Studies on follicular growth in the immature rat and hamster: Effect of a single injection of gonadotropin or estrogen on the rate of3H-thymidine incorporation into ovarian DNAin vitro

Initiation of follicular growth by specific hormonal stimuli in ovaries of immature rats and hamsters was studied by determining the rate of incorporation of3H-thymidine into ovarian DNAin vitro. Incorporation was considered as an index of DNA synthesis and cell multiplication. A single injection of pregnant mare serum gonadotropin could thus maximally stimulate by 18 hr3H-thymidine incorporation into DNA of the ovary of immature hamsters. Neutralization of pregnant mare serum gonadotropin by an antiserum to ovine follicle stimulating hormone only during the initial 8–10 hr and not later could inhibit the increase in3H-thymidine incorporationin vitro observed at 18 hr, suggesting that the continued presence of gonadotropin stimulus was not necessary for this response. The other indices of follicular growth monitored such as ovarian weight, serum estradiol and uterine weight showed discernible increase at periods only after the above initial event. A single injection of estrogen (diethyl stilbesterol or estradiol-l7β) could similarly cause 18 hr later, a stimulation in the rate of incorporation of3H-thymidine into DNAin vitro in ovaries of immature rats. The presence of endogenous gonadotropins, however, was obligatory for observing this response to estrogen. Evidence in support of the above was two-fold: (i) administration of antiserum to follicle stimulating hormone or luteinizing hormone along with estrogen completely inhibited the increase in3H-thymidine incorporation into ovarian DNAin vitro; (ii) a radioimmunological measurement revealed following estrogen treatment, the presence of a higher concentration of endogenous follicle stimulating hormone in the ovary. Finally, administration of varying doses of ovine follicle stimulating hormone along with a constant dose of estrogen to immature rats produced a dose-dependent increment in the incorporation of3H-thymidine into ovarian DNAin vitro. These observations suggested the potentiality of this system for developing a sensitive bioassay for follicle stimulating hormone.

Synthetic Modifications of Estrogens and Androgens

Estrogens the female sex hormones have numerous biological actions. Estradiol is the most abundant estrogen in women before menopause. It influences the development, maturation and function of the female reproductive tract. It also plays a role in mammary cancer. Accordingly determinations of estradiol level in body fluids assist in the evaluation of ovarian function and diagnosis for malignancies. Estriol is the primary estrogen in pregnant women and secreted from the fetoplacental unit. Measurement of estriol in maternal body fluids is the basis of fetoplacental monitoring test. Concentration of estrogens in body fluids is determined by immunoassay. Accuracy of this measurement depends on the availability of a specific antibody. As estrogens are not antigenic, their derivatives (haptens) are coupled with a carrier and this hapten-protein conjugate is used to generate antibodies. Specificity of the generated antibody largely depends on the structure of hapten. Therefore the synthesis of a hapten with a right structure is crucial for the accurate measurement of a steroid. We have synthesised new haptens for estradiol and estriol by adding an alkyl or alkoxy side chain at the C-7 of estrane skeleton. The side chains carry a terminal amino group, which can be used for conjugation with a carrier molecule. Estrogens and their biosynthetic precursor androgens both exist as fatty acid esters. They are known to act as hormone storage but their physiological role is not completely known yet. Our collaborator is studying their effect in cardiovascular diseases. We synthesised fatty acid ester derivatives of several steroids in high yield by a very rapid procedure (in 1 min) under microwave irradiation in an ionic liquid (IL). An expedient regioselective hydrolysis at C-3 of estradiol diesters is also reported. 8-Isoestrogens are compounds of pharmaceutical interests, their synthesis, structure, conformation and biological activity studies are ongoing. 7-Hydroxy-8-isoestradiol and 7-alkyl ether of it were synthesised as well. During this study we have developed a selective O-debenzylation method. A mild route for selective removal of benzylic protection on phenol in presence of benzyl protected alcohol was explored.

Hormonal modulation of secretion of immunoreactive riboflavin carrier protein by adult rat Leydig cells in vitro

Adult rat Leydig cells in culture synthesize and secrete riboflavin carrier protein (RCP) as demonstrated by [S-35]-methionine incorporation into newly synthesized proteins followed by immunoprecipitation as well as specific radioimmunoassay. LH stimulates the secretion of RCP 4-fold which could be inhibited upto 75% by an aromatase inhibitor. 8-bromo-cyclic AMP and cholera toxin could mimic the LH stimulated secretion of the carrier protein. The extent of stimulation of RCP secretion brought about by exogenous estradiol-17 beta is comparable to that of LH. The antiestrogen tamoxifen, when added along with either LH or estrogen, inhibited the stimulated levels significantly. These results show that the estrogen-inducible riboflavin carrier is secreted by Leydig cells under positive regulation of LH.

