Caspase-3-dependent phagocyte death during systemic Salmonella enterica serovar Typhimurium infection of mice.

Growth of Salmonella enterica in mammalian tissues results from continuous spread of bacteria to new host cells. Our previous work indicated that infective S. enterica are liberated from host cells via stochastic necrotic burst independently of intracellular bacterial numbers. Here we report that liver phagocytes can undergo apoptotic caspase-3-mediated cell death in vivo, with apoptosis being a rare event, more prevalent in heavily infected cells. The density-dependent apoptotic cell death is likely to constitute an alternative mechanism of bacterial spread as part of a bet-hedging strategy, ensuring an ongoing protective intracellular environment in which some bacteria can grow and persist.

A dynamic view of the spread and intracellular distribution of Salmonella enterica.

The events that determine the dynamics of proliferation, spread and distribution of microbial pathogens within their hosts are surprisingly heterogeneous and poorly understood. We contend that understanding these phenomena at a sophisticated level with the help of mathematical models is a prerequisite for the development of truly novel, targeted preventative measures and drug regimes. We describe here recent studies of Salmonella enterica infections in mice which suggest that bacteria resist the antimicrobial environment inside host cells and spread to new sites, where infection foci develop, and thus avoid local escalation of the adaptive immune response. We further describe implications for our understanding of the pathogenic mechanism inside the host.

Transposon mutagenesis in a hyper-invasive clinical isolate of Campylobacter jejuni reveals a number of genes with potential roles in invasion.

Transposon mutagenesis has been applied to a hyper-invasive clinical isolate of Campylobacter jejuni, 01/51. A random transposon mutant library was screened in an in vitro assay of invasion and 26 mutants with a significant reduction in invasion were identified. Given that the invasion potential of C. jejuni is relatively poor compared to other enteric pathogens, the use of a hyper-invasive strain was advantageous as it greatly facilitated the identification of mutants with reduced invasion. The location of the transposon insertion in 23 of these mutants has been determined; all but three of the insertions are in genes also present in the genome-sequenced strain NCTC 11168. Eight of the mutants contain transposon insertions in one region of the genome (approximately 14 kb), which when compared with the genome of NCTC 11168 overlaps with one of the previously reported plasticity regions and is likely to be involved in genomic variation between strains. Further characterization of one of the mutants within this region has identified a gene that might be involved in adhesion to host cells.

A atividade da pterocarpanoquinona LQB 118 in vitro e in vivo em Leishmania braziliensis

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Portanto tornam-se importantes estudos que conduzam ao desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade da pterocarpanoquinona denominada LQB118 sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos. Para avaliar o modo ação in vitro foi investigada a indução de apoptose usando marcação por TUNEL e Anexina V-FITC. O efeito sobre a modulação da ativação de macrófagos murinos foi analisada pela dosagem de óxido nítrico (reagente de Griess) e de citocinas IL-12, TNF-alfa e IL-10 (por ELISA) nos sobrenadantes de macrófagos. In vivo a atividade terapêutica da LQB 118 foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com a LQB118 pelas vias intralesional (100M/3x/semana) ou oral (0,5mg/5x/semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas. A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A ação da LQB118 in vitro foi dose-dependente tanto na forma promastigota inibindo 45%, 64,7% e 99,95%, quanto nas amastigotas intracelulares 22%, 72% e 81% nas concentrações de 5M, 10M e 20M, respectivamente para ambas as formas evolutivas. A LQB118 foi capaz de induzir a externalização de fosfatidilserina em promastigotas (18,57% das células incubadas por 24 h e em 25,79% de células tratadas por 48h) e também promoveu aumento da fluorescência nas duas formas evolutivas da Leishmania quando comparadas aos controles, demonstrando a indução de fragmentação do DNA do parasito. Esta substância também foi capaz de modular a resposta dos macrófagos infectados por 24 horas aumentando de forma dose-dependente a IL-12 e NO, mantendo constante TNF-α. In vivo, na sétima semana de tratamento, observamos uma redução significativa do tamanho das lesões nos animais tratados com LQB 118 intralesional (p<0, 001) e no grupo tratado pela via oral (p<0,05) quando comparado com o controle. Estes resultados demonstram que a atividade anti-Leishmania da LQB118 é direta sobre o parasito pela indução de morte por apoptose, apresentando também uma ação moduladora da resposta dos macrófagos contribuindo para ação leishmanicida, sem alterar a morfologia da célula hospedeira e que a LQB 118 apresenta uma atividade terapêutica no modelo hamster e pode ser uma importante molécula para o desenvolvimento de um novo fármaco.

