhadas separadamente em relação ao grupo de 1967, embora convivessem no mesmo ambiente. Foram encontrados 36 reatores à tuberculina, sendo 29 reatores fortes (80,5%) e 7 reatores fracos (19,5%) e imagens radiológicas indicativas de anormalidade pulmonar em 11 crianças, ou 30,5% dos reatores. Nesse mesmo ano houve viragem tuberculínica em mais 7 crianças pertencentes ao grupo de não reatores de 1967, sendo 5 reatores fortes e 2 reatores fracos. Nas duas epidemias, as viragens tuberculínicas e as alterações radiológicas pulmonares foram constatadas apenas nas crianças menores de 3 anos de idade, em sua maioria vacinadas previamente com 3 doses de BCG oral, com intervalo de uma semana entre uma dose e outra. A fonte de infecção foi um operário que trabalhou no estabelecimento durante aproximadamente dois meses em 1967 e um mês em 1969, nos locais onde eram mantidas as crianças menores de 3 anos de idade. A vacina administrada por esse método não parece ter influenciado nas conversões tuberculínicas e no desenvolvimento de imunidade específica.

Análise dos resultados da pesquisa da infecção tuberculosa e do primeiro programa de vacinação pelo BCG intradérmico em escolares de São Paulo, Brasil, 1971-1974

São apresentados os resultados do programa de pesquisa da sensibilidade tuberculínica e de vacinação pelo BCG intradérmico em escolares da primeira série da Rede Municipal de Ensino de São Paulo, no período de 1971 a 1974. A pesquisa tuberculínica através da aplicação do PPD, Rt-23, 2 UT, revelou, nos diferentes anos, coeficientes variando de 6,6 a 7,6% de reatores fortes e de 1,6 a 3,0% de reatores fracos. A vacinação pelo BCG intradérmico foi feita em 129.784 crianças, correspondendo a 89,7% dos 144-641 não reatores. O reteste tuberculínico feito em amostra de escolares vacinados, apresentou percentuais anuais de viragem variando de 85,6 a 96,1%. Destes, 7,8 a 21,4% reagiram fracamente e 64,2 a 88,3% reagiram fortemente. Os objetivos foram alcançados, o que se pode observar pelos resultados apresentados observando receptividade do programa por parte da população trabalhada.

Integração das atividades de vacinação pelo BCG intradérmico nos programas gerais de imunização das unidades sanitárias

A imunização pelo BCG constitui um recurso operacional de grande alcance nos países em desenvolvimento, onde é elevada a incidência da tuberculose. Os conhecimentos adquiridos nos últimos cinco anos, em nosso meio, permitem elaborar programas para a aplicação do BCG, por via intradérmica, em extensão útil epidemiologicamente, sem o teste tuberculínico prévio. É analisada a experiência da integração da vacinação pelo BCG intradérmico no programa geral de imunização do Centro de Saúde "Geraldo de Paula Souza", da Faculdade de Saúde Pública da USP. As suas conclusões são favoráveis à viabilidade do método, permitindo ampla cobertura de imunização anti-tuberculose da população, desde os primeiros meses de vida.

Hipersensibilidade tuberculínica em crianças menores de um ano de idade vacinadas com BCG oral

São relatados os resultados da pesquisa da hipersensibilidade tuberculínica pelo PPD, Rt-23,2UT, em crianças menores de um ano de idade, vacinadas anteriormente com BCG oral, pertencentes a uma área do município de São Paulo. Os resultados mostram que para 790 crianças houve 13,0% de reatores fracos e 16,3% de reatores fortes, com um total de 29,3% de reatores. São feitos comentários sobre a vacinação oral e o baixo percentual de reatores encontrados, no controle tuberculínico pós-vacinal, relativamente aos obtidos com o BCG intradérmico.