Expression of Bioactive Callithrix jacchus Follicle-Stimulating Hormone in Pichia pastoris

Callithrix jacchus (common marmoset) is a New World primate monkey, used as an animal model in biomedical research. Marmoset-specific follicle-stimulating hormone (FSH) preparation is required to improve superovulation protocols and to develop homologous FSH monitoring assays in these monkeys. In this study, we document the large-scale expression of recombinant marmoset FSH in methylotropic yeast, Pichia pastoris. The recombinant preparation was found to be immunologically active in Western blotting and radioimmunoassay. The preparation displayed receptor binding ability in radioreceptor assay. Based on the receptor binding ability, the yield of fermentation was estimated to be 7.2 mg/L. FSH-induced cAMP assay and estradiol assay revealed that the recombinant hormone is able to induce signal transduction. Both immunological and in vitro biological activity of marmoset FSH was found to be comparable to purified human pituitary FSH, which served as reference hormone for these assays. Thus, the study suggests that a Pichia expression system can be used for large-scale expression of bioactive recombinant marmoset FSH.

Sincronización hormonal del estro en cabras criollas, bajo condiciones semi-intensivas de trópico seco en Nicaragua

El objetivo de este estudio fue evaluar la efectividad de dos tratamientos hormonales en la sincronización del estro en hembras caprinas bajo condiciones semi intensivas del trópico seco. Cada unidad experimental estuvo representada por una hembra caprina reproductora, cuya edad osciló entre los 3½ años con pesos promedios de 38 kg pv, se utilizó un total de 30 hembras. Estas se distribuyeron en tres tratamientos, conformados por diez unidades experimentales cada uno. Tratamiento 1 :EAZI-BREED ® -CIDR ® vía intravaginal, conteniendo 300 mg (0.3 g) de progesterona sintética (que liberó 20 mg d -1 aproximadamente) + ECP (Cipionato de Estradiol) a razón de 2.5ml, vía intramuscular (3 mg/ml) al noveno día (después de retirar el CIDR ® ), se aplicó 3ml de Lutalyse ® (PGF2α, 5 mg Dinopróstamina por ml) vía intramuscular; El segundo tratamiento fue conformada: EAZI-BREED ® -CIDR ® + Lutalyse ® (PGF2α) al retiro del CIDR ® ; Tratamiento 3: control o efecto macho (estas fueron expuestas al macho de forma continua durante toda la duración del experimento). Se detectó celo después de retirar el CIDR ® , a intervalos de 24, 48, 72 y 96 horas. Los resultados obtenidos para las variables en estudio, mostraron que la variable detección de celo fue altamente significativa (P<0.01), estado gestacional fue significativa (P<0.05); mientras que para las variables aparición de celo (h) y número de embriones, no se encontraron diferencias significativas (P˃ 0.05). La sobrevivencia embrionaria por tratamiento fue de 85% para T1, 80% para T2 y 70% para T3. El análisis financiero determino que el tratamiento T2 fue el más viable.

Consumo materno de dois compostos bioativos da semente da linhaça sobre parâmetros bioquímicos e hormonais das mães e proles durante a lactação

Avaliamos o efeito do consumo materno de SDG (Diglicosídeo Secoisolariciresinol) e de óleo de Linhaça+SDG sobre parâmetros bioquímicos e hormonais das ratas e das proles machos e fêmeas na lactação. As ratas lactantes foram separadas em: controle (C), ração controle cuja proteína foi caseína; (SDG): ração C com 400mg de SDG/Kg de ração; OLSDG: ração C com 400mg de SDG/Kg de ração e 7% de óleo de linhaça. No 14 e 20 dias de lactação as ratas foram ordenhadas e no 21 dia foram sacrificadas por punção cardíaca. Leite e soro foram coletados para avaliação bioquímica e hormonal. Hormônios foram quantificados por radioimunoensaio. As proles machos e fêmeas foram sacrificadas aos 14 e 21 dias de idade. Os animais foram eviscerados para análise da composição corporal. Monitoramos a ingestão alimentar e a massa corporal (MC) durante o período experimental. As ratas SDG apresentaram maior gordura corporal (GC; +39%), enquanto as OLSDG menor conteúdo mineral (-20%) e trigliceridemia (TG) (-39%). As ratas SDG e OLSDG apresentaram hiperprolactinemia (+389% e 153%, respectivamente) sem alteração na concentração de estradiol. No 14 dia de lactação, o leite das ratas OLSDG apresentou menores teores de lactose(-17%) e de proteínas (-20%) e o das ratas SDG apenas menor teor de proteína (-21%). A partir do 13 dia de lactação tanto os machos quanto as fêmeas OLSDG apresentaram menor MC (-14%, -16%, respectivamente). No 14 dia de lactação os machos SDG e OLSDG apresentaram menor gordura corporal (-24%, -55%, respectivamente ) e a prole SDG maior massa de gordura visceral (+39%). Os machos SDG apresentaram maiores concentrações de TG (+105%) e hipoprolactinemia (-41%). Os machos OLSDG também apresentaram hipoprolactinemia (-41%). As fêmeas SDG e OLSDG apresentaram maior estradiol aos 14 dias (+86% e +176%) que se normalizou aos 21 dias, maior colesterolemia (+16%) e as SDG apresentaram maior trigliceridemia (+74%). Aos 21 dias os machos e as fêmeas SDG e OLSDG apresentaram menor trigliceridemia (-48%, -54%,42% e -59%, respectivamente). Os dois componentes principais da semente de linhaça produzem alterações bioquímicas e hormonais tanto nas mães, quanto nas proles, independente do sexo. Entretanto, as alterações observadas diferem entre mães e prole e de acordo com o gênero. Entre as alterações mais importantes ressaltamos a hiperprolactinemia materna que pode ser um dos motivos para a hipoprolactinemia da prole e a hipertrigliceridemia causada pela ingestão de SDG pelas mães.

