Hypoxie-ischémie cérébrale néonatale : rôle de la voie de JNK et implication de l'autophagie dans la mort neuronale

Résumé : Malgré les immenses progrès réalisés depuis plusieurs années en médecine obstétricale ainsi qu'en réanimation néonatale et en recherche expérimentale, l'asphyxie périnatale, une situation de manque d'oxygène autour du moment de la naissance, reste une cause majeure de mortalité et de morbidité neurologique à long terme chez l'enfant (retard mental, paralysie cérébrale, épilepsie, problèmes d'apprentissages) sans toutefois de traitement pharmacologique réel. La nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les complications de l'asphyxie périnatale est donc aujourd'hui encore essentielle. Le but général de ce travail est l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans des mécanismes moléculaires pathologiques induits par l'hypoxie-ischémie (HI) dans le cerveau immature. Pour cela, le modèle d'asphyxie périnatale (proche du terme) le plus reconnu chez le rongeur a été développé (modèle de Rice et Vannucci). Il consiste en la ligature permanente d'une artère carotide commune (ischémie) chez le raton de 7 jours combinée à une période d'hypoxie à 8% d'oxygène. Il permet ainsi d'étudier les lésions de type hypoxique-ischémique dans différentes régions cérébrales dont le cortex, l'hippocampe, le striatum et le thalamus. La première partie de ce travail a abordé le rôle de deux voies de MAPK, JNK et p38, après HI néonatale chez le raton à l'aide de peptides inhibiteurs. Tout d'abord, nous avons démontré que D-JNKI1, un peptide inhibiteur de la voie de JNK présentant de fortes propriétés neuroprotectrices dans des modèles d'ischémie cérébrale adulte ainsi que chez le jeune raton, peut intervenir sur différentes voies de mort dont l'activation des calpaïnes (marqueur de la nécrose précoce), l'activation de la caspase-3 (marqueur de l'apoptose) et l'expression de LC3-II (marqueur de macroautophagie). Malgré ces effets positifs le traitement au D-JNKI1 ne modifie pas l'étendue de la lésion cérébrale. L'action limitée de D-JNKI1 peut s'expliquer par une implication modérée des JNKs (faiblement activées et principalement l'isotype JNK3) après HI néonatale sévère. Au contraire, l'inhibition de la voie de nNOS/p38 par le peptide DTAT-GESV permet une augmentation de 20% du volume du tissu sain à court et long terme. Le second projet a étudié les effets de l'HI néonatale sur l'autophagie neuronale. En effet, l'autophagie est un processus catabolique essentiel au bien-être de la cellule. Le type principal d'autophagie (« macroautophagie » , que nous appellerons par la suite « autophagie ») consiste en la séquestration d'éléments à dégrader (protéines ou organelles déficients) dans un compartiment spécialisé, l'autophagosome, qui fusionne avec un lysosome pour former un autolysosome où le contenu est dégradé par les hydrolases lysosomales. Depuis peu, l'excès ou la dérégulation de l'autoptiagie a pu être impliqué dans la mort cellulaire en certaines conditions de stress. Ce travail démontre que l'HI néonatale chez le raton active fortement le flux autophagique, c'est-à-dire augmente la formation des autophagosomes et des autolysosomes, dans les neurones en souffrance. De plus, la relation entre l'autophagie et l'apoptose varie selon la région cérébrale. En effet, alors que dans le cortex les neurones en voie de mort présentent des caractéristiques mixtes apoptotiques et autophagiques, ceux du CA3 sont essentiellement autophagiques et ceux du CA1 sont principalement apoptotiques. L'induction de l'autophagie après HI néonatale semble donc participer à la mort neuronale soit par l'enclenchement de l'apoptose soit comme mécanisme de mort en soi. Afin de comprendre la relation pouvant exister entre autophagie et apoptase un troisième projet a été réalisé sur des cultures primaires de neurones corticaux exposés à un stimulus apoptotique classique, la staurosporine (STS). Nous avons démontré que l'apoptose induite par la STS était précédée et accompagnée par une forte activation du flux autophagique neuronal. L'inhibition de l'autophagie de manière pharmacologique (3-MA) ou plus spécifiquement par ARNs d'interférence dirigés contre deux protéines autophagiques importantes (Atg7 et Atg5) a permis de mettre en évidence des rôles multiples de l'autophagie dans la mort neuronale. En effet, l'autophagie prend non seulement part à une voie de mort parallèle à l'apoptose pouvant être impliquée dans l'activation des calpaïnes, mais est également partiellement responsable de l'induction des voies apoptotiques (activation de la caspase-3 et translocation nucléaire d'AIF). En conclusion, ce travail a montré que l'inhibition de JNK par D-JNKI1 n'est pas un outil neuroprotecteur efficace pour diminuer la mort neuronale provoquée par l'asphyxie périnatalé sévère, et met en lumière deux autres voies thérapeutiques beaucoup plus prometteuses, l'inhibition de nNOS/p38 ou de l'autophagie. ABSTRACT : Despite enormous progress over the last«decades in obstetrical and neonatal medicine and experimental research, perinatal asphyxia, a situation of lack of oxygen around the time of the birth, remains a major cause of mortality and long term neurological morbidity in children (mental retardation, cerebral palsy, epilepsy, learning difficulties) without any effective treatment. It is therefore essential to develop new therapeutic strategies for the complications of perinatal asphyxia. The overall aim of this work was to identify new therapeutic targets involved in pathological molecular mechanisms induced by hypoxia-ischemia (HI) in the immature brain. For this purpose, the most relevant model of perinatal asphyxia (near term) in rodents has been developed (model of Rice and Vannucci). It consists in the permanent ligation of one common carotid artery (ischemia) in the 7-day-old rat combined with a period of hypoxia at 8% oxygen. This model allows the study of the hypoxic-ischemic lesion in different brain regions including the cortex, hippocampus, striatum and thalamus. The first part of this work addressed the role of two MAPK pathways (JNK and p38) after rat neonatal HI using inhibitory peptides. First, we demonstrated that D-JNKI1, a JNK peptide inhibitor presenting strong neuroprotective properties in models of cerebral ischemia in adult and young rats, could affect different cell death mechanisms including the activation of calpain (a marker of necrosis) and caspase-3 (a marker of apoptosis), and the expression of LC3-II (a marker of macroautophagy). Despite these positive effects, D-JNKI1 did not modify the extent of brain damage. The limited action of D-JNKI1 can be explained by the fact that JNKs were only moderately involved (weakly activated and principally the JNK3 isotype) after severe neonatal HI. In contrast, inhibition of nNOS/p38 by the peptide D-TAT-GESV increased the surviving tissue volume by around 20% at short and long term. The second project investigated the effects of neonatal HI on neuronal autophagy. Indeed, autophagy is a catabolic process essential to the well-being of the cell. The principal type of autophagy ("macroautophagy", that we shall henceforth call "autophagy") involves the sequestration of elements to be degraded (deficient proteins or organelles) in a specialized compartment, the autophagosome, which fuses with a lysosome to form an autolysosome where the content is degraded by lysosomal hydrolases. Recently, an excess or deregulation of autophagy has been implicated in cell death in some stress conditions. The present study demonstrated that rat neonatal HI highly enhanced autophagic flux, i.e. increased autophagosome and autolysosome formation, in stressed neurons. Moreover, the relationship between autophagy and apoptosis varies according to the brain region. Indeed, whereas dying neurons in the cortex exhibited mixed features of apoptosis and autophagy, those in CA3 were primarily autophagíc and those in CA1 were mainly apoptotic. The induction of autophagy after neonatal HI seems to participate in neuronal death either by triggering apoptosis or as a death mechanism per se. To understand the relationships that may exist between autophagy and apoptosis, a third project has been conducted using primary cortical neuronal cultures exposed to a classical apoptotic stimulus, staurosporine (STS). We demonstrated that STS-induced apoptosis was preceded and accompanied by a strong activation of neuronal autophagic flux. Inhibition of autophagy pharmacologically (3-MA) or more specifically by RNA interference directed against two important autophagic proteins (Atg7 and AtgS) showed multiple roles of autophagy in neuronal death. Indeed, autophagy was not only involved in a death pathway parallel to apoptosis possibly involved in the activation of calpains, but was also partially responsible for the induction of apoptotic pathways (caspase-3 activation and AIF nuclear translocation). In conclusion, this study showed that JNK inhibition by D-JNKI1 is not an effective neuroprotective tool for decreasing neuronal death following severe perinatal asphyxia, but highlighted two more promising therapeutic approaches, inhibition of the nNOSlp38 pathway or of autophagy.

Characterization of NALP2 and NALP3 IL-1β processing inflammasomes

Résumé II y a cinq ans, la découverte d'un nouveau domaine, le PYD domaine, lié aux domaines de la mort, a permis la description de la nouvelle famille des NALP protéines. L'analyse structurelle de cette famille de protéines révéla la présence de deux autres domaines, impliqués dans l'oligomerisation, NACHT, et la détection des ligands, Leucine rich repeats ou LRR. Cette architecture protéique est homologue à celle qui est décrite pour les NODs, les Tol1 récepteurs et tes protéines de résistance chez les plantes. Cette homologie suggère une possible implication des NALPs dans la régulation de l'immunité innée. Premièrement, nous avons décrit les composants minimaux qui permettent à l'inflammasomeNALP3 d'activer la caspase pro-inflammatoire, caspase-1. En comparaison à NALP1, NALP3 ne contient pas de FIIND domaine, ni de CARD domaine en C-terminus et n'interagit pas avec caspase-5. Nous avons découvert une protéine très homologue au C-terminus de NALP1, Cardinal, qui se lie au NACHT domaine de NALP2 et NALP3 par l'intermédiaire de son FIIND domaine. Cardinal possède la capacité d'interagir avec caspase-l, mais seul ASC semble être nécessaire à la maturation de la prointerleukine-1β suite à la stimulation de NALP3. Deuxièmement, notre étude s'est concentrée sur la nature du stimulus capable d'induire la formation et l'activation de l'inflammasome-NALP3. Nous avons démontré que l'ajout de muramyl dipeptide (MDP), produit à partir de la digestion enzymatique de peptidoglycaris bactériens, induit à la fois l'expression de la proIL-1β par la voie NOD2 et sa maturation en IL-1β active par la voie NALP3. Bien que le MDP active l'inflammasome-NALP3, il est incapable d'induire la sécrétion de l'IL-1β mature dans la lignée cellulaire THP1, comparé aux monocytes primaires humains. Cette différence pourrait être liée à l'absence, dans les THP1, de la protéine Filamin, qui est proposée d'interagir avec Cardinal. L'implication de NALP3 dans la maturation de l'IL-lb est confirmée suite à la découverte de mutations sur le gène CIAS1/NALP3/cryopyrin associées à trois maladies auto-inflammatoires : le syndrome de Muckle-Wells (MWS), l'urticaire familial au froid (FCU) et le syndrome CINCA/NOMID. Une élévation constitutive de la maturation et de la sécrétion de la proIL-1β en absence de stimulation MDP est détectée dans les macrophages des patients Muckle-Wells. En conclusion, nos études ont démontré que l'inflammasome-NALP3 doit être finement régulé pour éviter une activité incontrôlée qui représente la base moléculaire des symptômes associés aux syndromes auto-inflammatoires liés à NALP3. Summary Five years ago, the description of the NALP family originated from the discovery of a new death-domain fold family, the PYD domain. NALP contains aprotein-protein interaction domain (PYD), an oligomerization domain (NACHT) and a ligand-sensing domain, leucine rich repeats or LRR. This protein architecture shares similarity with receptors involved in immunity, such as NODS, Toll receptors (TLRs) and related plant resistance proteins, and points to an important role of NALPs in defense mechanisms. We first described the minimal complex involved in the pro-inflammatory Interleukin-1beta (IL-1β) cytokine maturation, called the inflammasome, which contains NALP3. In contrast to NALP1, NALP3, like other members of the NALP family, is devoid of C-terminal FIIND and CARD domains and does not interact with the pro-inflammatory caspase-5. Interestingly, a homolog of the C-terminal portion of NALP1 was found in the human genome and was named Cardinal. We found that NALP2 and NALP3 interact with the CARD-containing proteins Cardinal. Cardinal is able to bind to caspase-1 but is not required for IL-1β maturation through NALP3 activation, as demonstrated for the adaptor ASC. Secondly, our study focused on the stimuli involved in the activation of the NALP3 inflammasome. MDP was shown to induce the expression of proIL1β through NOD2 and then the maturation into active IL-1β by activation of the NALP3 inflammasome. However, in the monocytic THP1 cell line, secretion of IL-1β upon MDP stimulation seems to be independent of the inflammasome activation compared to human primary monocytes. This difference might be linked to a Cardinal-interacting protein, filamin. Until now, the role of Cardinal and filamin is still unknown and remains to be elucidated. Finally, mutations in the NALP3/cryopyrin/CIAS1 gene are associated with three autoinflammatory diseases: Muckle-Wells syndrome, familial cold autoinflammatory syndrome, and CINCA. Constitutive, elevated IL-1β maturation and secretion, even in the absence of MDP stimulation, was observed in macrophages from Muckle-Wells patients and confirmed a key role for the NALP3 inflammasome in innate immunity In conclusion, our studies describes the formation of the NALP3 inflammasome and suggests that this complex has to be tightly regulated to avoid an increased deregulated inflammasome activity that is the molecular basis for the symptoms associated with NALP3-dependent autoinflammatory disorders.