Modelo matemático para estimar impacto epidemiológico da vacinação BCG

Foi apresentado modelo que permite estimar o impacto primário de um programa de vacinação com BCG intradérmico, aplicado num determinado grupo etário, durante um certo período de tempo, que se segue à vacinação. Alguns exemplos de aplicação do mesmo foram mostrados, tendo sido assinalada a possibilidade de estimar antecipadamente a menor eficácia de vacina capaz de manter a relação custo-benefício maior do que um.

Prova tuberculínica, BCG oral e infecção tuberculosa em crianças menores de 5 anos

São relatados os resultados das provas tuberculínicas com PPD Rt23, 2 UT, em crianças menores de um ano e de um a 4 anos, matriculadas na Clínica Pediátrica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP, São Paulo, Brasil, no período de 1971 a 1975. Em 665 crianças menores de um ano encontrou-se 3,15% de reatores fracos e 6,62% de reatores fortes e em 1.298 crianças de um a 4 anos, 0,69% de reatores fracos e 5,5% de reatores fortes. Nas mesmas crianças, foram estudadas as relações entre vacinação BCG oral prévia e positividade à prova tuberculínica nos 2 grupos etários considerados e nos quais se obteve a informação de vacinação anterior com BCG oral. Em 575 crianças menores de um ano e 1.113 de um a 4 anos encontrou-se associação positiva entre vacinação BCG oral prévia e positividade à prova tuberculínica. Analisando a relação entre o número de doses de BCG oral prévio e o resultado das provas tuberculínicas pelo método de Goodman, verificou-se que a proporção de crianças que tinham tomado 3 doses e mais de BCG oral e que apresentaram reação forte à prova tuberculínica é significantemente maior que a observada para os não reatores, fato esse não verificado para o grupo de um a 4 anos. Nas crianças que tomaram uma ou duas doses não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes.

Resultados de teste tuberculínico efetuado três meses após vacinação, por meio do BCG administrado pela via intradérmica, de pessoas com idades diversas e residentes em São Paulo, SP (Brasil)

Foram analisados os resultados de teste tuberculínico, efetuado três meses após vacinação com BCG (amostra Moreau-Rio de Janeiro), pela via intradérmica. A casuística correspondeu a 7.790 pessoas, incluindo as de grupo pertinente ao primeiro trimestre de vida e merecedor, atualmente, de especial atenção. Ficou constatada, globalmente, a percentagem de positividade de 69%. Houve apreciação, especifica e detalhada, referente a indivíduos de idades diversas, e a abordagem do tema tornou-se oportuna em face ao interesse que esse tipo de imunização vem despertando no Brasil e, também, em virtude da necessidade de coletar informes aptos a apoiar trabalhos profiláticos.

Sensibilidade tuberculínica pós-vacinal e sua irrelevância para a revacinação BCG

Revisão realizada com o objetivo de mostrar que a prática de revacinar com BCG, baseada na negatividade do teste tuberculínico pós-vacinal, é destituída de fundamentos científicos. São apresentados alguns fatos nos quais se baseia o teste tuberculínico padronizado, seguidos de comentários sobre o perfil tuberculínico de populações não vacinadas. Considerações sobre o perfil tuberculínico de populações vacinadas e suas variações no indivíduo e no grupo vacinado como um todo, conduzem ao questionamento sobre uma possível correspondência entre alergia pós-vacinal e resistência à tuberculose. Fatos de natureza epidemiológica e dados experimentais são arrolados, mostrando que a proteção conferida pela vacina não é proporcional ao grau de alergia induzida nos indivíduos; a esses argumentos se acrescenta a recente demonstração de que, embora tuberculino-negativas, crianças vacinadas podem apresentar intensa reatividade linfocitária ao PPD. Discute-se a utilização do teste tuberculínico na avaliação do processo de vacinação.

Comportamento tintorial do Mycobacterium leprae: revisão histórica

Foi feita revisão histórica sobre os corantes utilizados na identificação do Mycobacterium leprae. Foram analisadas para cada corante, sua composição química, propriedades tintoriais e a capacidade de assimilação pelo bacilo nas diversas técnicas de coloração.