Estudo sobre as mudanças fenotípicas conferidas por plasmídios R provenientes de Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli em transconjugantes de E. coli K12-R23

Plasmídios são DNA extracromossômicos, com capacidade de se duplicarem de forma independente das células que os albergam, e são responsáveis pela expressão de uma variedade de características, como fatores de virulência. O material do presente estudo se constituiu da cepa receptora E. coli K12-R23, e de cepas de Klebsiella pneumoniae e de Escherichia coli, doadoras de plasmídios R e transconjugantes. O objetivo do presente estudo foi analisar os fenótipos conferidos em cepas transconjugantes de ambas bactérias pela transferência de plasmídios R de cepas doadoras para a receptora. Para a análise dos fenótipos, utilizaram-se, nas cepas do estudo, algumas variáveis: sensibilidade a antimicrobianos e a ERO, aderência a células HEp-2, e formação de slime e de biofilme. O marcador da presença de plasmídio, neste trabalho, foi a presença de resistênca à gentamicina nas cepas doadoras. Os resultados indicaram que houve transferência de plasmídio, pois as cepas transconjugantes de K. pneumoniae e de E. coli apesentaram este marcador (foram resistentes à gentamicina); além disso, as cepas transconjugantes mostraram perfis distintos da receptora em relação à sensibilidade aos antimicrobianos, às ERO, aos padrões de aderência às células HEp-2 e à formação de slime, apesar de a formação de biofilme nestas cepas não ter sofrido modificações. Observou-se, contudo, que várias características das cepas doadoras não foram encontradas nas cepas transconjugantes de E. coli e de K. pneumoniae.

Ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante por ExoU de Pseudomonas aeruginosa

ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citosol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. No presente trabalho, o efeito de ExoU na ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU), com a mutante deletada no gene exoU, PA103∆exoU, ou com a mutante complementada com exoU sem atividade tipo fosfolipase A2, PA103∆UT/S142A. Análises das dosagens de hidroperóxidos lipídicos e isoprostanos, considerados marcadores de estresse oxidativo, revelaram que ExoU promoveu um aumento em suas concentrações. Foi observado, também, que ExoU estimulou a produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e peroxinitrito nas células infectadas, assim como a expressão de iNOS e eNOS, mas não de nNOS. Além disso, ExoU foi responsável pelo aumento da atividade de SOD1 e pela redução dos níveis de GSH, mas não afetou a atividade da catalase ou de NQO1. No modelo in vivo, a dosagem de malondialdeído, um subproduto da lipoperoxidação de membranas, evidenciou uma maior produção deste composto no pulmão de camundongos infectados pela cepa produtora de ExoU, em comparação ao pulmão de camundongos infectados pela cepa mutante. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, levando à peroxidação lipídica e modulando o sistema de defesa antioxidante

Estudo do metabolismo mitocondrial e da resposta anti-apoptótica de células endoteliais humanas durante a evolução da infecção por taquizoítos de Toxoplasma gondii