Analysis of CD4+ and CD8+ T cells by defined MHC-peptide complexes

MHC class II-peptide multimers are important tools for the detection, enumeration and isolation of antigen-specific CD4+ Τ cells. However, their erratic and often poor performance impeded their broad application and thus in-depth analysis of key aspects of antigen-specific CD4+ Τ cell responses. In the first part of this thesis we demonstrate that a major cause for poor MHC class II tetramer staining performance is incomplete peptide loading on MHC molecules. We observed that peptide binding affinity for "empty" MHC class II molecules poorly correlates with peptide loading efficacy. Addition of a His-tag or desthiobiotin (DTB) at the peptide N-terminus allowed us to isolate "immunopure" MHC class II-peptide monomers by affinity chromatography; this significantly, often dramatically, improved tetramer staining of antigen-specific CD4+ Τ cells. Insertion of a photosensitive amino acid between the tag and the peptide, permitted removal of the tag from "immunopure" MHC class II-peptide complex by UV irradiation, and hence elimination of its potential interference with TCR and/or MHC binding. Moreover, to improve loading of self and tumor antigen- derived peptides onto "empty" MHC II molecules, we first loaded these with a photocleavable variant of the influenza A hemagglutinin peptide HA306-318 and subsequently exchanged it with a poorly loading peptide (e.g. NY-ESO-1119-143) upon photolysis of the conditional ligand. Finally, we established a novel type of MHC class II multimers built on reversible chelate formation between 2xHis-tagged MHC molecules and a fluorescent nitrilotriacetic acid (NTA)-containing scaffold. Staining of antigen-specific CD4+ Τ cells with "NTAmers" is fully reversible and allows gentle cell sorting. In the second part of the thesis we investigated the role of the CD8α transmembrane domain (TMD) for CD8 coreceptor function. The sequence of the CD8α TMD, but not the CD8β TMD, is highly conserved and homodimerizes efficiently. We replaced the CD8α TMD with the one of the interleukin-2 receptor a chain (CD8αTac) and thus ablated CD8α TMD interactions. We observed that ΤΙ Τ cell hybridomas expressing CD8αTacβ exhibited severely impaired intracellular calcium flux, IL-2 responses and Kd/PbCS(ABA) P255A tetramer binding. By means of fluorescence resonance energy transfer experiments (FRET) we established that CD8αTacβ associated with TCR:CD3 considerably less efficiently than CD8αβ, both in the presence and the absence of Kd/PbCS(ABA) complexes. Moreover, we observed that CD8αTacβ partitioned substantially less in lipid rafts, and related to this, associated less efficiently with p56Lck (Lck), a Src kinase that plays key roles in TCR proximal signaling. Our results support the view that the CD8α TMD promotes the formation of CD8αβP-CD8αβ dimers on cell surfaces. Because these contain two CD8β chains and that CD8β, unlike CD8α, mediates association of CD8 with TCR:CD3 as well as with lipid rafts and hence with Lck, we propose that the CD8αTMD plays an important and hitherto unrecognized role for CD8 coreceptor function, namely by promoting CD8αβ dimer formation. We discuss what implications this might have on TCR oligomerization and TCR signaling. - Les multimères de complexes MHC classe II-peptide sont des outils importants pour la détection, le dénombrement et l'isolation des cellules Τ CD4+ spécifiques pour un antigène d'intérêt. Cependant, leur performance erratique et souvent inadéquate a empêché leur utilisation généralisée, limitant ainsi l'analyse des aspects clés des réponses des lymphocytes Τ CD4+. Dans la première partie de cette thèse, nous montrons que la cause principale de la faible efficacité des multimères de complexes MHC classe II-peptide est le chargement incomplet des molécules MHC par des peptides. Nous montrons également que l'affinité du peptide pour la molécule MHC classe II "vide" n'est pas nécessairement liée au degré du chargement. Grâce à l'introduction d'une étiquette d'histidines (His-tag) ou d'une molécule de desthiobiotine à l'extrémité N-terminale du peptide, des monomères MHC classe II- peptide dits "immunopures" ont pu être isolés par chromatographic d'affinité. Ceci a permis d'améliorer significativement et souvent de façon spectaculaire, le marquage des cellules Τ CD4+ spécifiques pour un antigène d'intérêt. L'insertion d'un acide aminé photosensible entre l'étiquette et le peptide a permis la suppression de l'étiquette du complexe MHC classe- Il peptide "immunopure" par irradiation aux UV, éliminant ainsi de potentielles interférences de liaison au TCR et/ou au MHC. De plus, afin d'améliorer le chargement des molécules MHC classe II "vides" avec des peptides dérivés d'auto-antigènes ou d'antigènes tumoraux, nous avons tout d'abord chargé les molécules MHC "vides" avec un analogue peptidique photoclivable issu du peptide HA306-318 de l'hémagglutinine de la grippe de type A, puis, sous condition de photolyse, nous l'avons échangé avec de peptides à chargement faible (p.ex. NY-ESO-1119-143). Finalement, nous avons construit un nouveau type de multimère réversible, appelé "NTAmère", basé sur la formation chélatante reversible entre les molécules MHC-peptide étiquettés par 2xHis et un support fluorescent contenant des acides nitrilotriacetiques (NTA). Le marquage des cellules Τ CD4+ spécifiques pour un antigène d'intérêt avec les "NTAmères" est pleinement réversible et permet également un tri cellulaire plus doux. Dans la deuxième partie de cette thèse nous avons étudié le rôle du domaine transmembranaire (TMD) du CD8α pour la fonction coréceptrice du CD8. La séquence du TMD du CD8α, mais pas celle du TMD du CD8β, est hautement conservée et permet une homodimérisation efficace. Nous avons remplacé le TMD du CD8α avec celui de la chaîne α du récepteur à l'IL-2 (CD8αTac), éliminant ainsi les interactions du TMD du CD8α. Nous avons montré que les cellules des hybridomes Τ T1 exprimant le CD8αTacβ présentaient une atteinte sévère du flux du calcium intracellulaire, des réponses d'IL-2 et de la liaison des tétramères Kd/PbCS(ABA) P255A. Grâce aux expériences de transfert d'énergie entre molécules fluorescentes (FRET), nous avons montré que l'association du CD8αTacβ avec le TCR:CD3 est considérablement moins efficace qu'avec le CD8αβ, et ceci aussi bien en présence qu'en absence de complexes Kd/PbCS(ABA). De plus, nous avons observé que le CD8αTacβ se distribuait beaucoup moins bien dans les radeaux lipidiques, engendrant ainsi, une association moins efficace avec p56Lck (Lck), une kinase de la famille Src qui joue un rôle clé dans la signalisation proximale du TCR. Nos résultats soutiennent l'hypothèse que le TMD du CD8αβ favorise la formation des dimères de CD8αβ à la surface des cellules. Parce que ces derniers contiennent deux chaînes CD8β et que CD8β, contrairement à CD8α, favorise l'association du CD8 au TCR:CD3 aussi bien qu'aux radeaux lipidiques et par conséquent à Lck, nous proposons que le TMD du CD8α joue un rôle important, jusqu'alors inconnu, pour la fonction coreceptrice du CD8, en encourageant la formation des dimères CD8αβ. Nous discutons des implications possibles sur l'oligomerisation du TCR et la signalisation du TCR.

Role of PPARβ in keratinocyte adhesion and migration during skin wound healing

RESUME L'homéostasie du tissu cutané est assurée par des interactions étroites entre les cellules le composant et par l'équilibre entre la différenciation et la prolifération des kératinocytes devant permettre un renouvellement constant du tissu. Après une blessure, les kératinocytes environnant la zone blessée sont activés par des cytokines. Ils acquièrent alors un phénotype migratoire qui s'accompagne d'une modulation de l'activité protéolytique de la matrice extra cellulaire, d'une modulation de la dynamique du cytosquelette d'active, de la polarisation de la cellule, de l'affaiblissement des contacts entre cellules et de changements dans leurs contacts avec la matrice extra cellulaire. PPARβ est un facteur de transcription activé par les acides gras et leurs dérivés. Il appartient à la famille des récepteurs nucléaires aux hormones et son expression est avérée dans les kératinocytes des follicules pileux et dans les kératinocytes inter-folliculaires activés par la blessure cutanée. Le rôle de PPARβ dans la peau est principalement lié à son effet protecteur contre l'apoptose ainsi qu'à son implication dans l'équilibre dynamique entre la prolifération et la différentiation des kératinocytes. L'objet de ce travail fut de déterminer le rôle de PPARβ dans les processus d'adhésion et de migration des kératinocytes activés durant la régénération de l'épithélium blessé. Nous avons montré que les souris dépourvues du gène codant pour PPARβ ont de sévères imperfections affectant la morphologie de l'épithélium. Ce phénotype est corrélé à la modulation imparfaite du réseau d'active chez les souris dépourvues de PPARβ, à un défaut de localisation de l'intégrine α3 impliquée dans les complexes induisant la migration cellulaire, ainsi qu'à la modulation de l'expression d'acteurs majeurs affectant l'activité protéolytique de la matrice extra cellulaire. En conclusion, nos résultats montrent que PPARβ est impliqué dans le contrôle de la dynamique du cytosquelette d'active et la polarisation des kératinocytes activés. PPARβ étant impliqué dans l'acquisition d'un phénotype migratoire, il est légitime de se demander s'il intervient de même dans d'autres types cellulaires, par exemple dans la transition épithéliale-mésenchymateuse durant le développement, ou encore la progression de cellules tumorales. SUMMARY Highly coordinated intercellular interactions and single cell metabolism ensure cell and tissue maintenance of the skin. Healing of a skin wound involves keratinocyte activation by cytokines and growth factors. Activated keratinocytes acquire a motile phenotype that requires extracellular matrix remodeling and subsequent ligand activation through proteolytic activity, as well as cytoskeletal reorganisation induced by the release of cell-cell junctions and by the signalling relayed via integrin receptors and their cytoplasmic adaptors. PPARβ is a transcription factor activated by polyunsaturated fatty acids and fatty acid derivatives which belong to the nuclear hormone receptor superfamily. It is expressed in activated keratinocytes where it plays an essential role in protecting them from apoptosis. In addition, it plays an important function in hair follicle morphogenesis at the time of elongation, via the regulation of the balance between keratinocyte differentiation and proliferation. The aim of the present work was to determine if PPARβ is also involved in the regulation of migration and adhesion properties of keratinocytes during skin wound healing. We have shown that wounded PPARβ null mice display severe abnormalities of the keratinocyte migratory layer as shown at the histological level and using three-dimensional reconstruction. This altered migratory phenotype is correlated to altered dynamic of the actin cytoskeleton network, impaired α3 integrin localisation in migrating keratinocytes and changes in the expression of a key actor involved in extracellular matrix proteolytic activity. These results show that PPARβ is implicated in the fine tuning of the actin network organisation and the polarisation of activated keratinocytes following an epithelial wound. Whether these mechanisms are also controlled by PPARβ in other cell types during epithelial mesenchymal transition or tumour cell progression is an interesting question to rise.

