Characterisation of ZG16p, a unique mammalian lectin from pancreatic zymogen granules

The mechanisms of secretory granule biogenesis and regulated secretion of digestive enzymes in pancreatic acinar cells are still not well understood. To shed light on these processes, which are of biological and clinical importance (e.g., pancreatitis), a better molecular understanding of the components of the granule membrane, their functions and interactions is required. The application of proteomics has largely contributed to the identification of novel zymogen granule (ZG) proteins but was not yet accompanied by a better characterization of their functions. In this study we aimed at a) isolation and identification of novel membrane-associated ZG proteins; b) characterization of the biochemical properties and function of the secretory lectin ZG16p, a membrane-associated protein; c) exploring the potential of ZG16p as a new tool to label the endolysosomal compartment. First, we have performed a suborganellar proteomics approach by combining protein analysis by 2D-PAGE and identification by mass spectrometry, which has led to the identification of novel peripheral ZGM proteins with proteoglycan-binding properties (e.g., chymase, PpiB). Then, we have unveiled new molecular properties and (multiple) functions of the secretory lectin ZG16p. ZG16p is a unique mammalian lectin with glycan and proteoglycan binding properties. Here, I revealed for the first time that ZG16p is highly protease resistant by developing an enterokinase-digestion assay. In addition I revealed that ZG16p binds to a high molecular weight complex at the ZGM (which is also protease resistant) and forms highly stable dimers. In light of these findings I suggest that ZG16p is a key component of a predicted submembranous granule matrix attached to the luminal side of the ZGM that fulfils important functions during sorting and packaging of zymogens. ZG16p, may act as a linker between the matrix and aggregated zymogens due to dimer formation. Furthermore, ZG16p protease resistance might be of higher importance after secretion since it is known that ZG16p binds to pathogenic fungi in the gut. I have further investigated the role of ZG16p binding motifs in its targeting to ZG in AR42J cells, a pancreatic model system. Point mutations of the glycan and the proteoglycan binding motifs did not inhibit the targeting of ZG16p to ZG in AR42J cells. I have also demonstrated that when ZG16p is present in the cytoplasm it interacts with and modulates the endo-lysosomal compartment. Since it is known that impaired autophagy due to lysosomal malfunction is involved in the course of pancreatitis, a potential role of ZG16p in pancreatitis is discussed.

Mapeamento genómico de um gene de resistência ao míldio em Brassica oleracea L.

Tese dout., Biologia, Universidade do Algarve, 2006

Identificação de marcadores moleculares ligados a um gene mutado de resistência ao oídio (Erysiphe pisi Syd.) em ervilha (Pisum sativum L.)

Tese dout., Ciências Agrárias, Universidade do Algarve, 2006

Variabilidade genómica de Citrus tristeza virus e transformação genética de Citrus aurantium L. com vista à obtenção de resistência

Tese de dout., Biologia, Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais, Univ. do Algarve, 2003

Autophagy in hypothalamic cells: role of Neuropeptide Y

Dissertação de mest.Ciências Biomédicas. Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Univ. do Algarve, 2011

Caracterização dos mecanismos de transporte epitelial no intestino da dourada, Sparus auratus

Dissertação de mest., Aquacultura e Pescas, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Univ. do Algarve, 2010

Efeitos a posteriori dos défices hídricos sobre a actividade fotossintética: mecanismos de fotoprotecção e sistema enzimático antioxidante

Tese de dout., Biologia (Fisiologia Vegetal), Faculdade de Engenharia dos Recursos Naturais, Univ. do Algarve, 2005

O Remexido e a resistência miguelista no Algarve

Artigo científico sobre a acção político-militar de José Joaquim de Sousa Reis, depois transformado no herói popular que o vulgo designava por Remexido, famoso guerrilheiro que sustentou a causa miguelista até ao fim do período histórico conhecido por Setembrimo. Foi, e ainda é, uma das mais carismáticas figuras da história regional algarvia, retratado em diversas obras da literatura portuguesa, desde o séc. XIX até à actualidade.

Cytogenetic and histological studies of the brook trout (Salvelinus fontinalis) x arctic charr (Salvelinus alpinus) hybrids