Efeitos da associação entre dieta hiperlipídica e ovariectomia sobre aspectos comportamentais, lipídeos séricos e o desenvolvimento corporal de ratas adultas

O aumento da longevidade evidenciou nas mulheres os efeitos deletérios da deficiência ovariana como, a obesidade central e as doenças neurodegenerativas. Os hábitos alimentares modernos favorecem o consumo excessivo de gorduras, que contribuem para efeitos adversos sobre a saúde, incluindo alteração da composição corporal e da função nervosa. Assim, objetivamos estudar como a dieta hiperlipídica (DH), contendo óleo de soja, associada à perda da função gonadal influenciam o comportamento e o desenvolvimento corporal de ratas adultas. Ratas Wistar adultas foram ovariectomizadas (OVX) ou pseudo-operadas (C) e após 7d passaram a receber dieta contendo 4%(normo) ou 19%(hiperlípidica) de óleo de soja: C4 (n=29), OVX4 (n=30), C19 (n=30), OVX19 (n=30). Foram avaliados a massa e o comprimento corporais e a ingestão alimentar, e aspectos comportamentais de ansiedade, através de teste no Labirinto em Cruz Elevado (LCE); de busca pela novidade, por testes no Campo Vazado (CV); e aprendizagem/memória avaliada no labirinto aquático radial de 8 braços (LAROB). Ao final dos testes, os animais foram anestesiados, exsanguinados e o tecido adiposo intra-abdominal foi coletado e pesado. O soro foi utilizado para dosagens de triglicerídeo (TG), VLDL-c, colesterol (COL), HDL-c e estradiol. A ingestão alimentar média e o comprimento corporal não diferiram entre os grupos, mas o grupo OVX19 mostrou ganho significativo (13,6%) de massa corporal mais precocemente que os demais. O mesmo padrão foi observado quanto à massa de tecido adiposo, que foi 86% maior no OVX19. Os TG, VLDL e COL aumentaram cerca de 28% no OVX19, porém sem alteração de HDL-c (33,762,2 mg/dl). A DH e a ovariectomia se mostraram ansiogênicos e quando associados, a DH parece reverter o efeito ansiogênico da castração. Padrão similar de resposta foi observado na resposta ao teste de busca por novidade. No teste de aprendizagem/memória o OVX4 apresentou maior tempo de latência no primeiro dia, e todos responderam de forma semelhante nos demais dias. Conclui-se que a deficiência de estradiol acompanhada da ingestão de dieta hiperlipídica mantém o desempenho cognitivo, o comportamento emocional e a motivação, embora prejudique a adiposidade e o metabolismo lipídico.

Avaliação da função endotelial em mulheres jovens portadoras da síndrome dos ovários policísticos

A síndrome dos ovários policísticos é uma desordem frequente e complexa, com grande variabilidade fenotípica, predominando os sinais de disfunção ovariana. Alterações metabólicas, inflamatórias e vasculares vinculadas à resistência à insulina são muito prevalentes nessa desordem podendo manifestar-se precocemente. O objetivo principal deste estudo foi investigar a presença de alterações microvasculares em mulheres jovens e não obesas portadoras da síndrome dos ovários policísticos, através de videocapilaroscopia periungueal e dosagem dos níveis séricos de endotelina-1. O objetivo secundário foi verificar a existência de associações entre os achados vasculares, níveis séricos de androgênios, parâmetros clínicos, bioquímicos, metabólicos e inflamatórios relacionados ao risco cardiovascular. Em estudo observacional, transverso e controlado avaliamos 12 mulheres com diagnóstico de síndrome dos ovários policísticos, segundo os critérios estabelecidos pelo consenso de Rotterdam e nove voluntárias saudáveis. A idade (22,82,3 X 24,62,7), o índice de massa corporal (22,53,4 X 23,73,1) e a circunferência da cintura (7510,1 X 77,38,1) foram semelhantes nos dois grupos. As portadoras da síndrome apresentavam hiperandrogenismo clínico. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos quando analisados os níveis séricos de estradiol, testosterona total, androstenediona ou o índice de testosterona livre, entretanto a SHBG mostrou-se significativamente mais baixa no grupo de estudo (p=0,011). A glicemia de jejum, insulina, HOMA-IR e o perfil lipídico foram normais e sem diferença entre os grupos. A amostra com síndrome dos ovários policísticos não apresentava intolerância à glicose ou Diabetes Mellitus pelo teste oral de tolerância à glicose. Os níveis séricos dos marcadores inflamatórios (leucócitos, ácido úrico, adiponectina, leptina e proteína c reativa) e do marcador de função endotelial avaliado também foram similares nos dois grupos. A velocidade de deslocamento das hemácias no basal e após oclusão foram significativamente menores nas pacientes de estudo (p=0,02), mas o tempo para atingir a VDHmax e os parâmetros relativos à morfologia e densidade capilar foram semelhantes. Não observamos correlação entre a velocidade de deslocamento das hemácias e níveis plasmáticos de endotelina-1, androgênios ou parâmetros de resistência insulínica. A velocidade de deslocamento das hemácias associou-se positivamente aos níveis plasmáticos de estradiol (r= 0,45, p<0,05) e negativamente aos de colesterol total e LDL colesterol (r= -0,52, p<0,05; r=-0,47, p<0,05, respectivamente). Em conclusão nossos resultados fornecem evidência adicional de dano precoce à função microvascular em mulheres portadoras de síndrome dos ovários policísticos. Através da capilaroscopia periungueal dinâmica, demonstramos que mulheres jovens com moderado hiperandrogenismo, sem obesidade, RI, hipertensão ou dislipidemia, já apresentam disfunção microvascular nutritiva, caracterizada por redução na velocidade de fluxo das hemácias no basal e após oclusão. Estes achados micro-circulatórios não foram acompanhados de elevações nos níveis plasmáticos de endotelina-1.