Development and evaluation of antibody-MHC/peptide conjugates as a new form of cancer immunotherapy

Summary One of the major goals of cancer immunotherapy is the induction of a specific and effective antitumor cytotoxic T lymphocyte (CTL) response. However, the downregulation of Class I Major Histocompatibility Complexes (MHC) expression and the low level of tumor peptide presentation on tumor cell surface, ás well as the low immunogenicity of tumor specific antigens, limit the effectiveness of anti-tumor CTL responses. On the other hand, monoclonal antibodies, which bind with high affinity to tumor cell surface markers, are powerful tumor targeting tools. However, their capacity to .kill cancer cells is limited and mAb cancer treatments usually require the addition of different form of chemotherapy. The new cancer immunotherapy strategy described herein combines the advantage of the high tumor targeting capacity of monoclonal antibodies (mAb) with the powerful cytotoxicity of CD8 T lymphocytes directed against highly antigenic peptide-MHC complexes. Monoclonal antibody Fab fragments directed against a cell surface tumor associated antigen (TAA) are chemically coupled to soluble MHC class I complexes carrying a highly antigenic peptide. Antibody guided targeting and oligomerization of numerous antigenic class IMHC/peptide complexes on tumor cell surfaces can redirect the cytotoxicity of peptide-specific CD8 T cells towards target cancer cells. After the description of the production of murine anti-tumor xMHC/peptide conjugates in the first part of this thesis, the therapeutic potential of such conjugates were sequentially investigated in different syngeneic tumor mouse models. As a first proof of principle, transgenic OT-1 mice and later CEA transgenic C57BL/6 (B6) mice, adoptively transferred with OT-1 spleen cells and immunized with ovalbumin, were used as a model of high frequency of ova peptide specific T cells. In these mice, growth inhibition and regression of palpable colon carcinoma expressing CEA, were obtained by systemic injection of anti-CEA Fab/H-2Kb/ova peptide conjugates. Next, LCMV virus and influenza virus infection of B6 mice were used as viral models to redirect natural antiviral CTL responses to tumors via conjugates loaded with viral peptides. We showed that in mice infected with the LCMV virus, subcutaneous CEA-expressing tumor cells were inhibited by the H2Db/GP33 restricted anti-viral CTL response when preincubated before grafting with anti-CEA Fab-H-2Db/GP33 peptide conjugates. In mice infected with the influenza virus, lung metastases expressing the HER2 antigen were inhibited by the H-2Db/NP366 restricted CTLs response when preincubated before injection with anti-Her2 Fab-H-2Db/NP366 peptide conjugates. In the last chapter, the stability of the peptide in the anti-CEA Fab-H-2Db/GP33 conjugates was improved by the covalent photocross-link of the GP33 peptide in the H-2Db MHC groove. Thus, LCMV immune mice could reject CEA expressing tumors when treated with systemic injections of anti-CEA FabH-2Db/GP33 cross-linked conjugates. These results are encouraging for the potential application of this strategy in clinic. Such conjugates could be used alone in patients boosted by the relevant virus, or used in combination with existing T cell based ìmmunotherapy. Résumé Une des principales approches utilisées dans l'immunothérapie contre le cancer consiste en l'induction d'une réponse T cytotoxique (CTL) spécifiquement dirigée contre la tumeur. Cependant, le faible niveau d'expression des complexes majeurs d'histocompatibilité de classe I (CMH I) et de présentation des peptides tumoraux à la surface des cellules cancéreuses ainsi que la faible immunogenicité des antigens tumoraux, limitent l'efficacité de la réponse CTL. D'autre part,. l'injection d'anticorps monoclonaux (mAb), se liant avec une haute affinité aux marqueurs de surface des cellules tumorales, a fourni des résultats cliniques encourageant. Cependant l'efficacité de ces mAbs contre des tumeur solides reste limitée et necessite souvent l'addition de chimiotherapie. La nouvelle stratégie thérapeutique décrite dans ce travail associe le fort pouvoir de localisation des anticorps monoclonaux et le fort pouvoir cytotoxique des lymphocytes T CD8+. Des fragments Fab d'anticorps monoclonaux, dirigés contre des antigènes surexprimés à la surface de cellules tumorales, ont été chimiquement couplés à des CMH I solubles, portant un peptide fortement antigénique. Le ciblage et l'oligomérisation à la surface des cellules tumorales de nombreux CMH I présentant un peptide antigénique, va réorienter la cytotoxicité des cellules T CD8+ spécifiques du peptide présenté, vers les cellules tumorales cibles. Après une description de la production de conjugé anti-tumeur x CMH Upeptide dans la première partie de cette thèse, le potentiel thérapeutique de tels conjugés a été successivement étudiés in vivo dans différents modèles de tumeur syngénéiques. Tout d'abord, des souris OT-1 transgéniques, puis des souris C57BL/6 (B6) transférées avec des cellules de rate OT-1 puis immunisées avec l'ovalbumine, ont été employées comme modèle de haute fréquence de cellules T CD8+ spécifiques du peptide ova. Chez ces souris, l'inhibition de la croissance et la régression de nodules palpables de carcinomes exprimant l'antigène caccino embryonaire (ACE), ont été obtenues par l'injection systémique de conjugés anti-ACE Fab/H-2Kb/ova. Par la suite, l'infection de souris B6 par le virus LCMV et par le virus de la grippe, ont été utilisés comme modèles viraux pour redirigées des réponses anti-virales naturelles vers les tumeurs, en utilisant des conjugés chargés avec des peptides viraux. Nous avons montré que .chez les souris infectées par le LCMV, la croissance de carcinome sous-cutané est empêchée par la réponse anti-virale, spécifique du complexe H2Db/GP33, lorsque les cellules tumorales greffées sont pré-incubées avec des conjugés anti-CEA Fab-H-2Db/GP33. Dans le cas de souris infectées par le virus de la grippe, la métastatisation de mélanomes pulmonaires exprimant l'antigène HER-2 est inhibée par la réponse anti-virale spécifique du complexe H-2Db/NP366, après pré-incubation des cellules tumorales avec des conjugés anti-Her2 FabxH-2Db/NP366. Dans le dernier chapitre, la liaison covalente du peptide GP33 dans le complexe H-2Db a amélioré la stabilité des conjugés correspondants et a permis le traitement systémique de souris greffées avec des tumeurs exprimant l'ACE et infectées par le LCMV. L'ensemble de ces résultats sont encourageant pour l'application de cette strategie en clinique. De tels conjugués pourraient être employés seuls ou en combinaison avec des protocols d'immunisation peptidique anti-tumoral. Résumé pour un large public Dans les pays industrialisés, le cancer se situe au deuxième rang des causes de mortalité après les maladies cardiovasculaires. Les principaux traitement de nombreux cancers sont la chirurgie, en association avec la radiothérapie et la chimiothérapie. L'immunothérapie est l'une des nouvelles approches mises en oeuvre pour la lutte contre le cancer. Elle peut être humorale, et s'appuyer alors sur la perfusion d'anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes tumoraux, par exemple les anticorps dirigés contre les protéines oncogéniques Her-2/neu dans le cancer du sein. Ces anticorps ont le grand avantage de spécifiquement se localiser à la tumeur et d'induire la lyse ou d'inhiber la proliferation des cellules tumorales exprimant l'antigène. Certains sont utilisés en clinique pour le traitement de lymphomes, de carcinomes de l'ovaire et du sein ou encore de carcinomes metastatiques du côlon. Cependant l'efficacité de ces anticorps contre des tumeurs solides reste limitée et les traitements exigent souvent d'être combiner avec de la chimiothérapie. L'immunothérapie spécifique peut également être cellulaire et reposer sur une démarche de type vaccinal, consistant à générer des lymphocytes T cytotoxiques (cytotoxic T lymphocytes :CTL) capables de détruire spécifiquement les cellules malignes. Pour obtenir une réponse lymphocytaire T cytotoxique antitumorale, la cellule T doit reconnaître un antigène associé à la tumeur, présenté sous forme de peptide dans un complexe majeur d'histocompatibilité de classe I. Or les cellules tumorales ne presentent pas efficacement les peptides antigèniques, car elles se caractérisent par une diminution ou une absence d'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe I, des molécules d'adhésion et des cytokines costimulatrices, et par une faible expression des antigènes associés aux tumeurs. C'est en partie pourquoi, malgré l'induction de fortes réponses CTL specifiquement dirigés contre des antigens tumoraux, les régressions tumorales obtenus grace à ces vaccinations sont relativement rares. Alors que chez les personnes atteintes du cancer on observe l'instauration d'une tolérance immunitaire vis-à-vis de la tumeur, à l'inverse, notre systeme immunitaire reste parfaitement capable de combattre des infection virales classiques, tels que la grippe, qui font aussi appel à une réponse T cytotoxique. Notre groupe de recherche a donc eu l'idee de développer une nouvelle approche thérapeutique où une réponse immunitaire anti-virale très efficace serait redirigée vers les tumeurs par des anticorps monoclonaux. Concrètement, nous avons chimiquement couplés des fragments d'anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes surexprimés à la surface de cellules tumorales, à des CMH I portant un peptide viral antigénique. Les cellules tumorales, ciblées par le fragment anticorps et couvertes d' antigènes viraux présentés par des molécules de CMH I, peuvent ainsi tromper les lymphocytes cytotoxiques anti-viraux qui vont détruire les cellules tumorales comme si elles étaient infectées par le virus. Suite à des résultats prometteurs obtenus in vitro avec différents conjugués anticorps-CMH humain de type HLA.A2/peptide Flu, le but du projet était de tester in vivo des conjugués anticorps-CMH I murins sur des modèles expérimentaux de souris. Tout d'abord, des souris transgéniques pour un recepteur T specifique du peptide ova, puis des transferts adoptifs de ces cellules T specifiques dans des souris immunocompétentes, ont été choisi comme modèle de haute fréquence des cellules T spécifiques, et ont permi de valider le principe de la strategie in vivo. Puis, deux modèles viraux ont été elaboré avec le virus LCMV et le virus Influenza, pour réorienter des réponses antivirales naturelles vers les tumeurs grâce à des conjugés chargés avec des peptides viraux. Nous avons montré la grande capacité de nos conjugués à rediriger des réponses cytotoxiques vers les tumeurs et inhiber la croissance de tumeurs syngénéiques sous cutanés et pulmonaires. Ces résultats d'inhibition tumorales obtenus dans des souris immunocompétentes, grâce à l'injection de conjugués anticorps xCMH/peptide et réorientant deux réponses antivirales différentes vers deux modèles tumoraux syngeneiques, sont encourageant pour l'application de cette nouvelle stratégie en clinique.

Characterization of the effects of radiation therapy on the tumour microenvironment and their consequences on cancer progression

RESUME La radiothérapie est utilisée avec succès pour le traitement d'un grand nombre de pathologies tumorales (1). Cependant, les récidives post-actiniques sont associées à un risque accru de développer des métastases régionales et à distance (2, 3). La prise en charge de ce type de patients demeure insatisfaisante à l'heure actuelle, principalement parce que les mécanismes physio-pathologiques sous- sous-jacents restent mal compris. Etant donné le rôle primordial du stroma dans la progression tumorale (4) et l'importance des effets de la radiothérapie sur le micro-environnement des tumeurs (5), nous avons émis l'hypothèse que la radiothérapie pouvait engendrer des modifications stromales susceptibles de contribuer à l'émergence d'un phénotype tumoral plus agressif. Nous avons observé que l'exposition préalable d'un environnement tumoral à des radiations ionisantes engendre une inhibition locale et à long terme de l'angiogenèse. Cette inhibition conduit à la création d'un environnement tumoral hypoxique favorisant l'invasion et la métastatisation tumorale. Les mécanismes sous-jacents impliquent l'activation de gènes prométastatiques sous le contrôle du facteur de transcription HIF-1, ainsi que la sélection hypoxique de cellules hautement invasives et métastatiques. Par des analyses de profile d'expression génétique ainsi que par des analyses fonctionnelles, nous avons identifié la protéine matri-cellulaire CYR61 ainsi que ses partenaires d'interaction, les intégrines aVb5/aVb3, comme médiateurs importants de ces effets. De plus, une corrélation significative a également été trouvée entre le niveau d'expression de CYR61 et le taux d'hypoxie dans un grand nombre de carcinomes mammaires chez l'humain. Une association a aussi été observée entre le niveau d'expression de CYR61 et le pronostic de patientes souffrant d'un cancer du sein traité par chimiothérapie adjuvante. Globalement ces résultats identifient l'interaction entre la protéine CYR61 et ses récepteurs aVb5/aVb3 comme un mécanisme important du processus de métastatisation et en font une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de patients souffrant d'une récidive tumorale après un traitement de radiothérapie. Finalement, bien que l'inhibition de l'angiogenèse soit locale dans ce cas particulier, nos résultats justifient une surveillance particulière des patients souffrant d'une pathologie tumorale et étant au bénéfice d'un traitement inhibiteur de l'angiogenèse. SUMMARY Radiotherapy is successfully used to treat a large variety of tumours (1 ). However, cancer patients experiencing local recurrent disease after radiation therapy are at increased risk of developing regional and distant metastasis (2, 3). The clinical management of this condition represents a difficult and challenging issue, mainly because the underlying physio-pathological mechanisms remain poorly understood. Given the well established role of the tumour stroma in promoting cancer progression (4) and since radiotherapy is known to persistently alter the tumour microenvironment (5), we hypothesized that ionising radiations may generate stromal modifications contributing to the metastatic spread of relapsing tumours. Here, we report that irradiation of the prospective tumour microenvironment promotes tumour invasion and metastasis through a mechanism of local and sustained impairment of angiogenesis leading to both HIF-1 dependent activation of pro-metastatic genes and hypoxia-mediated selection of highly metastatic tumour cell variants. Through gene expression profiling and functional experiments, we identified the matricellular signalling protein CYR61 and its interaction partners aVb5/ aVb3 integrins as critical mediators of these effects. Furthermore, we found a significant correlation between CYR61 expression and the hypoxic status of a large number of human mammary carcinomas. A positive correlation between increased levels of CYR61 expression and shorter relapse free survival was also identified in breast cancer patients treated with adjuvant chemotherapy. Together, these results identify CYR61 and aVb5/aVb3 integrins as critical mediators of metastasis and potential therapeutic targets to improve outcome in patients with post-radiation tumour recurrences. Finally, although inhibition of angiogenesis is local in this setting, our data warrant close monitoring of tumour progression in patients under anti-angiogenic therapy.