In aquaculture, application of fish hybrids has increased. This technique permits improvement of the fish production by providing specimens showing better growth rate when compared to the parental species. Indeed, sterile individuals are highly demanded because quite frequently parental fish mature before they reach the market size, which impairs their growth and decrease their economic value. Throughout the last years, the commercial and scientific interest in salmonids has increased rapidly, among them, the brook trout (Salvelinus fontinalis), Arctic charr (Salvelinus alpinus) are species that can be crossed to produce hybrids that might by cultured in the fish farms. In the present thesis, we have assessed chromosome numbers and evaluate gonadal sex in the brook trout X Arctic charr hybrid progenies. In our populations, the karyotype of the brook trout comprises 84 chromosomes: 16 bi-armed chromosomes (meta-submetacentric) and 68 one-armed chromosomes (telo-acrocentrics) and the chromosome arm number, NF= 100. Arctic charr karyotype shows variation related to the chromosome number (2n= 81-82) and stable chromosome arm number (NF= 100). 2n= 81 chromosomes consisted of 19 bi-armed and 62 one-armed chromosomes, while 2n= 82 karyotype was organized into 18 meta-submetacentric and 64 acrocentrics. The cytogenetic and histological analysis of the brook trout X Arctic charr hybrids (sparctics) was carried out to asses chromosome and chromosome arm number and gonadal sex of the studied specimens. Diploid chromosome number in the hybrids varied from 81 to 84 and individuals with 83 and 84 chromosomes were predominant. Most of the fish had chromosome arm number equal to 100. Robertsonian fusion in the Arctic charr and chromosome behaviour in the hybrid fish cells might lead to the observed variation in chromosome numbers in the hybrids. Among studied fish, 12 were males, 3 were females and 9 had intersex gonads. No correlation between chromosome number and disturbances in the gonadal development was found. This might suggest that intersex gonads might have been developed as a consequence of disturbances in the genetic sex determination process. Genetic sex determination acts properly in the parental species but in the hybrids this may not be as efficient.

O papel do regulador transcricional CITED2 na leucemia linfoblástica aguda de linfócitos T

A leucemia linfoblástica aguda de Linfócitos T (LLA-T) é uma neoplasia agressiva de precursores de células T do timo, que afeta principalmente crianças e adolescentes. A identificação de fatores moleculares que controlam a iniciação e progressão da LLA-T é fundamental para desenvolvimento de terapêuticas mais específicas e eficientes. Devido a atividade de fatores de transcrição estar muitas vezes desregulada na LLA-T e o regulador transcricional CITED2 controla diversos processos no desenvolvimento e oncogénese, levando assim ao objetivo principal, verificar se o CITED2 está envolvido na iniciação e/ou progressão da LLA-T, para se cumprir este iremos verificar se o CITED2está expresso nas linhas celulares leucémicas, quais os seus efeitos e por último verificar se o seu promotor é influenciada por três vias de sinalização: JAK-STAT, NFkB e NOTCH1. Analisou-se a expressão de CITED2 em linhas celulares de leucemia linfoblástica das células T e de células T normais, realizando o PCR quantitativo. Verificou-se que todas as células expressavam o CITED2, algumas com elevada expressão, por exemplo a linha celular EL4.2 expressa sete vezes mais Cited2 que os timócitos normais. Selecionou-se duas linhas celulares, EL4.2 e as DND41, para efetuar a subexpressão de CITED2, utilizando um plasmídeo lentiviral que expressa um RNA de interferência contra o CITED2. Conseguimos obter transdução estável deste plasmídeo para a linha celular DND41, tendo então efetuado análises de proliferação celular em meio de cultura normal ou meio com redução de soro fetal bovino. Verificou-se que a linha celular DND41/shCITED2 apresentava um maior crescimento celular comparando com a linha DND41/pLKO.1, sendo significativo, a partir das 48 horas, mas análise das fases do ciclo celular não demonstrou qualquer diferença. Analisou-se a resistência destas linhas celulares à apoptose, tratando as células com dexametasona, um agente quimioterápico para leucemias LLA-T. Observou-se que existe uma ligeira tendência para a linha celular DND41/shCITED2 ser mais resistente à apoptose. Mas nas linhas celulares sem tratamento, verificou-se diferenças na fase G0/G1 e G2/M, sendo que a linha celular DND41 sh CITED2 apresenta mais células com ciclo celuar ativo. Analisou-se no presente trabalho, se o promotor do CITED2 seria influenciando pela ativação das vias de sinalização JAK-STAT, NF-kB e NOTCH1. Os nossos resultados indicam que a ativação destas vias regulam negativamente o promotor do CITED2. Tendo em conta o conjunto dos nossos resultados, podemos concluir que a inativação do regulador transcricional CITED2 pode contribuir para o desenvolvimento da LLA-T. No entanto, será necessário desenvolver mais estudos para compreender os mecanismos subjacentes.