A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída que afeta mais de um terço da população mundial e de grande importância na saúde pública. A maioria das infecções em humanos por Toxoplasma gondii é assintomática. A toxoplasmose é amplamente investigada visto que se apresenta como uma doença grave em pessoas imunodeprimidas (portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), não tratados, indivíduos transplantados, paciente em tratamento quimioterápico ou em uso de drogas supressoras e gestantes). A toxoplasmose congênita frequentemente pode levar ao aborto espontâneo ou até mesmo resultar na formação de crianças com algum grau de atraso no desenvolvimento mental e/ou físicos, deste modo, a transmissão congênita pode ser muito mais importante do que se pensava, pois os parasitos encontrados na circulação sanguinea são capazes de infectar as células endoteliais dos vasos e os tecidos circunjacentes, podendo resultar no encistamento do T. gondii. Atualmente a toxoplasmose vem sendo investigada devido a sua associação a inúmeras outras doenças, assim, estudos sobre a evolução da infecção por T. gondii em diferentes tipos de células hospedeiras se fazem necessários para uma abordagem terapêutica adequada. Ao invadir a célula hospedeira o parasito possui a capacidade de recrutar as mitocôndrias promovendo mudanças na organização mitocondrial ao longo da progressão da infecção, garantindo um ambiente favorável a sua multiplicação. Diante disso, investigamos se o parasito possui a capacidade de interferir no metabolismo mitocondrial e na resposta apoptótica da célula endotelial. O presente trabalho teve como objetivo analisar o metabolismo mitocondrial através da respirometria de alta-resolução e da resposta apoptótica através do western blotting das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) infectadas por 2, 6 e 20 horas por taquizoítos de T. gondii. A respirometria de alta-resolução revelou que o parasito interfere no metabolismo energético da célula hospedeira. A análise do conteúdo de proteínas da família Bcl-2 por western blotting revelou maior estímulo apoptótico no tempo inicial de infecção, quando comparado aos demais tempos. Os resultados dos conteúdos de caspase 3, proteína efetora da apoptose, não demonstrou diferença nos tempos iniciais de infecção Entretanto, em tempos mais tardios, o conteúdo de caspase 3 mostrou-se significativamente aumentado quando comparado às HUVEC não infectadas. A dinâmica de replicação do parasito foi observada através do monitoramento pelo sistema Time-Lapse Nikon BioStation IMQ em tempo real das células infectadas por T.gondii. Portanto, nossos resultados sugerem que o protozoário ao recrutar as mitocôndrias da célula hospedeira interfere no metabolismo mitocondrial e na modulação da apoptose para garantir um ambiente favorável a sua multiplicação.

A novel fusion gene, TRIMS-Cyclophilin A in the pig-tailed macaque determines its susceptibility to HIV-1 infection

Objective: In Old World monkeys, the tripartite motif Sec (TRIM5 alpha) protein confers resistance to HIV-1 infection following virus entry into host cells. However, the pig-tailed macaque (Macaca nemestrina) is an exception and is susceptible to HIV-1 in

树突状细胞与 HIV-1 辅助蛋白相互作用的体外研究——细胞系模型研究价值的验证和新的研究方向的确立

树突状细胞（Dendritic cells，DCs）作为人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染的第一靶细胞和第一道防线， 在HIV-1感染 和传播过程当中发挥重要的功能。DC的免疫功能主要包括抗原的捕获、加工、 递呈并激活T细胞对HIV-1作出免疫反应，这些功能的发挥依赖于其自身接受刺 激有效地分化和成熟。 与其它慢病毒（lentivirus）相同，HIV-1所具有的6种辅助蛋白（Nef，Rev， Tat，Vif，Vpr和Vpu），决定着病毒自身的复制增殖和对机体的感染和致病力。 目前，HIV-1辅助蛋白对CD4+ T细胞影响的研究较为深入，是否影响和调节DC 的分化和成熟尚不够清楚，现有的文献报道很少，且相互不一致甚至矛盾。因此， 建立合适的体外研究体系和细胞模型，有针对性地进行研究DC与HIV-1之间的相 互作用，将有助于加深对HIV/AIDS致病和发病机理的理解，具有重要的生物医 学意义。 本实验选择了可被HIV-1感染的白血病细胞系THP-1为实验模型，首先评价 了THP-1作为DC前体在研究DC分化、成熟中的可用性，特别是判定DC分化成熟 和功能状态的主要细胞表面标记的动态变化和规律。进而在相同条件下分析了6 个辅助蛋白基因对THP-1的凋亡诱导作用，证实了Nef和Tat确可诱导转染细胞自 身凋亡，而Rev和Vpr可在THP-1细胞中持续表达，形成了稳定的细胞系，为进一 步研究和比较Rev、Vpr对DC的分化、成熟的影响奠定了实验基础。更重要的是， 我们发现，Vif和Vpu不能在THP-1中有效表达，其原因可能直接与限制性因子 APOBEC3G的存在有关，提示Vpu与APOBEC3G可能存在着新的相互作用——这 一线索已作为实验室新的研究方向，进一步深入的研究可能为HIV/AIDS致病、 发病机理和机体的抗病机制提供新的科学依据。