Functional analysis of human POT1 and RPA : insights into the role of single stranded DNA binding proteins at telomeres

Abstract Telomeres, the natural ends of chromosomes, need to be protected from chromosome end fusions, aberrant homologous recombination and degradation. In humans, chromosome ends are specified through arrays of tandemly repeated 5'-TTAGGG-3' hexamers, ending in a 3' overhang. A complex formed by the six proteins TRF1, TRF2, hRap1, TIN2, TPP1 and POT1 specifically assocìates with and protects telomeres. Telomeres are maintained by semiconservative DNA replication and by a specialized reverse transcriptase, telomerase, that carries an RNA subunit which templates new telomeric repeat synthesis. The telomeric single stranded (ss) DNA binding protein POT1 protects the telomeric 3' overhang and modulates telomerase-mediated telomere elongation. It is possible that POT1 also influences DNA synthesis during semiconservative DNA replication, which is initiated by the DNA polymerase alpha-primase complex. The heterotrimeric ss DNA-binding protein RPA plays essential roles during DNA replication. RPA binds to ss DNA with high affinity in order to stabilize ss DNA and facilitate nascent strand synthesis at the replication fork. Here we investigate how the two proteins RPA and POT1 contribute to telomere maintenance by regulating semi-conservative DNA replication and telomerase. Using chromatin immunoprecipitation experiments, we show that RPA associates with telomeres during S-phase. Analysis of telomere structure in cells shRNA-depleted for RPA and POT1 reveals that loss of RPA and POT1 causes exposure of single-stranded DNA at telomeres, suggestive of incomplete DNA replication. Biochemical experiments using purified recombinant POT1 and RPA show that saturating telomeric oligonucleotides with POT1 or RPA reduces the primase activity of the DNA polymerase alpha-primase complex and the overall activity of telomerase. POT1 and RPA also increase the primer extension by DNA polymerase alpha-primase complex and the processivity of telomerase under certain conditions, although POT1 increases the activities to a greater extent than RPA. We propose that POT1 is required for proper replication of the lagging strand of telomeres and that some phenotypes observed in POT1-depleted cells may stern from incomplete DNA replication rather than de-protection of the single-stranded overhang. Résumé Les télomères, les extrémités normales des chromosomes linéaires, doivent être protégés des fusions chromosomiques, d'événements de recombinaison homologue aberrants et de phénomènes de dégradation. Chez l'Homme, les extrémités des chromosomes sont constitués d'ADN double brin répétitif de séquence 5'-TTAGGG-3', d'une extension simple brin 3' sortante et d'un complexe protéique formé des six facteurs TRF1, TRF2, hRap1, TIN2, TPP1 et POT1 qui, s'associant à cette séquence, protègent l'ADN télomèrique. Les télomères sont maintenus par la télomérase, une transcriptase inverse capable d'allonger l'extension 3' sortante télomérique. POT1 lie l'ADN simple brin télomérique et module l'élongation des télomères par la télomérase. POT1 pourrait en théorie également influencer la réplication semi-conservative de l'ADN. L'ADN-polymérase Pal alpha-primase amorce et initie la synthèse d'ADN. Pendant la réplication, l'ADN simple brin est stabilisé par RPA, un complexe hétérotrimèrique qui lie l'ADN simple brin. RPA facilite la synthèse du brin naissant à la fourche de réplication. Ici nous avons étudié comment ces deux protéines qui lient l'ADN simple brin, RPA et POT1, régulent la réplication des télomères par la télomérase et la machinerie classique de réplication de l'ADN. Par immunoprécipitation de chromatine (ChIP), nous montrons que RPA est localisé aux télomères lors de la phase S du cycle cellulaire. De plus, l'analyse de la structure des télomeres indique que !a perte de RPA ou de POT1 conduit à l'apparition d'ADN simple brin télomérique, suggérant une réplication incomplète de l'ADN télomérique in vivo. Par une approche complémentaire biochimique utilisant les protéines POT1 et RPA recombinantes purifiées, nous montrons également que la liaison de POT1 ou de RPA à des oligonucléotides télomériques bloque l'activité primase du complexe polymérase alpha/primase et réduit l'activité télomérase sur ces substrats. En revanche, leur liaison augmente l'activité ADN-polymérase du complexe polymérase alpha/primase, ainsi que fa processivité de la télomérase dans certaines conditions, POT1 étant le plus efficace des deux facteurs. Nous proposons que POT1 est nécessaire à la réplication du brin retardé au niveau des télomères, ce qui suggère que certains phénotypes des cellules déplétés en POT1 puissent résulter d'une réplication incomplète de l'ADN télémétrique plutôt que d'une déprotection de l'extrémité sortante des télomères.

Expression of apoptosis and survival genes in human memory T cell populations

RESUME Introduction: Les cellules T mémoires humaines sont classées en trois sous-populations sur la base de l'expression d'un marqueur de surface cellulaire, CD45RA, et du récepteur aux chimiokines, CCR7. Ces sous-populations, nommées cellules mémoires centrales (TcM), mémoires effectrices (TEM) et mémoires effectrices terminales (ITEM), ont des rôles fonctionnels distincts, ainsi que des capacités de prolifération et de régénération différentes. Cependant, la génération de ces différences reste encore mal comprise et on ignore les mécanismes moléculaires impliqués. Matériaux et Méthodes: Des cellules mononucléaires humaines du sang périphérique ont été séparées par cytométrie de flux selon leur expression de CD4, CD8, CD45RA et CCR7 en sous-populations de cellules CD4+ ou CD8+ naïves, TcM, TEM ou ITEM. Dans chacune de ces sous-populations, 14 gènes impliqués dans l'apoptose, la survie ou la capacité proliférative des cellules T ont été quantifiés par RT-PCR en temps réel, relativement à l'expression d'un gène de référence endogène. L'ARN provenant de 450 cellules T a été utilisé par gène et par sous-population. Les gènes analysés (cibles) comprenaient des gènes de survie (BAFF, APRIL, BAFF-R, BCMA, TACI, IL-15Rα, IL-7Rα), des gènes anti-apoptotiques (Bcl-2, BclxL, FLIP), des gènes pro-apoptotiques (Bad, Bax, Fast) et le gène anti-prolifératif, Tob. A l'aide de la méthode comparative delta-delta-CT, le taux d'expression des gènes cibles de chaque sous-population des cellules T mémoires CD4+ et CD8+, à été comparée à leur taux d'expression dans les cellules T naïves CD4+ et CD8+. Résultats: Dans les cellules CD8+, les gènes pro-apoptotiques Bax et Fast étaient surexprimés dans toutes les sous-populations mémoires, tandis que l'expression des facteurs anti-apoptotiques et de survie comme Bcl-2, APRIL et BAFF-R, étaient diminués. Ces deux tendances étaient particulièrement accentuées dans les sous-groupes des cellules mémoires TEM et TTEM. A noter que malgré le fait que leur expression était également diminuée dans les autres cellules mémoires, le facteur de survie IL-7Ra, était sélectivement surexprimé dans la sous-population de cellules TcM et l'expression d'IL-15Ra était sélectivement augmentée dans les TEM. Dans les cellules CD4+, le taux d'expression des gènes analysés était plus variable entre les sujets étudiés que dans les cellules CD8+, ne permettant pas de définir un profil d'expression spécifique. L'expression du gène de survie BAFF par contre, a été significativement augmentée dans toutes les sous-populations mémoire CD4+. Il en va de même pour l'expression d' APRIL et de BAFF-R, bien que dans moindre degré. A remarquer que l'expression du facteur anti-apoptotique Fast a été observée uniquement dans la souspopulation des TTEM. Discussion et Conclusions: Cette étude montre une nette différence entre les cellules CD8+ et CD4+, en ce qui concerne les profils d'expression des gènes impliqués dans la survie et l'apoptose des cellules T mémoires. Ceci pourrait impliquer une régulation cellulaire homéostatique distincte dans ces deux compartiments de cellules T mémoires. Dans les cellules CD8+ l'expression d'un nombre de gènes impliqués dans la survie et la protection de l'apoptose semblerait être diminuée dans les populations TEM et TTEM en comparaison à celle des sous-populations naïves et TEM, tandis que l'expression des gènes pro-apoptotiques semblerait être augmentée. Comme ceci paraît être plus accentué dans les TTEM, cela pourrait indiquer une plus grande disposition à l'apopotose dans les populations CCR7- (effectrices) et une perte de survie parallèlement à l'acquisition de capacités effectrices. Ceci parlerait en faveur d'un modèle de différentiation linéaire dans les cellules CD8+. De plus, l'augmentation sélective de l'expression d'IL-7Ra observée dans le sous-groupe de cellules mémoires TEM, et d'IL-15Ra dans celui des TEM, pourrait indiquer un moyen de sélection pour des réponses immunitaires mémoires à long terme par une réponse distincte à ces cytokines. Dans les cellules CD4+ par contre, aucun profil d'expression n'a pu être déterminé; les résultats suggèrent même une résistance relative à l'apoptose de la part des cellules mémoires. Ceci pourrait favoriser l'existence d'un modèle de différentiation plus flexible avec des possibilités d'interaction multiples. Ainsi, la surexpression sélective de BAFF, APRIL et BAFF-R dans les sous-populations individuelles des cellules mémoires pourrait être un indice de l'interaction de ces sous-groupes avec des cellules B. ABSTRACT Introduction: Based on their surface expression of the CD45 isoform and of the CCR7 chemokine receptor, memory T cells have been divided into the following three subsets: central memory (TAM), effector memory (TEM) and terminal effector memory (ITEM). Distinct functional roles and different proliferative and regenerative capacities have been attributed to each one of these subpopulations. The molecular mechanisms underlying these differences; however, remain poorly understood. Materials and Methods: According to their expression of CD4, CD8, CD45RA and CCR7, human peripheral blood mononuclear cells were sorted by flow-cytometry into CD4+ or CD8+ naïve, TAM, TEM and ITEM subsets. Using real-time PCR, the expression of 14 genes known to be involved in apoptotis, survival or proliferation of T cells was quantified separately in each individual subset, relative to an endogenous reference gene. The RNA equivalent of 450 T cells was used for each gene and subset. The target gene panel included the survival genes BAFF, APRIL, BAFF-R, BCMA, TACI, IL-15Rα and IL-7Rα, the anti-apoptotic genes Bcl2, Bcl-xL and FLIP, the pro-apoptotic genes Bad, Bax and Fast, as well as the antiproliferative gene Tob. Using the comparative CT-method, the expression of the target genes in the three memory T cell subsets of both CD4+ and CD8+ T cell populations was compared to their expression in the naïve T cells. Results: In CD8+ cells, the pro-apoptotic factors Bax and Fast were found to be upregulated in all memory T cell subsets, whereas the survival and anti-apoptotic factors Bcl-2, APRIL and BAFF-R were downregulated. These tendencies were most accentuated in TEM and TTEM subsets. Even though the survival factor IL-7Rα was also downregulated in these subsets, interestingly, it was selectively upregulated in the CD8+ TAM subset. Similarly, IL-15Rαexpression was shown to be selectively upregulated in the CD8+ TEM subset. In CD4+ cells, the expression levels of the analyzed genes showed a greater inter-individual variability than in CD8+ cells, thus suggesting the absence of any particular expression pattern for CD4+ memory T cells. However, the survival factor BAFF was found to be significantly upregulated in all CD4+ memory T cell subsets, as was also the expression of APRIL and BAFF-R, although to a lesser extent. Furthermore, it was noted that the pro-apoptotic gene Fast was only expressed in the TTEM CD4+ subset. Discussion and Conclusions: Genes involved in apoptosis and survival in human memory T cells have been shown to be expressed differently in CD8+ cells as compared to CD4+ cells, suggesting a distinct regulation of cell homeostasis in these two memory T cell compartments. The present study suggests that, in CD8+ T cells, the expression of various survival and antiapoptotic genes is downregulated in TEM and TTEM subsets, while the expression of proapoptotic genes is upregulated in comparison to the naïve and the TAM populations. These characteristics, potentially translating to a greater susceptibility to apoptosis in the CCR7- (effector) memory populations, are accentuated in the TTEM population, suggesting a loss of survival in parallel to the acquisition of effector capacities. This speaks in favour of a linear differentiation model in CD8+ T memory cells. Moreover, the observed selectively increased expression of IL-7Rα in CD8+ TAM cells - as that of IL-15Rα in CD8+ TEM cells -suggest that differential responsiveness to cytokines could confer a selection bias for distinct long-term memory cell responses. Relative to the results for CD8+ T cells, those for CD4+ T cells seem to indicate a certain resistance of the memory subsets to apoptosis, suggesting the possibility of a more flexible differentiation model with multiple checkpoints and potential interaction of CD4+ memory cells with other cells. Thus, the selective upregulation of BAFF, APRIL and BAFF-R in individual memory subsets could imply an interaction of these subsets with B cells.