Efeito do docetaxel e da ciclofosfamida nas alterações da matriz óssea

A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima para 2030, 27 milhões de casos incidentes de câncer. No Brasil, segundo o Instituto Nacional do Câncer, foram estimados 518.510 casos novos de câncer para os anos de 2012 e 2013. Dessa estimativa, 52.680 correspondem ao câncer de mama (CM), com um risco estimado de 52 novos casos a cada 100.000 mulheres. O câncer de mama é um dos tipos de câncer mais comuns no mundo todo. Hoje se sabe que o tratamento para o CM pode levar ao surgimento de diferentes efeitos adversos tardios, entre eles a osteoporose. Uma das principais causas de surgimento da osteoporose é a menopausa precoce, que ocorre através da diminuição da concentração de estrogênio sérico. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos na matriz óssea induzidos pela quimioterapia, simulando um tratamento para o CM, em ratas Wistar.Ratas Wistar, com aproximadamente 3 meses de idade, foram divididas em: grupo controle e grupo que recebeu quimioterapia com poliquimioterápico docetaxel + ciclofosfamida (TC). A quimioterapia foi administrada em 4 ciclos, com intervalo de 1 semana entre eles. Os ratos foram submetidos à eutanásia 5 meses após o término do tratamento, para que os efeitos tardios pudessem ser avaliados. Vários estudos foram conduzidos: dosagem sorológica de estradiol, ensaios histológicos através de imunohistoquímica, micro-fluorescência de Raios-X, micro-tomografia computadorizada. Além de microscopia eletrônica de transmissão e varredura.Analisando os resultados obtidos em conjunto, sugere-se que a etapa inicial para o desenvolvimento da osteoporose, causada pelo poliquimioterápico TC, seja a diminuição da função ovariana. Este evento leva à diminuição da concentração de estrogênio sérico, o que causa a atrofia uterina. Concomitante a estes fatos, o TC causa redução na concentração de zinco no tecido ósseo. Estes resultados associados causam um desequilíbrio na relação osteoblastos/osteoclastos no osso. A redução do estrogênio leva à diminuição da apoptose de osteoclastos, enquanto que a redução do zinco inibe a função dos osteoblastos. Este desequilíbrio interfere no turnover do osso, de forma a aumentar a reabsorção óssea. Deste modo, o percentual de osso fica reduzido, as trabéculas tornam-se mais finas e espaçadas. O endpoint deste processo é a osteoporose.A administração dos poliquimioterápicos docetaxel e ciclofosfamida em conjunto leva a diminuição da massa óssea, a adelgaçamento das trabéculas e o aumento do espaço entre elas. Estas observações sugerem que realmente as ratas tratadas com TC apresentam osteoporose. Concluímos que tanto o estrogênio quanto o zinco têm papel fundamental no desenvolvimento desta patologia após quimioterapia com TC.

