Etude in vitro de l'activité électrique du tissu nerveux obtenu par culture de biopsies cérébrales humaines adultes

Récemment encore, la neuro-genèse chez le primate adulte était supposée limitée aux régions précises que sont le bulbe olfactif, la zone sous-granulaire de l'hippocampe et la région sous- ventriculaire. Depuis lors, des cellules neurales progénitrices distribuées dans l'ensemble du cortex du primate adulte furent mises en évidence. Cultivées in vitro, ces cellules forment des écosystèmes cellulaires nerveux constitués de progéniteurs neuronaux, d'astrocytes et d'oligo- dendrocytes. Transplantés sur un modèle de primate parkinsonien, certains progéniteurs complètent leur différentiation en neurones matures et développent des propriétés neuro- trophiques et neuro-protectrices. Injectées aux environs d'une lésion cérébrale, ces cellules offrent un bénéfice fonctionnel et comportemental significatif. Le présent projet mesure l'activité électro-physiologique du tissu nerveux obtenu par culture de biopsies corticales humaines adultes, de sorte à déterminer son aptitude à intégrer l'information. Des biopsies corticales humaines adultes furent cultivées in vitro avec succès sur un support Micro-Electrode-Array. Cette technologie permet l'acquisition d'enregistrements électro- physiologiques à l'échelle des circuits, au sein d'un tissu maintenu en culture. En parallèle, une mesure de l'activité à l'échelle cellulaire fut obtenue par l'application du Patch Clamp à des cellules cultivées sur un support de verre. Malgré une culture prolongée et l'induction d'une différentiation neuronale, aucune activité électro-physiologique significative ne put être démontrée. Une analyse phénotypique à un stade intermédiaire de culture montra l'expression prometteuse du marqueur neuronal précoce β-Tubulin-III. Cependant, après l'induction d'une différenciation neuronale, la surprenante co-expression de marqueurs astroglial (GFAP) et neuronal (MAP2) fut constatée. Le silence électro-physiologique issu des enregistrements sur MEA peut être l'oeuvre d'un isolement des cellules électriquement actives, et d'un défaut d'organisation en réseau. Une interposition de tissu glial entre neurones et électrodes peut également absorber le signal. Par ailleurs, les cellules enregistrées par Patch Clamp furent déterminées selon le seul critère morphologique ; leur nature exacte demeure inconnue. Les analyses phénotypiques laissent supposer l'entrée dans une voie de maturation neuronale par l'expression du marqueur β- Tubulin-III. Toutefois le phénotype exprimé au terme du processus de culture reste incertain. Des facteurs de maturation ou environnementaux semblent faire défaut à la complétion d'une différentiation neuronale. La culture de neurones bien différenciés et électriquement actifs appelle de nouvelles études in vivo, ainsi qu'une analyse fine des voies intracellulaires de maturation.

Vieillissement vasculaire chez des patients athérosclérotiques: Sénescence prématurée des cellules endothéliales?

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique.

Régulation de la proprotéine convertase subtilisine / kexine type 9 (PCSK9) dans les cellules intestinales Caco-2/15

La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) favorise la dégradation post-transcriptionnelle du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLr) dans les hépatocytes et augmente le LDL-cholestérol dans le plasma. Cependant, il n’est pas clair si la PCSK9 joue un rôle dans l’intestin. Dans cette étude, nous caractérisons les variations de la PCSK9 et du LDLr dans les cellules Caco-2/15 différentiées en fonction d’une variété d’effecteurs potentiels. Le cholestérol (100 µM) lié à l’albumine ou présenté en micelles a réduit de façon significative l’expression génique (30%, p<0,05) et l’expression protéique (50%, p<0,05) de la PCSK9. Étonnamment, une diminution similaire dans le LDLr protéique a été enregistrée (45%, p<0,05). Les cellules traitées avec le 25-hydroxycholestérol (50 µM) présentent également des réductions significatives dans l’ARNm (37%, p<0,01) et la protéine (75%, p<0,001) de la PCSK9. Une baisse des expressions génique (30%, p<0,05) et protéique (57%, p<0,01) a également été constatée dans le LDLr. Des diminutions ont aussi été observées pour la HMG CoA réductase et la protéine liant l’élément de réponse aux stérols SREBP-2. Il a été démontré que le SREBP-2 peut activer transcriptionnellement la PCSK9 par le biais de la liaison de SREBP-2 à son élément de réponse aux stérols situé dans la région proximale du promoteur de la PCSK9. Inversement, la déplétion du contenu cellulaire en cholestérol par l’hydroxypropyl-β-cyclodextrine a augmenté l’expression génique de la PCSK9 (20%, p<0,05) et son contenu protéique (540%, p<0,001), en parallèle avec les niveaux protéiques de SREBP-2. L’ajout des acides biliaires taurocholate et déoxycholate dans le milieu apical des cellules intestinales Caco-2/15 a provoqué une baisse d’expression génique (30%, p<0,01) et une hausse d’expression protéique (43%, p<0,01) de la PCSK9 respectivement, probablement via la modulation du FXR (farnesoid X receptor). Ces données combinées semblent donc indiquer que la PCSK9 fonctionne comme un senseur de stérols dans le petit intestin.