Geometry, petrology and growth of a shallow crustal laccolith : the Torres del Paine Mafic Complex (Patagonia)

1. ABSTRACTS - RÉSUMÉSSCIENTIFIC ABSTRACT - ENGLISH VERSIONGeometry, petrology and growth of a shallow crustal laccolith: the Torres del Paine Mafi c Complex (Patagonia)The Torres del Paine intrusive complex (TPIC) is a composite mafic-granitic intrusion, ~70km2, belonging to a chain of isolated Miocene plutons in southern Patagonia. Their position is intermediate between the Mesozoic-Cenozoic calc-alkaline subduction related Patagonian batholith in the West and the late Cenozoic alkaline basaltic back-arc related plateau lavas in the East. The Torres del Paine complex formed during an important reconfiguration of the Patagonian geodynamic setting, with a migration of magmatism from the arc to the back-arc, possibly related to the Chile ridge subductionThe complex intruded the flysch of the Cretaceous Cerro Toro and Punta Barrosa Formations during the Miocene, creating a well-defined narrow contact aureole of 200-400 m width.In its eastern part, the Torres del Paine intrusive complex is a laccolith, composed of a succession of hornblende-gabbro to diorite sills at its base, with a total thickness of ~250m, showing brittle contacts with the overlying granitic sills, that form spectacular cliffs of more than 1000m. This laccolith is connected, in the western part, to its feeding system, with vertical alternating sheets of layered gabbronorite and Hbl-gabbro, surrounded and percolated by diorites. ID-TIMS U-Pb on zircons on feeder zone (FZ) gab- bros yield 12.593±0.009Ma and 12.587±0.009Ma, which is identifcal within error to the oldest granite dated so far by Michel et al. (2008). In contrast, the laccolith mafic complex is younger than than the youngest granite (12.50±0.02Ma), and has been emplaced from 12.472±0.009Ma to 12.431 ±0.006Ma, by under-accretion beneath the youngest granite at the interface with previously emplaced mafic sills.The gabbronorite crystallization sequence in the feeder zone is dominated by olivine, plagioclase, clinopyroxene and orthopyroxene, while amphibole forms late interstitial crystals. The crystallization sequence is identical in Hornblende-gabbro from the feeder zone, with higher modal hornblende. Gabbronorite and Hornblende-gabbro both display distinct Eu and Sr positive anomalies. In the laccolith, a lower Hornblende-gabbro crystallized in sills and evolved to a high alkali shoshonitic series. The Al203, Ti02, Na20, K20, Ba and Sr composition of these gabbros is highly variable and increases up to ~50wt% Si02. The lower hornblende-gabbro is characterized by kaersutite anhedral cores with inclusions of olivine, clino- and orthopyroxene and rare apatite and An70 plagioclase. Trace element modelling indicates that hornblende and clinopyroxene are in equilibrium with a liquid whose composition is similar to late basaltic trachyandesitic dikes that cut the complex. The matrix in the lower hornblende gabbro is composed of normally zoned oligoclase, Magnesio-hornblende, biotite, ilmenite and rare quartz and potassium feldspar. This assemblage crystallized in-situ from a Ba and Sr-depleted melts. In contrast, the upper Hbl-gabbro is high-K calc-alkaline. Poikilitic pargasite cores have inclusions of euhedral An70 plagioclase inclusions, and contain occasionally clinopyroxene, olivine and orthopyroxene. The matrix composition is identical to the lower hornblende-gabbro and similar to the diorite. Diorite bulk rock compositions show the same mineralogy but different modal proportions relative to hornblende-gabbrosThe Torres del Paine Intrusive Complex isotopic composition is 87Sr/86Sr=0.704, 143Nd/144Nd=0.5127, 206Pb/204Pb=18.70 and 207Pb/204Pb=15.65. Differentiated dioritic and granitic units may be linked to the gabbroic cumulates series, with 20-50% trapped interstitial melt, through fractionation of olivine-bearing gabbronorite or hornblende-gabbro fractionation The relative homogeneity of the isotopic compositions indicate that only small amounts of assimilation occurred. Two-pyroxenes thermometry, clinopyroxene barometry and amphibole-plagioclase thermometry was used to estimate pressure and temperature conditions. The early fractionation of ultramafic cumulates occurs at mid to lower crustal conditions, at temperatures exceeding 900°C. In contrast, the TPIC emplacement conditions have been estimated to ~0.7±0.5kbar and 790±60°C.Based on field and microtextural observations and geochemical modelling, fractionation of basaltic-trachyandesitic liquids at intermediate to lower crustal levels, has led to the formation of the Torres del Paine granites. Repetitive replenishment of basaltic trachy- andesitic liquid in crustal reservoirs led to mixed magmas that will ascend via the feeder zone, and crystallize into a laccolith, in the form of successive dioritic and gabbroic sills. Dynamic fractionation during emplacement concentrated hornblende rich cumulates in the center of individual sills. Variable degrees.of post-emplacement compaction led to the expulsion of felsic liquids that preferentially concentrated at the top of the sills. Incremental sills amalgamation of the entire Torres del Paine Intrusive Complex has lasted for ~160ka.RESUME SCIENTIFIQUE - VERSION FRANÇAISEGéométrie, pétrologie et croissance d'un laccolite peu profond : Le complexe ma- fique du Torres del Paine (Patagonie)Le Complexe Intrusif du Torres del Paine (CITP) est une intrusion bimodale, d'environ 70km2, appartenant à une chaîne de plutons Miocènes isolés, dans le sud de la Patago-nie. Leur position est intermédiaire entre le batholite patagonien calco-alcalin, à l'Ouest, mis en place au Mesozoïque-Cenozoïque dans un contexte de subduction, et les basal-tes andésitiques et trachybasaltes alcalins de plateau, plus jeune, à l'Est, lié à l'ouverture d'un arrière-arc.A son extrémité Est, le CITP est une succession de sills de gabbro à Hbl et de diorite, sur une épaisseur de ~250m, avec des évidences de mélange. Les contacts avec les sills de granite au-dessus, formant des parois de plus de 1000m, sont cassants. Ce laccolite est connecté, dans sa partie Ouest, à une zone d'alimentation, avec des intrusions sub-ver- ticales de gabbronorite litée et de gabbro à Hbl, en alternance. Celles-ci sont traversées et entourées par des diorites. Les zircons des gabbros de la zone d'alimentation, datés par ID-TIMS, ont cristallisés à 12.593±0.009Ma et 12.587±0.009Ma, ce qui correspond au plus vieux granite daté à ce jour par Michel et al. (2008). A l'inverse, les roches manques du laccolite se sont mises en place entre 12.472±0.009Ma et 12.431 ±0.006Ma, par sous-plaquage successifs à l'interface avec le granite le plus jeune daté à ce jour (12.50±0.02Ma).La séquence de cristallisation des gabbronorites est dominée par Ol, Plg, Cpx et Opx, alors que la Hbl est un cristal interstitiel. Elle est identique dans les gabbros à Hbl de la zone d'alimentation, avec ~30%vol de Hbl. Les gabbros de la zone d'alimentation montrent des anomalies positives en Eu et Sr distinctes. Dans le laccolite, le gabbro à Hbl inférieur évolue le long d'une série shoshonitique, riche en éléments incompatibles. Sa concentration en Al203, Ti02, Na20, K20, Ba et Sr est très variable et augmente rapide-ment jusqu'à ~50wt% Si02. Il est caractérisé par la présence de coeurs résorbés de kaer- sutite, entourés de Bt, et contenant des inclusions d'OI, Cpx et Opx, ou alors d'Ap et de rares Plg (An70). Hbl et Cpx ont cristallisés à partir d'un liquide de composition similaire aux dykes trachy-andesite basaltique du CITP. La matrice, cristallisée in-situ à partir d'un liquide pauvre en Ba et Sr, est composée d'oligoclase zoné de façon simple, de Mg-Hbl, Bt, llm ainsi que de rares Qtz et KF. Le gabbro à Hbl supérieur, quant à lui, appartient à une suite chimique calco-alcaline riche en K. Des coeurs poecilitiques de pargasite con-tiennent de nombreuses inclusions de Plg (An70) automorphe, ainsi que des Ol, Cpx et Opx. La composition de la matrice est identique à celle des gabbros à Hbl inférieurs et toutes deux sont similaires à la minéralogie des diorites. Les analyses sur roches totales de diorites montrent la même variabilité que celles de gabbros à Hbl, mais avec une ten-eur en Si02 plus élevée.La composition isotopique des liquides primitifs du CITP a été mesurée à 87Sr/86Sr=0.704, 143Nd/144Nd=0.5127, 206Pb/204Pb=18.70 et 207Pb/204Pb=15.65. Les granites et diorites différenciés peuvent être reliés à des cumulais gabbronoritiques (F=0.74 pour les granites et F=1-0.5 pour les diorites) et gabbroïques à Hbl (fractionnement supplémentaire pour les granites, avec F=0.3). La cristallisation de 20 à 50%vol de liquide interstitiel piégé dans les gabbros du CITP explique leur signature géochimique. Seules de faibles quantités de croûte continentale ont été assimilées. La température et la pression de fractionnement ont été estimées, sur la base des thermobaromètres Opx-Cpx, Hbl-Plg et Cpx, à plus de 900°C et une profondeur correspondant à la croûte inférieure-moyenne. A l'inverse, les conditions de cristallisation de la matrice des gabbros et diorites du laccolite ont été estimées à 790±60°C et ~0.7±0.5kbar.Je propose que les liquides felsiques du CITP se soient formés par cristallisation frac-tionnée en profondeur des assemblages minéralogiques observés dans les gabbros du CITP, à partir d'un liquide trachy-andesite basaltique. La percolation de magma dans les cristaux accumulés permet la remontée du mélange à travers la zone d'alimentation, vers le laccolite, où des sills se mettent en place successivement. L'amalgamation de sills dans le CITP a duré ~160ka.Le CITP s'est formé durant une reconfiguration importante du contexte géodynamique en Patagonie, avec un changement du magmatisme d'arc vers un volcanisme d'arrière- arc. Ce changement est certainement lié à la subduction de la ride du Chili.RESUME GRAND PUBLIC - VERSION FRANÇAISEGéométrie, pétrologie et croissance d'une chambre magmatique peu profonde : Le complexe mafique du Torres del Paine (Patagonie)Le pourtour de l'Océan Pacifique est caractérisé par une zone de convergence de plaques tectoniques, appelée zone de subduction, avec le plongement de croûte océa-nique sous les Andes dans le cas de la Patagonie. De nombreux volcans y sont associés, formant la ceinture de feu. Mais seuls quelques pourcents de tout le magma traversant la croûte terrestre parviennent à la surface et la majeure partie cristallise en profondeur, dans des chambres magmatiques. Quelles est leur forme, croissance, cristallisation et durée de vie ? Le complexe magmatique du Torres del Paine représente l'un des meilleurs endroits au monde pour répondre à ces questions. Il se situe au sud de la Patagonie, formant un massif de 70km2. Des réponses peuvent être trouvées à différentes échelles, variant de la montagne à des minéraux de quelques 1000ème de millimètres.Il est possible de distinguer trois types de roches : des gabbros et des diorites sur une épaisseur de 250m, surmontées par des parois de granite de plus de 1000m. Les contacts entre ces roches sont tous horizontaux. Entre granites et gabbro-diorite, le contact est net, indiquant que le second magma s'est mis en place au contact avec un magma plus ancien, totalement solidifié. Entre gabbros et diorites, les contacts sont diffus, souvent non-linéaires, indiquant à l'inverse la mise en contact de magmas encore partiellement liquides. Dans la partie Ouest de cette chambre magmatique, les contacts entre roches sont verticaux. Il s'agit certainement du lieu de remplissage de la chambre magmatique.Lors du refroidissement d'un magma, différents cristaux vont se former. Leur stabilité et leur composition varient en fonction de la pression, de la température ou de la chimie du magma. La séquence de cristallisation peut être définie sur la base d'observations microscopiques et de la composition chimique des minéraux. Différents gabbros sont ainsi distingués : le gabbro à la base est riche en hornblende, d'une taille de ~5mm, sans inclusion de plagioclase mais avec des cristaux d'olivine, clinopyroxene et orthopyroxene inclus ; le gabbro supérieur est lui-aussi riche en hornblende (~5mm), avec les mêmes inclusions additionnées de plagioclase. Ces cristaux se sont formés à une température supérieure à 900°C et une profondeur correspondant à la croûte moyenne ou inférieure. Les minéraux plus fin, se trouvant hors des cristaux de hornblende des deux gabbros, sont similaires à ceux des diorites : plagioclase, biotite, hornblende, apatite, quartz et feldspath alcalin. Ces minéraux sont caractéristiques des granites. Ils ont cristallisé à ~790°C et ~2km de profondeur.La cristallisation des minéraux et leur extraction du magma par gravité provoque un changement progressif de la composition de ce dernier. Ainsi, après extraction d'olivine et d'orthopyroxene riches en Mg, de clinopyroxene riche en Ca, de plagioclase riche en Ca et Al et d'hornblende riche en Ca, Al et Mg, le liquide final sera appauvri en ces élé-ments. Un lien peut ainsi être proposé entre les diorites dont la composition est proche du liquide de départ, les granites dont la composition est similaire au liquide final, et les gabbros dont la minéralogie correspond aux minéraux extraits.L'utilisation de zircons, un minéral riche en U dont les atomes se transforment en Pb par décomposition radioactive au cours de millions d'années, permet de dater le refroidissement des roches qui les contiennent. Ainsi, il a été observé que les roches de la zone d'alimentation, à l'Ouest du complexe magmatique, ont cristallisés il y a 12.59±0.01 Ma, en même temps que les granites les plus vieux, se trouvant au sommet de la chambre magmatique, datés par Michel et al. (2008). Les deux roches pourraient donc avoir la même origine. A l'inverse, les gabbros et diorites de la chambre magmatique ont cristallisé entre 12.47±0.01Ma et 12.43±0.01Ma, les roches les plus vieilles étant à la base.En comparant la composition des roches du Torres del Paine avec celles d'autres en-tités géologiques de Patagonie, les causes du magmatisme peuvent être recherchées. A l'Ouest, on trouve en effet des intrusions granitiques, plus anciennes, caractéristiques de zones de convergence de plaque tectonique, alors qu'à l'Est, des laves basaltiques plus jeunes sont caractéristiques d'une dynamique d'extension. Sur la base des compositions chimiques des roches de ces différentes entités, l'évolution progressive de l'une à l'autre a pu être démontrée. Elle est certainement due à l'arrivée d'une dorsale océanique (zone d'extension crustale et de création de croûte océanique par la remontée de magma) dans la zone de subduction, le long des Andes.Je propose que, dans un premier temps, des magmas granitiques sont remontés dans la chambre magmatique, laissant d'importants volumes de cristaux dans la croûte pro-fonde. Dans un second épisode, les cristaux formés en profondeur ont été transportés à travers la croûte continentale, suite au mélange avec un nouveau magma injecté. Ces magmas chargés de cristaux ont traversé la zone d'alimentation avant de s'injecter dans la chambre magmatique. Différents puises ont été distingués, injectés dans la chambre magmatique du sommet à la base concernant les granites, puis à la base du granite le plus jeune pour les gabbros et diorites. Le complexe magmatique du Torres del Paine s'est construit sur une période totale de 160'000±20'000 ans.