Papel do sistema renina-angiotensina e do desequilíbrio redox em modelo experimental de pré-eclâmpsia induzida por L-NAME

Pré-eclâmpsia (PE), uma síndrome sistêmica da gestação caracterizada por proteinúria e hipertensão, está associada a uma significativa mortalidade tanto materna quanto fetal. Eentretanto, sua fisiopatologia ainda não é totalmente compreendida. Apesar de um expressivo aumento da atividade do sistema renina-angiotensina (SRA) na gestação normal, a pressão arterial não aumenta. Além disso, a redução da pressão de perfusão intra-uterina promove um aumento na liberação de espécies reativas de oxigênio que podem contribuir para a hipertensão na gestação. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi estudar o papel do SRA vascular, assim como, do estresse oxidativo plasmático, cardiorenal e placentário para a regulação cardiovascular materna em ratas normotensas e em modelo de PE induzida por L-NAME. Foi observado um aumento da pessão arterial em animais que receberal L-NAME. As ratas grávidas + L-NAME apresentaram um menor ganho de massa corporal durante a gestação, menor múmero de filhotes vivos, maior número de abortos, menor massa placentária total e fetos com menor massa corporal. Foi observada uma redução na resposta vasodilatadora induzida por acetilcolina (ACh) e angiotensina (Ang) II, aumento na resposta vasodilatadora induzida por nitroglicerina (NG) e aumento na resposta vasoconstritora induzida por fenilefrina (Phe) e Ang II em LAM de ratas grávida e não grávidas que receberam L-NAME. Não foi observada diferença na expressão dos receptores AT1 e AT2 e das enzimas ECA, ECA2 e eNOS. Foi observado um aumento na concentração plasmática de renina e bradicinina (BK) em ratas grávidas + L-NAME e uma redução na concentração de Ang 1-7. As ratas grávidas e grávidas + L-NAME apresentaram um aumento nos níveis séricos de estradiol. Os níveis de malondialdeído e carbonilação de proteínas estava aumentados e a atividade das enzimas antioxidantes SOD e GPx estavam reduzidas em ratas grávidas e não grávidas que receberam L-NAME. A atividade da CAT não apresentou diferença entre os grupos. Em conclusão, uma redução na vasodilatação induzida pela Ang II associada a um aumento da vasoconstrição promovida por este peptídeo, sugerem uma contribuição do SRA no desenvolvimento das complicações características da PE observadas no modelo experimental de PE induzido por L-NAME. Do mesmo modo, a peroxidação lipídica e oxidação de proteínas aumentadas, assim como, as atividades enzimáticas antioxidantes reduzidas sugerem a contribuição de uma defesa antioxidante comprometida e um dano oxidativo aumentado para o desenvolvimento da hipertensão e disfunção endotelial, aumento da mortalidade fetal e retardo do crescimento intra-uterino observados no modelo de PE estudado.

Efeitos do tratamento prolongado com isoflavonas de soja no útero, mamas, tecidos adiposo e ósseo de ratas ovariectomizadas

A menopausa, fenômeno fisiológico que ocorre em todas as mulheres, em média, aos 51 anos, é acompanhada em cerca de 80% dos casos de sintomas como fogachos, secura vaginal, irritabilidade e insônia, que interferem na qualidade de vida e na produtividade socioeconômica das mulheres, além de predispô-las a doenças crônico-degenerativas, como arteriosclerose, obesidade e distúrbios cardiovasculares. A terapia de reposição hormonal à base de estrógenos, que visa reduzir os incômodos da menopausa, está associada ao aumento do risco de câncer de mama e do endométrio, como foi demonstrado em estudos científicos. Considerando que as mulheres orientais, consumidoras de soja, apresentam doenças crônico-degenerativas e câncer em taxas inferiores às dos países ocidentais, as isoflavonas da soja têm sido testadas em estudos clínicos e experimentais, porém com obtenção de dados até contraditórios. O presente estudo investigou o efeito da administração crônica de isoflavonas de soja no útero, mamas e tecidos adiposo e ósseo de ratas ovariectomizadas. Quarenta ratas Wistar adultas foram distribuídas em quatro grupos experimentais: a) ovariectomizadas: grupo ISO, recebendo isoflavonas de soja (100mg/kg/dia/v.o.); b) ovariectomizadas: grupo BE, recebendo benzoato de estradiol (10g/kg/dia/s.c.); c) ovariectomizadas: grupo OVX, recebendo salina (0,1ml/100g/dia/v.o.); d) controles: grupo FO, recebendo salina (0,1ml/100g/dia/v.o.). Antes e durante os 90 dias de tratamento, foram analisados os esfregaços vaginais, para acompanhamento do ciclo estral, determinação do peso corporal e do consumo de ração semanal. Após esse período, os animais foram anestesiados e o sangue coletado para análise de estradiol e progesterona séricos, por radioimunoensaio; e lipidograma e glicose, por espectrofotometria. Posteriormente, os animais foram sacrificados e necropsiados, coletando-se o útero, mamas, gordura intra-abdominal e fêmur para macroscopia e pesagem. Os tecidos selecionados para o estudo foram corados em HE, analisados por microscopia óptica e histomorfometria, visando investigar alterações do crescimento celular (software V.S NIH Image-J; imagens digitais-optronicos CCD). No grupo tratado com isoflavonas, o peso corporal diminuiu em relação OVX, no qual ocorreu aumento de peso em comparação aos animais falso-operados. O exame macroscópico revelou que o útero diminuiu de peso nas ratas do grupo ISO, semelhante às do OVX. Além disso, a histopatologia das glândulas endometriais não mostrou alterações entre os grupos ISO e OVX. Contudo, o grupo BE apresentou proliferação glandular, pseudoestratificação epitelial, frequentes mitoses típicas, metaplasia escamosa, infiltrado eosinofílico e hidrométrio. A concentração de estradiol no grupo ISO foi semelhante à do OVX. Porém, no grupo BE, o estradiol e o peso uterino apresentaram-se aumentados em relação ao OVX. Não foram observadas diferenças na histomorfometria mamária entre os grupos. Houve redução no peso do tecido adiposo abdominal no grupo ISO, comparado com o OVX, sem identificação de alterações morfológicas significativas, apenas hipotrofia celular, confirmada pela histomorfometria. Apesar de não ter havido diferenças na concentração de glicose, colesterol total e triglicerídeos, entre os grupos, o colesterol-HDL apresentou aumento no grupo ISO. Não houve diferença na densitometria do fêmur entre os grupos avaliados. Esses resultados indicam que o tratamento crônico com isoflavonas de soja, na dose testada, não induz mudanças significativas no útero, mamas e tecidos adiposo e ósseo, sugerindo segurança no tratamento, sem risco para o desenvolvimento de câncer.