Neuroendocrinologia do comportamento social no ciclídeo africano Oreochromis mossambicus: mecanismos reguladores e modulação social da reprodução

A reprodução em teleósteos é controlada pelo eixo hipotálamo-pituitária-gónada (HPG) que modula a gametogénese, o desenvolvimento dos caracteres secundários e a expressão do comportamento reprodutor. A informação sobre fatores endógenos e exógenos é integrada no cérebro e a atividade do eixo HPG é regulada, fazendo com que traços comportamentais sejam expressos no momento e no contexto certos. Fatores exógenos relacionados com condições físicas do ambiente (e.g. temperatura e fotoperíodo) têm o papel principal no controlo da reprodução. No entanto, o estatuto social e o contexto social têm sido menos estudados. Mecanismos hormonais e neuroendócrinos são muito conservados ao longo dos vertebrados, fazendo dos peixes um bom modelo para o estudo da endocrinologia do comportamento. Os objetivos gerais deste trabalho consistem em determinar de que forma o contexto social interfere na expressão do comportamento e o papel de mecanismos hormonais e neuroendócrinos nesse processo, sendo abordados dois mecanismos, os androgénios e os neuropéptidos arginina vasotocina (AVT) e Isotocina (IT), dando-se especial relevância à AVT. A tilápia moçambicana (Oreochromis mossambicus) foi o modelo usado. A a sua biologia é bem conhecida, é muito adaptável a condições artificiais, e que tem uma importância económica crescente. Esta espécie possui um sistema social elaborado, com machos a organizarem-se em arenas reprodutoras, onde escavam depressões no substrato, para as quais atraem as fêmeas para a reprodução. Todos os trabalhos apresentados nesta dissertação tiveram como como sujeito focal o macho. Esta tese está organizada quatro capítulos. No capítulo I- Introdução geral, é apresentada uma revisão da literatura relevante para enquadrar o presente trabalho. Os capítulos II e III englobam os 4 artigos científicos que foram redigidos, denominados de artigo 1 a 4, consoante a ordem em que são apresentados na tese. O capítulo II, intitulado “Modulação social da reprodução”, é apresentado um estudo (artigo 1) que aborda o efeito do ambiente social no comportamento e no estado fisiológico da tilápia moçambicana. Com este trabalho pretendia-se perceber qual o efeito do contexto de instabilidade social nos níveis plasmáticos hormonais e a influência destes contextos na criação de padrões de comportamento. Gerou-se com sucesso um cenário de instabilidade social, através da substituição de machos dominantes entre replicados, por oposição ao contexto social estável em que os animais foram retirados e reintroduzidos no mesmo aquário. Em contexto social instável verificou-se tal como esperado, um aumento do comportamento agonístico. Apesar da agressividade não ter sido acompanhada pelo aumento dos níveis hormonais, os resultados sugerem que os androgénios funcionam como fator de reforço da integração na criação de padrões comportamento em contexto social instável, mostrando assim uma otimização do comportamento em períodos de instabilidade social. No capítulo III, intitulado “Mecanismos reguladores do comportamento social”, são apresentados três artigos e foi dividido em duas secções. Na primeira é abordado o papel dos androgénios (artigo 2) e na segunda o papel da AVT e IT (artigo 3 e 4) na regulação do comportamento social. Em relação ao estudo do papel dos androgénios (artigo 2), pretendeu-se estudar o efeito da falta de androgénios em circulação na exibição do comportamento agonístico e reprodutor. Para tal, procedeu-se à castração de machos de tilápia. A remoção integral das gónadas baixou os níveis de androgénios em cerca de 90% para a testosterona e quase 100% para 11KT e provocou uma completa abolição do comportamento reprodutor (construção do ninho, coloração nupcial e corte), no entanto o comportamento agonístico não foi afetado. Revelou-se desta forma que o mecanismo de regulação do comportamento reprodutor e agonístico é diferente, com os androgénios como agentes mediadores do comportamento reprodutor e moduladores do comportamento agonístico, uma vez que a literatura existente relaciona os androgénios com o comportamento agonístico nesta espécie. O estudo da regulação da AVT e IT em função do estatuto social foi efetuado com duas abordagens diferentes, resultando em dois artigos científicos (artigo 3 e 4). A primeira tinha como objetivo perceber se a AVT e IT estava distribuída por todo o cérebro em quantidades mensuráveis ou apenas em alguma área específica, além de perceber qual a diferença dos níveis cerebrais e glândula pituitária entre machos dominantes e subordinados. Procedeu-se ao doseamento da AVT e IT no cérebro através de cromatografia de fase líquida (high performance liquid cromatography, HPLC) em machos dominantes e subordinados (com o estatuto estabilizado há pelo menos 5 semanas). O cérebro foi dividido em 7 áreas [bolbos olfativos, telencéfalo, teto ótico, diencéfalo, cerebelo, rombencéfalo e pituitária (considerada como área cerebral para efeitos comparativos)]. Verificou-se que a área que apresentou uma maior concentração de neuro péptidos (AVT e IT) foi a pituitária, seguida dos bolbos olfactivos e finalmente as restantes áreas. A existência destes neuropéptidos no bolbo olfactivo sugere que a AVT e IT estão implicadas no mecanismo de reconhecimento social. Esta relação tem particular importância para esta espécie uma vez que a Tilápia usa o mecanismo do olfacto, por exemplo para o reconhecimento do estado reprodutivo das fêmeas. Machos subordinados apresentaram concentrações de AVT superiores na pituitária, o que sugere a influência da AVT num processo fisiológico específico relacionado com a subordinação. Uma vez que machos subordinados armazenam menos urina do que machos dominantes (machos dominantes armazenam grandes quantidades de urina que libertação de forma pulsátil, de forma dependente do contexto, aumentando o número de pulsos na presença de machos rivais ou fêmeas pré-ovuladas). A AVT pode estar a exercer um efeito antidiurético nos machos subordinados diminuindo assim a produção de urina. Machos dominantes apresentaram valores superiores de IT no rombemcéfalo, sugerindo que a isotocina pode estar relacionada com o comportamento social em dominantes. Para avaliar o efeito do estatuto na organização dos grupos neuronais produtores de AVT (situados na área pré-ótica) foram criadas condições semelhantes à situação anterior, neste caso foram contabilizados os neurónios imunorreativos à AVT na área pré-ótica e medida a área dos corpos celulares em machos dominantes, subordinados e fêmeas. Os grupos neuronais da área pré-ótica são constituídos por células parvocelulares (pPOA), magnocelulares (mPOA) e gigantocelulares (gPOA). A literatura relaciona uma maior expressão de células pPOA em machos subordinados e gPOA em dominantes, no entanto os resultados do artigo 4 mostraram que machos subordinados aumentaram a área dos corpos celulares de todos os grupos neurais, e todos os grupos apresentam projeções para pituitária (apesar de projetarem para outra áreas) sugerindo que este aumento generalizado do tamanho das células implica um aumento da produção de AVT direcionada para a pituitária. As células (principalmente a área dos corpos celulares) correlacionaram-se negativamente com o comportamento agressivo e positivamente com o comportamento de fuga, sugerindo uma inibição geral do comportamento reprodutor e agonístico em machos subordinados. O tamanho das células mPOA está inversamente associado ao peso do rim o que sugere um efeito deste grupo neural no rim provavelmente implicado no mecanismo antidiurético em machos subordinados.