Study of the mechanisms regulating the proliferative potential of human CD8+T lymphocytes over-expressing telomerase reverse transcriptase (hTERT)

Résumé La plupart des cellules issues du sang ont une durée de vie limitée. Dans les cellules somatiques humaines, y incluant les lymphocytes T, la taille des télomères diminue progressivement à chaque division cellulaire, pouvant aboutir à des instabilités chromosomiques. L'expression ectopique du gène de la transcriptase réverse de la télomérase (hTERT) dans les cellules restaure l'activité de la télomérase, et permet un rallongement de leur vie réplicative. Malgré l'absence de signes caractéristiques de transformation, nous ne savons pas encore si les cellules somatiques qui surexpriment hTERT sont physiologiquement indiscernables des cellules normales. Certaines études récentes proposent que la télomérase joue plusieurs rôles additionnels dans d'autres phénomènes biologiques tels que la réparation de l'ADN, la survie et la croissance des cellules. Dans notre étude, nous avons utilisé des clones issus de lymphocytes T cytotoxiques surexprimant la télomérase afin d'étudier les mécanismes moléculaires qui règlent leur prolifération et leur sénescence. Nous avons montré que les «jeunes » cellules T exprimant ou non hTERT révèlent des taux de croissance identiques suite à des réponses de stimulation induites par des mitogènes. De plus, aucun changement global dans leur expression des gènes n'a pu être mis en évidence. Curieusement, nous avons observé des réponses réduites dans la prolifération des cellules transduites avec la télomérase qui présentaient une élongation des télomères et une durée de vie prolongée. Ces cellules, malgré le maintien d'un niveau élevé de l'expression de gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire, ont également montré une expression accrue de plusieurs gènes trouvés en commun avec nos lymphocytes T vieillissants n'exprimant pas de télomérase. En particulier, les cellules ayant une durée de vie prolongée grâce à l'expression de la télomérase accumulaient également certains inhibiteurs du cycle cellulaire tels que p16Ink4a et p21Cip1, associés à l'arrêt de la croissance cellulaire. En résumé, nos résultats indiquent la présence fonctionnelle de mécanismes alternatifs pouvant contrôler la croissance réplicative de ces cellules; ils sont donc encourageants dans l'optique d'une utilisation à moindre risque de lymphocytes T «immortalisés » à des fins thérapeutiques pour traiter les tumeurs malignes ou les infections. Summary Most mature blood cells have a finite life span. In human somatic cells, including T lymphocytes, telomeres progressively shorten with each cell division eventually leading to chromosomal instability. Ectopic expression of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene in cells restores telomerase activity and results in the extension of their replicative life span. Despite lack of transformation characteristics, it is yet unknown whether somatic cells that over-express telomerase are biologically and physiologically indistinguishable from normal cells. Recent data suggest that telomerase might mediate additional functions in DNA repair, cell survival and cell growth. Using CD8+ T lymphocyte clones over-expressing telomerase we investigated the molecular mechanisms that regulate T cell proliferation and senescence. Here we show that early-passage T cell clones transduced or not with hTERT displayed identical growth rates upon mitogenic stimulation and no marked global changes in gene expression. Surprisingly, reduced proliferative responses were observed in hTERT-transduced cells with elongated telomeres and extended life span. These cells, despite maintaining high expression level of genes involved in cell cycle division and progression, also showed increased expression of several genes associated with normal aging T lymphocytes. In particular, late passage T cells over-expressing telomerase accumulated the cyclin-dependent inhibitors p16INK4a and p21CIP1 that have largely been associated with in vitro growth arrest. Whether tumor-reactive CD8+ T cells that ectopically express telomerase could now be used for adoptive transfer therapy in cancer patients remains unclear at this point. Nevertheless, our results regarding the safe and effective use of hTERT-transduced lymphocytes are encouraging, since they indicate that alternative growth arrest mechanisms such as p 16 and p21 are still functional in these cells and regulate to some extend their growth potential.

Analysis of antiviral immunity in primary and chronic infections

Several evidences in humans underscored the contribution of CD4 and CD8 T-cell responses in controlling viral and bacterial infections. However, CD4 and CD8 Τ cells have distinct and specific effector functions leading to a hierarchical importance in responding to different types of pathogens. In this context, the present work aimed to investigate distinct CD8 T-cell features potentially influencing T-cell efficacy against viral infection. To achieve this-objective, CD8 Τ cells derived from HIV-infected patients and healthy donors harbouring virus-specific immune responses or immunized with an HTV vaccine candidate were studied. In particular, we performed a comprehensive cross-sectional and longitudinal analysis to characterize the function, the phenotype and the functional avidity of HIV-specific CD8 Τ cells during acute (PHI) and chronic infection and, in particular, we investigated immunological parameters potentially associated with the functional avidity of HIV-specific CD8 Τ cells. In addition, we studied the expression pattern of co-inhibitory molecules and the influence of CD 160 on the functions of CD8 Τ cells in absence of chronic infections. From these analyses we observed that the functional avidity of HIV-specific CD8 T- cell responses was significantly lower in acute than in chronic infection, but was not different between chronic progressive and non-progressive patients. Functional avidity remained low after several years of antiretroviral therapy in PHI patients, but increased in patients experiencing a virus rebound following treatment interruption in association with a massive renewal of the global CD8 complementarity-determining region 3 of the TCR. The functional avidity was also directly associated to T-cell exhaustion. In individuals with no sign of HIV or Hepatitis A, Β or C virus infection, CD8 Τ cells expressed higher levels of co-inhibitory molecules than CD4 Τ cells and this was dependent on the stage of T-cell differentiation and activation. The expression of CD 160 impaired the proliferation capacity and IL-2 production of CD8 Τ cells and was reduced upon CD8 T-cell activation, entitling CD 160 as unique marker of CD8 T-cell exhaustion. The CD 160 blockade restored the proliferation capacity of virus-specific CD8 Τ cells providing a potential new target for immunotherapy. All together, these results expand our knowledge regarding the interplay between the immune system and the viruses. - De nombreuses études chez l'Homme ont mis en évidence la contribution des réponses cellulaires Τ CD4 et CD8 dans le contrôle des infections virales et bactériennes. En particulier, les lymphocytes Τ ont différentes fonctions effectrices spécifiques qui leur confèrent un rôle clé lors d'infections par différents pathogènes. Ce travail vise à étudier différentes caractéristiques des cellules Τ CD8 affectant l'efficacité des réponses cellulaires contre les virus. Pour atteindre cet objectif nous avons étudié les cellules Τ CD8 provenant de patients infectés par le VIH et de donneurs sains avec des réponses immunitaires naturelles ou vaccinales contre des virus. Nous avons effectué plusieurs analyses transversales et longitudinales des fonctions, du phénotype et de l'avidité fonctionnelle des lymphocytes Τ CD8 spécifiques au VIH au cours d'infections aiguës et chroniques; en particulier, nous avons étudié les paramètres immunologiques qui pourraient être associés à l'avidité fonctionnelle. De plus, nous avons investigué le profil d'expression des principales molécules co-inhibitrices et en particulier le rôle du CD 160 dans les fonctions des lymphocytes Τ CD8. Sur la base de ces analyses, nous avons constaté que l'avidité fonctionnelle des cellules Τ CD8 spécifiques au VIH était significativement plus faible lors infections aiguës que lors d'infections chroniques, mais n'était, par contre, pas différente entre les patients avec des infections chroniques progressives et non progressives. L'avidité fonctionnelle reste faible après plusieurs années de traitement antirétroviral, mais augmente chez les patients subissant un rebond viral, et donc exposés à des hautes virémies, suite à l'interruption du traitement. Cette augmentation d'avidité des lymphocytes Τ CD8, liée à un épuisement fonctionnel accru, était quantitativement directement associée à un renouvellement massif du TCR. Indépendamment de l'infection par le VIH, les cellules Τ CD8 expriment des niveaux plus élevés de molécules co-inhibitrices (PD-1, 2B4 et CD 160) par rapport aux cellules Τ CD4 et ceci dépend de leur stade de différenciation et d'activation. En particulier, CD 160 semble être un marqueur clé d'épuisement cellulaire des cellules Τ CD8, et donc une nouvelle cible potentielle pour l'immunothérapie, car a) son expression réduit la capacité proliférative et la production d'IL-2 b) CD 160 diminue suite à 1'activation et c) le blocage de CD 160 redonne la capacité proliférative aux cellules Τ CD8 spécifiques aux virus. - Le système immunitaire est un ensemble de cellules, tissus et organes indispensables pour limiter l'entrée des pathogènes à travers la peau et les muqueuses. Parmi les différentes cellules composant le système immunitaire, les cellules Τ CD4 et CD8 sont fondamentales pour le contrôle des infections virales et bactériennes. Les moyens pour combattre les différents pathogènes peuvent être cependant très variables. Les cellules Τ CD8, qui sont indispensables pour la lutte contre les virus, peuvent avoir différents niveaux de sensibilité; les cellules qui répondent à de faibles quantités d'antigène ont une forte sensibilité. Suite à une première infection virale, les cellules Τ CD8 ont une sensibilité plus faible que lors d'expositions répétées au même virus. En effet, la réexposition au pathogène induit une augmentation de sensibilité, grâce au recrutement et/ou à l'expansion de cellules Τ dotées d'une sensibilité plus élevée. Les cellules Τ CD8 avec une plus haute sensibilité semblent être caractérisées par une perte de fonctionnalité (épuisement fonctionnel associé à une haute expression de molécules dites inhibitrices). En absence d'infection, la fonction des molécules inhibitrices n'est pas encore clairement définie. Les cellules Τ CD8 montrent un niveau d'expression plus élevé de ces molécules par rapport aux cellules Τ CD4. Ceci dépend de l'état des cellules. Parmi ces molécules, le CD160 est associé à l'incapacité des cellules à proliférer et à produire de l'IL-2, une protéine importante pour la prolifération et la survie cellulaire. L'incapacité des cellules exprimant le CD 160 à proliférer en réponse à des virus peut être restaurée par le blocage fonctionnel du récepteur CD 160. Cette étude étoffe notre connaissance du rôle des cellules Τ CD8 ainsi que des conséquences induites par leur épuisement fonctionnel. Ces informations sont fondamentales pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales.