Ocorrência e ecotoxicidade de desreguladores endócrinos químicos em ambientes aquáticos e em sistemas de tratamento de esgoto

A aplicabilidade de um método selecionado de medição indireta de vitelogenina (Vtg) em plasma sanguíneo de peixe, baseado na quantificação de fosfato álcali-lábil (alkali-labile phosphate-ALP) para acessar estrogenicidade em água, foi investigada na presente tese. O método foi originalmente desenvolvido para a espécie de peixe Carassius carassius (Carpa cruciana) e aplicado pela primeira vez na espécie Oreochromis niloticus (Tilápia do Nilo) no presente estudo. Com o objetivo de acessar a sensibilidade do método, em uma primeira etapa da investigação foram realizados estudos laboratoriais com soluções estoques de 17-ethinylestradiol (EE2), 17-estradiol (E2), e estrona (E1). Os efeitos destes hormônios foram investigados com base tanto na concentração quanto na carga, utilizando-se para tanto, unidades experimentais com volumes distintos (2 L e 130 L). Após a validação do método de ALP, a estrogenicidade foi avaliada nas seguintes águas contaminadas: (i) afluente e efluente de uma grande estação de tratamento de esgotos convencional (ETE) e de uma estação descentralizada de tratamento de esgoto de pequeno porte (Ecossistema Engenheirado-DEE); (ii) água superficial (SW) e água subterrânea (GW) coletadas em uma área de brejo contaminada com gasolina; (iii) água de uma lagoa urbana (LRF) da cidade do Rio de Janeiro, com alta densidade populacional e descarte clandestino de esgoto. Na segunda etapa foram analisados em microalgas os efeitos (outros que não disrupção endócrina) causados pelos hormônios EE2, E2 e E1. Os hormônios foram testados individualmente e em misturas, em culturas individuais e combinada (S+) das espécies de microalgas unicelulares P. subcapitata e D. subspicatus. Com base nos níveis de ALP para a espécie de peixe e no EC50 para as espécies de algas, os resultados mostraram que o EE2 e o E2 causaram disrupção endócrina superior e foram mais tóxicos do que o E1 para peixes e microalgas respectivamente. Quando em misturas (E+) de concentrações equivalentes (EE2:E2:E1), os estrogênios resultaram em efeito aditivo para as espécies O. niloticus e P. subcapitata, e menos que aditivo para D. subspicatus e cultivo misto de algas (S+). Culturas contendo ambas as espécies de algas (S+) por um longo período de exposição (96 h) resultaram na atenuação dos efeitos tóxicos causados pela exposição, tanto individual (EE2, E2 ou E1), quanto na mistura (E+) dos estrogênios, medidos em termos de EC50 (T0h 0,07; 0,09; 0,18; e 0,06 g mL-1; e T96h 1,29; 1,87; 5,58; e 4,61 g mL-1, respectivamente). O DEE apresentou uma maior eficiência na remoção dos disrutores endócrinos do que a ETE convencional. Foi detectada estrogenicidade em amostras da LRF, e de água SW e GW em área brejosa contaminada com gasolina. Os resultados dos ensaios sugerem que as interações (efeitos aditivos ou menos que aditivo) causadas pela mistura dos estrogênios assim como, as interações entre as espécies de algas afetaram o resultado final dos ensaios ecotoxicológicos. Um fator raramente abordado em estudos ecotoxicológicos que foi destacado na presente tese refere-se à importância de considerar não somente a concentração e a dosagem, mas também a carga aplicada e o volume das unidades experimentais. Devido à boa sensibilidade do O. niloticus quando exposto às concentrações relativamente baixas dos estrogênios, a combinação do método de ALP com os biomarcadores auxiliares (particularmente MN) pode ser um protocolo adequado para a detecção de estogenicidade e genotoxicidade respectivamente em diferentes ambiente aquáticos contaminados, como parte de um programa de monitoramento ambiental

Avaliação da presença de metilparabeno e propilparabeno no ambiente aquático e seus potenciais estrogênicos e a toxicidade aguda.