Electrical characterization of metal-oxide-polymer devices for non-volatile memory applications

The objective of this thesis is to study the properties of resistive switching effect based on bistable resistive memory which is fabricated in the form of Al2O3/polymer diodes and to contribute to the elucidation of resistive switching mechanisms. Resistive memories were characterized using a variety of electrical techniques, including current-voltage measurements, small-signal impedance, and electrical noise based techniques. All the measurements were carried out over a large temperature range. Fast voltage ramps were used to elucidate the dynamic response of the memory to rapid varying electric fields. The temperature dependence of the current provided insight into the role of trapped charges in resistive switching. The analysis of fast current fluctuations using electric noise techniques contributed to the elucidation of the kinetics involved in filament formation/rupture, the filament size and correspondent current capabilities. The results reported in this thesis provide insight into a number of issues namely: (i) The fundamental limitations on the speed of operation of a bi-layer resistive memory are the time and voltage dependences of the switch-on mechanism. (ii) The results explain the wide spread in switching times reported in the literature and the apparently anomalous behaviour of the high conductance state namely the disappearance of the negative differential resistance region at high voltage scan rates which is commonly attributed to a “dead time” phenomenon which had remained elusive since it was first reported in the ‘60s. (iii) Assuming that the current is filamentary, Comsol simulations were performed and used to explain the observed dynamic properties of the current-voltage characteristics. Furthermore, the simulations suggest that filaments can interact with each other. (iv) The current-voltage characteristics have been studied as a function of temperature. The findings indicate that creation and annihilation of filaments is controlled by filling and neutralizing traps localized at the oxide/polymer interface. (v) Resistive switching was also studied in small-molecule OLEDs. It was shown that the degradation that leads to a loss of light output during operation is caused by the presence of a resistive switching layer. A diagnostic tool that predicts premature failure of OLEDs was devised and proposed. Resistive switching is a property of oxides. These layers can grow in a number of devices including, organic light emitting diodes (OLEDs), spin-valve transistors and photovoltaic devices fabricated in different types of material. Under strong electric fields the oxides can undergo dielectric breakdown and become resistive switching layers. Resistive switching strongly modifies the charge injection causing a number of deleterious effects and eventually device failure. In this respect the findings in this thesis are relevant to understand reliability issues in devices across a very broad field.

Characterization of TRIB2 following PI3K inhibition

Dissertação de mestrado, Oncobiologia,(Mecanismos Moleculares do Cancro), Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015

Aplicação dos lipossomas como estratégia para superar a resistência bacteriana aos antibióticos

Dissertação de mestrado, Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Estudo da atividade protetora de extratos vegetais contra stresse genotóxico

Dissertação de mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015