Les R-loops et leurs conséquences sur l'expression génique chez Escherichia coli.

Des variations importantes du surenroulement de l’ADN peuvent être générées durant la phase d’élongation de la transcription selon le modèle du « twin supercoiled domain ». Selon ce modèle, le déplacement du complexe de transcription génère du surenroulement positif à l’avant, et du surenroulement négatif à l’arrière de l’ARN polymérase. Le rôle essentiel de la topoisomérase I chez Escherichia coli est de prévenir l’accumulation de ce surenroulement négatif générée durant la transcription. En absence de topoisomérase I, l’accumulation de ce surenroulement négatif favorise la formation de R-loops qui ont pour conséquence d’inhiber la croissance bactérienne. Les R-loops sont des hybrides ARN-ADN qui se forment entre l’ARN nouvellement synthétisé et le simple brin d’ADN complémentaire. Dans les cellules déficientes en topoisomérase I, des mutations compensatoires s’accumulent dans les gènes qui codent pour la gyrase, réduisant le niveau de surenroulement négatif du chromosome et favorisant la croissance. Une des ces mutations est une gyrase thermosensible qui s’exprime à 37 °C. La RNase HI, une enzyme qui dégrade la partie ARN d’un R-loop, peut aussi restaurer la croissance en absence de topoisomérase I lorsqu’elle est produite en très grande quantité par rapport à sa concentration physiologique. En présence de topoisomérase I, des R-loops peuvent aussi se former lorsque la RNase HI est inactive. Dans ces souches mutantes, les R-loops induisent la réponse SOS et la réplication constitutive de l’ADN (cSDR). Dans notre étude, nous montrons comment les R-loops formés en absence de topoisomérase I ou RNase HI peuvent affecter négativement la croissance des cellules. Lorsque la topoisomérase I est inactivée, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif conduit à la formation de nombreux R-loops, ce qui déclenche la dégradation de l’ARN synthétisé. Issus de la dégradation de l’ARNm de pleine longueur, des ARNm incomplets et traductibles s’accumulent et causent l’inhibition de la synthèse protéique et de la croissance. Le processus par lequel l’ARN est dégradé n’est pas encore complètement élucidé, mais nos résultats soutiennent fortement que la RNase HI présente en concentration physiologique est responsable de ce phénotype. Chose importante, la RNase E qui est l’endoribonuclease majeure de la cellule n’est pas impliquée dans ce processus, et la dégradation de l’ARN survient avant son action. Nous montrons aussi qu’une corrélation parfaite existe entre la concentration de RNase HI, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif et l’inhibition de la croissance bactérienne. Lorsque la RNase HI est en excès, l’accumulation de surenroulement négatif est inhibée et la croissance n’est pas affectée. L’inverse se produit Lorsque la RNase HI est en concentration physiologique. En limitant l’accumulation d’hypersurenroulement négatif, la surproduction de la RNase HI prévient alors la dégradation de l’ARN et permet la croissance. Quand la RNase HI est inactivée en présence de topoisomérase I, les R-loops réduisent le niveau d’expression de nombreux gènes, incluant des gènes de résistance aux stress comme rpoH et grpE. Cette inhibition de l’expression génique n’est pas accompagnée de la dégradation de l’ARN contrairement à ce qui se produit en absence de topoisomérase I. Dans le mutant déficient en RNase HI, la diminution de l’expression génique réduit la concentration cellulaire de différentes protéines, ce qui altère négativement le taux de croissance et affecte dramatiquement la survie des cellules exposées aux stress de hautes températures et oxydatifs. Une inactivation de RecA, le facteur essentiel qui déclenche la réponse SOS et le cSDR, ne restaure pas l’expression génique. Ceci démontre que la réponse SOS et le cSDR ne sont pas impliqués dans l’inhibition de l’expression génique en absence de RNase HI. La croissance bactérienne qui est inhibée en absence de topoisomérase I, reprend lorsque l’excès de surenroulement négatif est éliminé. En absence de RNase HI et de topoisomérase I, le surenroulement négatif est très relaxé. Il semble que la réponse cellulaire suite à la formation de R-loops, soit la relaxation du surenroulement négatif. Selon le même principe, des mutations compensatoires dans la gyrase apparaissent en absence de topoisomérase I et réduisent l’accumulation de surenroulement négatif. Ceci supporte fortement l’idée que le surenroulement négatif joue un rôle primordial dans la formation de R-loop. La régulation du surenroulement négatif de l’ADN est donc une tâche essentielle pour la cellule. Elle favorise notamment l’expression génique optimale durant la croissance et l’exposition aux stress, en limitant la formation de R-loops. La topoisomérase I et la RNase HI jouent un rôle important et complémentaire dans ce processus.