Atualmente no cenário mundial a qualidade da água tem gerado muitas preocupações, pois milhares de produtos sintéticos são produzidos para facilitar muitas práticas industriais, domésticas e pessoais e com isso diversas substâncias químicas utilizadas para esses fins são introduzidas no meio ambiente. Os parabenos são substâncias químicas utilizadas pelas indústrias farmacêuticas, de alimentos e cosméticos e que cuja função é a conservação, sendo que há muitos questionamentos em relação a sua segurança, pois alguns relatórios têm mostrado que a exposição a esses parabenos pode modular ou perturbar o sistema endócrino e com isso gerar consequências prejudiciais à saúde humana e aos ambientes aquáticos. Esse estudo teve como objetivo avaliar a presença dos Parabenos Metilparabeno e Propilparabeno no ambiente aquático e os seus potenciais estrogênicos e a toxicidade aguda. A metodologia se desenvolveu a partir do ensaio in vitro YES para a determinação da atividade estrogênica, ensaios de toxicidade aguda em Daphnia similis e em Aliivibrio fischeri e a quantificação dos parabenos na água do Rio Maracanã-RJ através da cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massa. Os resultados obtidos para a CE50 dos MP e PP, a partir do ensaio in vitro YES, foi de 18,91 mgL-1 e 7 mgL-1 e a magnitude da resposta foi de 10-5 e 10-4 menos potente que 17ß-estradiol para o MP e o PP, respectivamente. A partir do ensaio de toxicidade aguda, os valores de CE50 obtidos em Daphnia similis, foi de 29,42 mgL-1 e 9,94 mgL-1e em Aliivibrio fischeri foi de 3,047 mgL-1 e 1,946 mgL-1, respectivamente, com isso observou-se que o PP é mais tóxicos em todos os organismos testados, sendo mais tóxicos para um e menos para outros. A água do Rio Maracanã não foi tóxica para a Daphnia similis em nenhum dos dois pontos, já para o Aliivibrio fischeri foi tóxica em apenas um ponto. As concentrações encontradas de MP e PP foram maiores no ponto onde, de acordo com os parâmetros físico-químicos, a qualidade da água não está dentro dos padrões exigidos pela legislação, sendo quantificados na ordem de ngL-1, contudo é válido ressaltar que os DEs não são encontrados no meio ambiente separados, eles interagem entre si e provocam efeitos aditivos ou sinérgicos, sendo muito difícil de prever qual o efeito, por isso é importante o conhecimento do potencial estrogênico das substâncias simples, pois em um estudo com uma matriz ambiental, pode-se observar se houve algum efeito aditivo ou sinérgico de outras substâncias.

Programação metabólica do testículo pelo tratamento com injeção de leptina em ratos nos primeiros dias de vida

A leptina tem um papel importante na regulação do sistema reprodutivo além de seu papel principal na regulação do peso corporal e ingestão alimentar. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da administração de leptina durante o período neonatal na função testicular da prole adulta. Vinte e quatro filhotes de 12 mães foram divididos em 2 grupos: Grupo leptina: injetados com 50 L de leptina (80ng/gPC, subcutânea) nos primeiros 10 dias de vida e Grupo Controle: injetados com o mesmo volume de solução salina. Todos os animais foram sacrificados aos 90 dias de vida. Parâmetros analisados: consumo alimentar, massa corporal, crescimento linear, data de início da puberdade, perfil lipídico, níveis séricos de estradiol e testosterona, expressão gênica (PCR em tempo real) e expressão proteica (Western blot) de ObRa, OBRb, aromatase, AR, ER, morfometria testicular, número, morfologia e viabilidade de espermatozoides. Os dados foram expressos como média erro padrão. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student. A Injeção de leptina levou a uma redução (p≤0,008) no consumo alimentar a partir do dia 26 ao 40 e do dia 70 em diante, enquanto que a massa corporal (p≤0,03) e o crescimento linear (p≤0,05) foram reduzidos do dia 26 até o dia 45. O peso da hipófise (p≤0,0006), hipotálamo (p≤0,01), próstata (p≤0,003), testículo (p≤0,008) e epidídimo (p≤0,004) e bexiga (p≤0,009) foram significativamente reduzidos pela injeção de leptina. A Injeção de leptina adiantou o início da puberdade (C=45,0 0,3; L=41,6 0,3; dias, P≤0,0001). Em relação ao perfil lipídico, a administração de leptina gerou um aumento nos níveis séricos de TG (C= 116,5 15,9; L=172,6 19,7; ng/dL, P≤0,05) e uma redução nos níveis de HDL (C=33 1,5; L = 24 3,5; ng/dL, P≤0,02). Os níveis séricos de testosterona também foram reduzidos pela leptina (C=5,2 1,0; L=1,1 0,3; ng/mL, P≤0,003). Todos os genes avaliados por PCR em tempo real mostraram um aumento na sua expressão: Obra (C=0,32 0,04; L=0,69 0,16; P≤0,04), OBRb (C=0,37 0,06; L=0,71 0,16; P≤0,03), AR (C=0,28 0,02; L=0,71 0,16; P≤0,02), Aromatase (C=0,31 0,04; L=0,53 0,09; P≤0,04), ER-α (C=0,79 0,03; L=0,93 0,03; P≤0,01), ER-β (C=0,29 0,03; L=0,73 0,16; P≤ 0,02). Por outro lado, a expressão proteica de OBR (C=4,4 0,29; L=6,6 0,84; P≤0,05), ER-α (C=0,4 0,02; L=0,6 0,05; P≤0,03) e aromatase (C=0,4 0,03; L=0,5 0,02; P≤0,04) aumentaram, enquanto que a expressão proteica de AR (C=0,16 0,01; L=0,09 0,01; P≤0,009) foi reduzida pela administração de leptina. A análise morfométrica mostrou que a leptina levou a um aumento da área total do túbulo seminífero (C=64,6 3,1; L=56,1 2,1;μm, P≤0,01), aumento da área luminal (C=40,6 2,3; L= 48,7 0,9; μm P≤ 0,004) e na altura do epitélio (C=21,5 1,2; L=24,6 1,1; μm, P≤0,03), enquanto que o comprimento do túbulo seminífero foi reduzido no grupo tratado (C=2200 350; L= 1100 110;cm, P≤0,006). A administração de leptina levou a um aumento no número total de espermatozoides (C=20x107 2x107; L=30x107 5x107;Cls/mL, P≤0,009) e no número de anormalidades (C=40,6 1,9; L=45,8 1,2, P≤0,049). Podemos concluir que a leptina tem um papel importante na morfologia e função testicular. A leptina parece ter efeito direto neste tecido uma vez que a expressão gênica e proteica de OBR, AR, ER e aromatase foram alterados pela administração da leptina.