Zinc coupling potentiates anti-HIV-1 activity of baicalin

Baicalin (BA) has been shown with anti-HIV-1 activity. Zinc is a nutrient element. The anti-HIV-1 activity of zinc complex of baicalin (BA-Zn) in vitro was studied and compared with the anti-HIV-1 activities between BA and BA-Zn in the present study. Our results suggested that BA-Zn has lower cytotoxicity and higher anti-HIV-1 activity compared with those of BA in vitro. The CC(50)s of BA-Zn and BA were 221.52 and 101.73 muM, respectively. The cytotoxicity of BA-Zn was about 1.2-fold lower than that of BA. The BA and BA-Zn inhibited HIV-1 induced syncytium formation, HIV-1 p24 antigen and HIV-1 RT production. The EC(50)s of BA-Zn on inhibiting HIV-1 induced syncytium formation (29.08 muM) and RT production (31.17 muM) were lower than those of BA (43.27 and 47.34 muM, respectively). BA-Zn was more effective than BA in inhibiting the activities of recombinant RT and HIV-1 entry into host cells. Zinc coupling enhanced the anti-HTV-1 activity of baicalin. (C) 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.

Anti-HIV-1 Activity of Lignans from the Fruits of Schisandra rubriflora

This study investigated the 70% aqueous acetone extract of the fruits of Schisandra rubriflora which led to the isolation of eight lignans, including a new isolate, rubrisandrin C (1), and seven known lignans (2-8). The structure of 1 was established by extensive 1D and 2D NMR spectroscopy and its absolute stereochemistry was determined by CD spectrum. Compounds 1-5 and 7-8 were evaluated for their anti-HIV-1 activity that showed inhibitory activity on HIV-1(IIIB) induced syncytium formation with EC50 values in the range of 2.26 similar to 20.4 mu g/mL. Compounds 1 and 7 exerted their obvious protection of HIV-1(IIIB) inducted MT-4 host cells lytic effects with a selectivity index of 15.4 and 24.6, respectively.

An improved microtiter assay for evaluating anti-HIV-I neutralizing antibodies from sera or plasma

Background: The anti-HIV-1 neutralizing antibody assay is widely used in AIDS vaccine research and other experimental and clinical studies. The vital dye staining method applied in the detection of anti-HIV-1 neutralizing antibody has been used in many laboratories. However, the unknown factor(s) in sera or plasma affected cell growth and caused protection when the tested sera or plasma was continuously maintained in cell culture. In addition, the poor solubility of neutral red in medium (such as RPMI-1640) also limited the use of this assay. Methods: In this study, human T cell line C8166 was used as host cells, and 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)- 2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) instead of neutral red was used as vital dye. In order to avoid the effect of the unknown factor( s), the tested sera or plasma was removed by a washout procedure after initial 3 - 6 h culture in the assay. Result: This new assay eliminated the effect of the tested sera or plasma on cell growth, improved the reliability of detection of anti-HIV-1 neutralizing antibody, and showed excellent agreement with the p24 antigen method. Conclusion: The results suggest that the improved assay is relatively simple, highly duplicable, cost-effective, and well reliable for evaluating anti-HIV-1 neutralizing antibodies from sera or plasma.