ARE PPARS NOVEL THERAPEUTIC TARGETS TO IMPROVE MELANOMA TREATMENT ?

Cutaneous melanoma is an aggressive malignant tumor of melanocytes, the pigment- producing cells of the epidermis, with a high incidence in developed countries. Despite some major clinical breakthroughs in the last few years, efficient therapies for metastatic melanoma, which portends a very bad prognosis, are still lacking. Among the potential therapeutic targets that have been attracting at-tention in melanoma are the peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs). These members - a, ß and 7 - of the nuclear hormone receptor family, which are ligand-gated transcription factors endowed with a multitude of functions besides metabolism homeostasis, have displayed promising antitumor properties in a wide range of cancer cells, including melanoma. However, our knowledge of PPARs' functions in this skin cancer is far from complete, making the usefulness of any of the a, ß or 7 isotype as a therapeutic target uncertain. In this work, we showed that all three PPAR isotypes are expressed in normal melanocytes, in most melanoma cell lines and in primary and metastatic melanomas, and that PPAR/3 and 7 display transcriptional activity in normal melanocytes and melanoma cells. We also showed that the PPAR7 agonist rosiglitazone had anti-melanoma properties largely independent of PPAR7 expression, which was widely varying across the different cell lines and melanoma biopsies we evaluated and was not correlated with cell line stage. Consistent with the general view of PPAR7 as a tumor suppressor gene, we found that, in human samples, PPAR7 was less expressed in melanoma than in normal skin. Transcriptornic profiling of metastatic melanoma cells in which PPAR7 was pharmacologically modulated revealed an association with epithelial-to-mesenchymal transition, though the functional relevance of this finding remains to be determined. Collectively, our results suggests that PPAR7 activity in melanoma is highly complex and that a straightforward picture of PPAR7's role in this skin cancer is difficult to draw. In this study, we also provided compelling evidence that thioredoxin interacting protein (TXNIP) is, in melanoma, a bona fide PPAR7 target gene, the expression of which is repressed by PPAR7 activation. Although TXNIP is mostly known as an inhibitor of the major antioxidant thioredoxin, it has demonstrated a range of biological functions and is generally considered as a tumor suppressor gene. Consistently, we found that TXNIP expression is associated with growth arrest of melanoma cells in vitro and that forced expression of TXNIP strongly impairs cell proliferation. Interestingly, we also discovered that TXNIP favors melanoma cell migration while it diminishes their adhesion. Finally, we provided several lines of evidence that TXNIP may regulate these processes at the transcriptional level as well as by direct protein-protein interactions in the plasma membrane. Altogether, our findings suggest that the PPAR7 target TXNIP may be a double-edged sword in melanoma, hindering tumor growth but promoting invasion and dissemination. Experiments to evaluate the net biological outcome of TXNIP modulation in vivo are ongoing. -- Le mélanome cutané est une tumeur maligne agressive des mélanocytes, cellules de l'épiderme qui produisent la mélanine. Ce cancer présente un taux d'incidence élevé dans les pays développés et est grevé d'un pronostic très sombre une fois qu'il a disséminé. Malgré les importants progrès réalisés ces dernières années, aucune thérapie lie s'est encore montrée véritablement efficace contre le mélanome métastatique. Parmi les cibles thérapeutiques potentielles, nombre de groupes de recherche se sont penchés sur les peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs). Ces récepteurs - a, ß et 7 - font partie de la famille des récepteurs nucléaires aux hormones, des facteurs de transcription activés par des ligands et dotés d'une multitude de fonctions en sus de la régulation du métabolisme. Ces protéines ont démontré des propriétés anti-tumorales prometteuses dans une large gamme de cellules cancéreuses, y compris le mélanome. Cependant, nous connaissons encore très mal les fonctions des PPARs dans ce cancer de la peau, rendant l'utilité thérapeutique de l'un des isotypes a, ß ou 7 incertaine. Dans ce travail, nous avons montré que les trois isotypes sont exprimés dans les mélanocytes normaux, dans la plupart des lignées de mélanome ainsi que dans des mélanomes primaires et métastatiques; nous avons aussi montré que PPAR/3 et 7 sont actifs sur le plan transcriptionnel dans les mélanocytes normaux et les cellules de mélanome. La rosiglitazone, un agoniste de PPAR7, a démontré des propriétés anti-mélanome essentiellement indépendantes de l'expression de PPAR7, qui semble très variable dans les lignées et les biopsies que nous avons évaluées; de plus, l'expression de PPAR7 n'est pas corrélée avec le stade de la lignée. En accord avec la vision communément admise de PPAR7 comme étant un gène suppresseur de tumeur, nous avons observé dans des échantillons humains que PPAR7 est moins exprimé dans les mélanomes que dans la peau normale. Une étude transcrip- tomique de cellules de mélanome métastatique a révélé que la modulation phar-macologique de PPAR7 est associée avec la transition épithélio-mésenchymateuse, même si la pertinence fonctionnelle de cette trouvaille reste à déterminer. Collec-tivement, ces résultats suggèrent que l'activité de PPAR/y dans le mélanome est hautement complexe et qu'une image claire du rôle de PPAR7 dans ce cancer est difficile à dessiner. Dans cette étude, nous avons également fourni de solides preuves que la thiore-doxin interacting protein (TXNIP) est, dans le mélanome, un gène cible bona fide de PPAR7 dont l'expression est réprimée par l'activation de PPAR7. Bien que TXNIP soit surtout connu comme un inhibiteur de la thiorédoxine -un anti-oxydant majeur - cette protéine a démontré une large gamme de fonctions biologiques et est généralement considérée comme un gène suppresseur de tumeur. En accord avec cette conception, nous avons trouvé que l'expression de TXNIP est associée avec l'arrêt de croissance des cellules de mélanome in vitro et que l'expression forcée de TXNIP freine considérablement la prolifération cellulaire. Nous avons aussi découvert que TXNIP favorise la migration des cellules de mélanome alors qu'elle diminue leur adhésion. Enfin, nous avons obtenu plusieurs preuves que TXNIP pourrait réguler ces processus tant au niveau transcriptionnel que par des interactions protéine-protéine au sein de la membrane plasmique. En conclusion, nos résultats suggèrent que la cible de PPAR7 TXNIP pourrait être une épée à double tranchant dans le mélanome, freinant la croissance tumorale mais favorisant l'invasion et la dissémination. Des expériences permettant d'évaluer l'effet biologique net de la modulation de TXNIP in vivo sont en cours.

Autoreactive T cells that bypass negative selection are not tolerant and respond to self-antigen stimulation during infection

Le répertoire cellulaire Τ a pour but d'être tolérant aux antigènes du soi afin d'éviter l'induction de maladies autoimmunes. C'est pourquoi les lymphocytes Τ autoréactifs sont éliminés dans le thymus lors de leur développement par le processus de sélection négative. La plupart des recherches étudient les lymphocytes Τ de haute avidité. Ces lymphocytes Τ de haute avidité sont très sensibles et réagissent fortement à un antigène du soi. En conséquence, ces cellules induisent le développement de maladies autoimmunes lorsqu'elles ciblent des organes exprimant l'antigène du soi. Plusieurs études ont montré que les lymphocytes Τ qui réagissent faiblement aux antigènes spécifiques à un tissu, nommé lymphocytes Τ de faible avidité, peuvent contourner les mécanismes de tolérance centrale et périphérique. J'ai utilisé des souris Rip-mOva qui expriment l'Ovalbumine comme antigène du soi spécifique à un tissu. Dans ces souris transgéniques Rip-mOva, les lymphocytes Τ de faible avidité survivent à la sélection négative. Une fois stimulés à la périphérie, ces lymphocytes Τ CD8+ de faible avidité ont la capacité d'infiltrer les organes qui expriment l'antigène du soi chez les souris Rip-mOva et peuvent induire une destruction tissulaire. L'objectif principal de mon projet de thèse était de comprendre les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles de ces lymphocytes Τ dans un état d'équilibre et dans un contexte infectieux. Pour étudier ces cellules dans un modèle murin bien défini, nous avons généré des souris exprimant un récepteur de cellule Τ transgénique appelé OT-3. Ces souris transgéniques OT-3 ont des lymphocytes Τ CD8+ de faible avidité spécifiques à l'épitope SIINFEKL de l'antigène Ovalbumine. Nous avons démontré qu'un grand nombre de lymphocytes Τ CD8+ OT-3 ne sont pas éliminés lors de la sélection négative dans le thymus après avoir rencontré l'antigène du soi. Par conséquent, les lymphocytes Τ OT-3 de faible avidité sont présents dans une fenêtre de sélection comprise entre la sélection positive et négative. Cette limite se définie comme le seuil d'affinité et est impliquée dans l'échappement de certains lymphocytes Τ OT- 3 autoréactifs. A la périphérie, ces cellules sont capables d'induire une autoimmunité après stimulation au cours d'une infection, ce qui nous permet de les définir comme étant non tolérante et non dans un état anergique à la périphérie. Nous avons également étudié le seuil d'activation des lymphocytes Τ OT-3 à faible avidité à la périphérie et avons constaté que des ligands peptidiques plus faibles que l'épitope natif SIINFEKL sont capables de les activer au cours d'une infection ainsi que de les différencier en lymphocytes Τ effecteurs et mémoires. Les données illustrent une déficience lors de la sélection négative dans le thymus de lymphocytes Τ CD8+ autoréactifs de faible avidité contre un antigène du soi spécifique à tissu et montrent que ces cellules sont entièrement compétentes lors d'une infection. - The diverse Τ cell repertoire needs to be tolerant to self-antigen to avoid the induction of autoimmunity. This is why autoreactive developing Τ cells are deleted in the thymus. The deletion of self-reactive Τ cells occurs through the process of negative selection. Most studies investigated high avidity Τ cells. These high avidity Τ cells are very sensitive and strongly react to a self-antigen. As a consequence, these cells induce the development of autoimmunity when they target organs which express the self-antigen. High avidity autoreactive CD8+ Τ cells are deleted in the thymus. However, several studies have shown Τ cells that weakly respond to tissue-restricted antigen, referred to as low avidity Τ cells, can bypass central and peripheral tolerance mechanisms. I used Rip-mOva mice that expressed Ovalbumin as a neo self-antigen in a tissue-restricted fashion. In these transgenic Rip-mOva mice low avidity CD8+ Τ cells survive negative selection. Upon stimulation in the periphery, these low avidity CD8+ Τ cells have the ability to infiltrate organs that express the self-antigen in the Rip-mOva mice and can also induce the destruction of the tissue. The major aim of my PhD project was to understand the phenotypic and functionality characteristics of these Τ cells in a steady-state condition and in a context of an infection. To study these cells in a well-defined mouse model, we generated OT-3 Τ cell receptor transgenic mice that express low avidity CD8+ Τ cells that are specific for the SIINFEKL epitope of the Ovalbumin antigen. We have been able to demonstrate that a large number of OT-3 CD8+ Τ cells survive negative selection in the thymus after encountering the self-antigen. Thus, low avidity OT-3 Τ cells are present in a window of selection comprised between positive and negative selection. This boundary defined as the affinity threshold is involved in the escape of some autoreactive low avidity OT-3 Τ cells. Once they circulate in the periphery, they are able to induce autoimmunity after stimulation during an infection, allowing us to allocate these cells as being non-tolerant and not in an anergic state in the periphery. We have also looked at the threshold of activation of low avidity OT-3 CD8+ Τ cells in the periphery and found that peptide ligands that are weaker than the native SIINFEKL epitope are able to activate OT-3 Τ cells during an infection and to differentiate them into effector and memory Τ cells. The data illustrate the impairment of negatively selecting low avidity autoreactive CD8+ Τ cells against a tissue-restricted antigen in the thymus and shows that these cells are fully competent upon an infection.