Efeitos tardios no tecido ovariano de ratas Wistar após tratamento com Docetaxel e Ciclofosfamida

O câncer de mama (CM) é o segundo tipo de câncer mais comum no mundo. Sabe-se que a maior incidência de CM ocorre nas mulheres pós-menopausa, entretanto é crescente o número de mulheres jovens acometidas por esta doença. O tratamento do CM pode incluir: quimioterapia, radioterapia e/ou hormonioterapia. A quimioterapia, por se ser um tratamento sistêmico, pode causar importantes efeitos colaterais, entre eles a falência ovariana induzida por quimioterapia (FOIQ). As principais consequências da FOIQ são a infertilidade, além de complicações tardias relacionadas à diminuição do estrogênio, como a osteoporose e doenças cardiovasculares. O regime quimioterápico TC, adota a associação do docetaxel com a ciclofosfamida, como uma opção por fármacos que resultem numa taxa de sobrevida livre do câncer, e menores efeitos colaterais. Este trabalho teve como objetivo estudar os efeitos tardios no ovário causados pelo tratamento com a associação dos quimioterápicos docetaxel e ciclofosfamida (TC), em modelo animal com ratos Wistar. Para verificar o sinergismo desses quimioterápicos e assim analisar o efeito da administração conjunta, ratos Wistar fêmeas foram divididos em dois grupos: um grupo controle e um grupo que recebeu quimioterapia (TC). Os animais foram submetidos a eutanasia cinco meses após o fim do tratamento, e foram recolhidos o plasma e os ovários. Foram observadas alterações importantes. O nível de estradiol no plasma foi significativamente reduzido no grupo de TC em comparação com o grupo controle. Além disso, o número de núcleos apoptóticos foi maior no grupo TC. O papel da resposta inflamatória no desenvolvimento da lesão ovariana foi também investigado, e notou-se um aumento do número de mastócitos, e aumento da expressão de Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) no grupo TC. O envolvimento de fibrose nesse processo, foi também investigado. Os resultados mostraram que níveis de expressão de Fator de Crescimento Tumoral-β1 (TGF-β1), Colágeno Tipo I (Col-I) e Colágeno Tipo III (Col-III) estavam maiores no grupo TC em comparação com o grupo de controle. A análise ultraestrutural revelou a presença de feixes de colágeno no grupo tratado, e mostrou que a arquitetura do tecido do ovário estava mais desorganizada neste grupo comparado ao grupo controle. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a combinação de ciclofosfamida e docetaxel, um recente regime quimioterápico proposto para o tratamento do CM, pode levar a importantes alterações no ovário. O processo inflamatório, desencadeado pela administração dos quimioterápicos, estimula a apoptose e liberação de TGF-β no estroma ovariano, que induz a produção de matriz extracelular e subsequente, substituição do tecido sadio por tecido fibrótico. A principal consequência deste processo é a diminuição, ou perda, da função ovariana, levando à menopausa precoce e possível infertilidade. É importante compreender os mecanismos envolvidos na infertilidade provocada pelo regime TC, a fim de estudar novos métodos que evitem este efeito indesejável em mulheres submetidas a tratamento do CM.