Isolation of a novel cyanophage infectious to the filamentous cyanobacterium Planktothrix agardhii (Cyanophyceae) from Lake Donghu, China

A previously unknown cyanophage, PaV-LD (Planktothrix agardhii Virus isolated from Lake Donghu), which causes lysis of the bloom-forming filamentous cyanobacterium P. agardhii, was isolated from Lake Donghu, Wuhan, China. PaV-LD only lysed P. agardhii strains isolated from Lake Donghu and not those isolated from other lakes. The PaV-LD particle has an icosahedral, non-tailed structure, ca. 70 to 85 nm (mean +/- SD = 76 +/- 6 nm) in diameter. PaV-LD was stable at freezing temperature, but lost its infectivity at temperatures >50 degrees C. Lysis of host cells was delayed about 3 d after the PaV-LD treatment with chloroform, and the virus was inactivated by exposure to low pH (<= 4). The latent period and burst size of the PaV-LD were estimated to be 48 to 72 h and about 340 infectious units per cell, respectively. The regrowth cultures of surviving host filaments were not lysed by the PaV-LD suspension. To our knowledge, this is the first isolation and cultivation of a virus infectious to the filamentous bloom-forming cyanobacterium Planktothrix from a freshwater lake.

Dynamics of filopodium-like protrusion and endothelial cellular motility on onedimensional extracellular matrix fibrils

Endothelial filopodia play key roles in guiding the tubular sprouting during angiogenesis. However, their dynamic morphological characteristics, with the associated implications in cell motility, have been subjected to limited investigations. In this work, the interaction between endothelial cells and extracellular matrix fibrils was recapitulated in vitro, where a specific focus was paid to derive the key morphological parameters to define the dynamics of filopodium-like protrusion during cell motility. Based on one-dimensional gelatin fibrils patterned by near-field electrospinning (NFES), we study the response of endothelial cells (EA.hy926) under normal culture or ROCK inhibition. It is shown that the behaviour of temporal protrusion length versus cell motility can be divided into distinct modes. Persistent migration was found to be one of the modes which permitted cell displacement for over 300 μm at a speed of approximately 1 μm min-1. ROCK inhibition resulted in abnormally long protrusions and diminished the persistent migration, but dramatically increased the speeds of protrusion extension and retraction. Finally, we also report the breakage of protrusion during cell motility, and examine its phenotypic behaviours. © 2014 The Author(s) Published by the Royal Society. All rights reserved.

Cloning and characterization of a novel C-type lectin gene from shrimp Litopenaeus vannamei

In invertebrates, C-type lectins play crucial roles in innate immunity responses by mediating the recognition of host cells to pathogens and clearing microinvaders, which interact with carbohydrates and function as pattern recognition receptors (PRRs). A novel C-type lectin gene (LvLec) cDNA was cloned from hemocytes of Litopenaeus vannamei by expressed sequence tag (EST) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) PCR. The full-length cDNA of LvLec was of 618 bp, consisting of a 5'-terminal untranslated region (UTR) of 60 bp and a 3'-UTR of 87 bp with a poly (A) tail. The deduced amino acid sequence of LvLec possessed all conserved features critical for the fundamental structure, such as the four cysteine residues (Cys(53), Cys(128), Cys(144), Cys(152)) involved in the formation of disulfides bridges and the potential Ca2+/carbohydrate-binding sites. The high similarity and the close phylogenetic relationship of LvLec shared with C-type lectins from vertebrates and invertebrates. The structural features of LvLec indicated that it was an invertebrate counterpart of the C-type lectin family. The cDNA fragment encoding the mature peptide of LvLec was recombined and expressed in Escherichia coli BL21(DE3)-pLysS. The recombinant protein (rLvLec) could agglutinate bacteria E. coli JM109 depending on Ca2+, and the agglutination could be inhibited by mannose and EDTA. These results indicated that LvLec was a new member of C-type lectin family and involved in the immune defence response to Gram negative bacteria in Litopenaeus vannamei. (C) 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.