Lats2, a novel regulator of Elongin BC ubiquitin ligase

Résumé : Le Large tumor suppressor, Lats2, est une protéine humaine homologue au suppresseur de tumeur Warts (Lats) de Drosophila melanogaster, qui réprime la prolifération des cellules en altérant leur cycle au niveau des transitions Gl/S et G2/M, et en induisant l'apoptose. Pourtant, la voie moléculaire par laquelle Lats2, une sériase-thréonine kinase, déclenche l'arrêt du cycle cellulaire, est toujours inconnue. Notre équipe a d'abord déterminé que Lats2 était un gène de réponse à la protéine p53 (Kostic et al., 2000). Par la suite, nous avons identifié des protéines interagissant avec Lats2, notamment les modules de reconnaissance du substrat des ligases Colline E3 (des protéines contenant Socs box ou F box) ainsi que deux Bous-unités du Signalosome CSN: CSN4 et CSNS. En outre, Lats2 est connue pour s'associer au Super-complexe composé de CSN et des ligases Colline E3 (Rongere, thesis, 2004; Rongere, unpublished results, 2005). Le travail présenté ici sur Lats2 a confirmé que cette protéine est une kinase associée à CSN. Nous avons caractérisé les interactions spécifiques de domaines de Lats2 avec hSocs3, hWsb 1 (des protéines Socs box) et hFBX-7 (une protéine F box), ainsi que les conséquences physiologiques des interactions avec hSocs3, hWsb1 et hSocs1. Des expériences de GST pull-down ont montré que les deux domaines, N-terminal et kinase, de Lats2 interagissent avec hSocs3, hWsb1 et hFBX-7, ce qui suggère aussi que l'ensemble de la protéine Lats2 est impliqué dans ces interactions. Une étude approfondie des interactions entre Lats2 et hSocs3 indique que le domaine kinase de Lats2 interagit avec la région de hSocs3 contenant un domaine SH2, situé en amont du domaine Socs box de hSocs3. Par ailleurs, Lats2 phosphoryle des régions spécifiques entre les domaines N-terminal et SH2 (Sl), et, entre les domaines SH2 et Socs box (S3) de la protéine hSocs3. Ces résultats révèlent que hSocs3 est un.nouveau substrat de Lats2. Des modifications de l'activité kinase ont aussi révélé que la protéine sauvage Lats2 (wt Lats2) était capable de phosphoryler hSocs3, alors qu'un mutant dead du domaine kinase Lats (poche ATP délétée, Lats2OATP) non. L'analyse des mutations a permis d'identifier deux résidus sériase situés aux positions 1441145 (S3), spécifiquement phosphorylés par wt Lats2. La phosphorylation des protéines représentant un signal de dégradation protéolytique, nous avons envisagé que Lats2 pouvait cibler hSocs3 pour une dégradation protéasomale. Lorsque wt Lats2 est surexprimée dans des cellules HEK293T et COS7, la demi-vie de hSocs3, un élément de la ligase Elongine BC-Colline É3 (ligase EBC), diminue significativement, effet que n'a pas la surexpression de Lats2OATP. De plus, la stabilité de hSocs3 dépend de la phosphorylation des résidus sériase aux positions 144/145 par wt Lats2. Bien que les sites de phosphorylation ne soient pas définis pour les deux autres modules de reconnaissance du substrat de la ligase EBC: hWsb 1 et hSocsl, leurs demi-vies diminuent également quand wt Lats2 est surexprimée. Pour les tests in vivo, nous avons synthétisé des esiRNA pour diminuer l'expression du gène endogène lats2, ce qui a entraîné une augmentation d'un facteur 2 de la demi-vie de hSocs3 et de hWsbl dans les cellules HEK293T. En conclusion, nos résultats suggérent que Lats2, une kinase associée au CSN, est un nouveau régulateur de la fonction des ligases EBC, agissant sur le renouvellement des protéines hSocs3, hSocs1 et hWsb1. Ainsi, Lats2 altère la spécificité et la capacité des ligases EBC, régulant par là même la stabilité de nombreuses protéines, ciblées par les ligases EBC pour une dégradation protéasomale. D'autres études devraient révéler si la modification observée de la fonction de la ligase EBC par Lats2, associée au Super-complexe, est également responsable du renouvellement des régulateurs du cycle cellulaire et des changements dans ce même cycle observés lors de la surexpression de Lats2. Summary : The Large tumor suppressor 2 (Lats2) is a human homologue of the Drosophila melanogaster tumor suppressor Warts (Cats) who negatively regulates cell proliferation by altering cell cycle Gl/S and G2/M transition and inducing apoptosis. However, the molecular pathway by which Lats2, a serine-threonine kinase, mediates cell cycle arrest is still unknown. Lats2 was initially identified to be a p53 response gene by our group (Kostic et al., 2000). Subsequently, our group identified interacting candidates of Lats2, including substrate recognition modules of Cullin-based E3 ligases (Socs box or F-box containing proteins) as well as two subunits of the Signalosome (CSN), CSN4 and CSNS. Additionally, Lats2 was shown to associate with a Super-complex, composed of CSN and Cullin-based E3 ligases (Rongere, thesis, 2004; Rongere, unpublished results, 2005) We hypothesized that Lats2 may perform its physiological function through interaction with CSN and Cullin-based E3 ligases. The present work on Lats2 has confirmed that Lats2 is a CSN associated kinase. We defined the domain specific interactions of Lats2 with hSocs3, hWsb1 (Sots box proteins) and hFBX-7 (F box protein), as well as the physiological consequences of interaction with hSocs3, hWsb1 and hSocs1. Both the N-terminal and the kinase domains of Lats2 interact with full-length hSocs3, hWsb1 and hFBX-7, determined in GST pull-down assays suggesting that full-length Lats2 protein is involved in interactions. Refinement of the Lats2 interaction with hSocs3 indicated that the kinase domain of Lats2 interacts with a region of hSocs3 containing a SH2 domain located upstream of the Socs box domain of the hSocs3. Moreover, Lats2 phosphorylated specific regions between the N-terminal and SH2 domain (S l) as well as between the SH2 domain and Socs box domain of hSocs3 (S3).These results indicate that hSocs3 is a novel Lats2 substrate. The kinase assay has also demonstrated that wt Lats2 was able to phosphorylate hSocs3, but not Lats2 kinase dead mutant (deleted ATP pocket, Lats20ATP). Mutational analysis identified two serine residues located at positions 144/145 (S3) to be specifically phosphorylated by wt Lats2. Phosphorylation of proteins has been shown to be a signal for proteolytic degradation of many characterized proteins. Thus we hypothesized that Lats2 could target hSocs3 for proteasomal degradation. When wt Lats2 was over-expressed in HEK293T cells and COST cells, the half-life of hSocs3, as a component of Elongin BC Cullin-based E3 ubiquitin ligase (EBC ligase), decreased significantly. In contrast, aver-expression of the Lats2OATP did not alter the half-life of hSocs3. Furthermore, the stability of hSocs3 depended on phosphorylation of serine residues at positions 144/145 by wt Lats2. Although the sites of phosphorylation were not defined for two other substrate recognition modules of EBC ligasehWsbl and hSocsl, their half-lives also decreased when wt Lats2 was over-expressed. To test in vivo, we synthesized esiRNA to knock-down endogenous Lats2 and subsequently we measured the half-lives of hSocs3 and hVVsb l . Here we demonstrated that the half-lives of hSocs3 and hWsbl were increased by the factor of two in Lats2-depleted HEK293T cells. In conclusion, our findings suggest that Lats2, a CSN associated kinase, is a novel regulator of EBC ligase function by regulating the turn-over of hSocs3, hSocs1 and hWsb1. Thus, Lats2 alters the specificity and capacity of EBC ligases regulating thereby the stability of numerous proteins which are targeted by EBC ligases for proteasomal degradation. Further studies should reveal whether the observed modulation of EBC ligase function by Lats2 associated with a Super-complex is also responsible for the turn-over of cell cycle regulators and the observed alteration in cell cycle by Lats2 over-expression.

Sensitization of endothelial cells to TNFα-induced death

RESUME L'angiogénèse tumorale est un processus essentiel au développement des tumeurs. Les intégrines, molécules d'adhésions transmembranaires, sont d'importants effecteurs de l'angiogenèse. En permettant l'adhésion à la matrice extra-cellulaire, les intégrines transmettant des signaux de survie, de migration, et de prolifération. Le facteur de nécrose tumorale α (TNFα) est utilisé pour le traitement régional de cancers chez l'homme. II agit en détruisant sélectivement les vaisseaux angiogéniques. Cependant, son administration systémique chez l'homme est limitée par les réactions de vaso-dilatation sévères qu'il provoque. Le but de mon travail fut de rechercher des conditions permettant la sensibilisation des cellules endothéliales au TNFα et qui pourraient être applicables en clinique, ceci afin d'accroître l'efficacité de cette molécule. Nous avons testé la possibilité d'interférer avec les signaux de survie provenant des intégrines. Pour cela, des cellules endothéliales furent cultivées dans des conditions d'adhésion ou en suspension, ou alors exposées dans des conditions d'adhésion au zoledronate (biphosphonate contenant du nitrogène). Dans ces conditions, les effets du TNFα sur les cellules endothéliales furent étudiés, en particulier l'induction de la mort cellulaire. Dans ce travail, nous montrons que le zoledronate sensibilise les cellules endothéliales à la nécrose induite par TNFα. Cet effet s'accompagne de l'inhibition de la phosphorylation de FAK, PKB, et JNK, ainsi que de l'inhibition de la prénylation des protéines. En revanche, l'activation de NF-kB et p38 n'est pas perturbée. La restoration de la prénylation des protéines empêche la mort des HUVEC traitées par zoledronate et TNFα, et rétablit la phosphorylation de FAK, PKB, et JNK. Des essais d'angiogénèse in vivo montrent que le zoledronate inhibe l'angiogénèse induite par FGF-2. Le zoledronate encapsulé dans des liposomes permet de ralentir la croissance tumorale et synergise avec le TNFα en l'inhibant. L'inihibtion de la prénylation des protéines est un des mécanismes de sensibilisation du zoledronate au TNFα. In vivo, la synergie de leur association sur la croissance tumorale est efficace. Ces résultats encouragent la poursuite de l'étude des effets de ces deux drogues sur la croissance tumorale. SUMMARY The formation of tumor-associated vessels is essential for tumor progression. Cell adhesion molecules of the integrin family are important mediators of angiogenesis, by providing adhesive signals necessary for endothelial cell migration, proliferation and survival. Anti-angiogenic therapies are currently considered as highly promising in the treatment of human cancer. Tumor Necrosis Factor α (TNFα) is used for the regional treatment of human cancer, whose mechanisms of action involved selective disruption of angiogenic tumor vessels. Systemic administration of TNFα in humans, however, induces a severe inflammatory condition that prevents its use far the treatments of tumors localized outside of limbs. The aim of my work was to find strategies to sensitize angiogenic endothelial cells to TNFα-induced death, which could be potentially translated into clinical setting to improve the therapeutic efficacy of TNFα. We specifically tested the hypothesis whether interference with integrin-mediated adhesion and signaling may sensitize endothelial cells to TNFα-induced death. To test this hypothesis we cultured endothelial cells (EC) under conditions of cell-matrix or cell-cell adhesion or exposed matrix-adherent EC to the nitrogen-containing bisphosphonate zoledronate, and characterized the effect on TNFα-mediated signaling events and cell death. We show that zoledronate sensitizes HUVEC to TNFα-induced necrosis-like programmed cell death. This effect was associated with suppression of sustained phosphorylation of PKB and JNK and decreased protein prenylation, whereas TNFα-induced activation of NF-kB and p38 were not inhibited. Restoration of protein prenylation rescued HUVEC from zoledronate and TNFα-induced death, and restored FAK, PKB and JNK phosphorylation. By using in vivo angiogenesis assay we showed that zoledronate suppressed FGF-2-induced angiogenesis. Liposome-encapulated zoledronate partially inhibited tumor growth and synergized with TNFα to fully suppress tumor growth. Taken together, this work has identified protein prenylation as a mechanisms by which zoledronate sensitizes endothelial cells to TNFα-induced death in vitro and provides initial evidence that zoledronate synergizes with TNFα in vivo resulting in improved anti-tumor activity. These results warrant further study of the anti-tumor effects of zoledronate and TNFα and should be further studies in view of their clinical relevance.