In vitro characterization of human AML-reactive CTL clones generated from the naive subset of healthy donors and adoptive transfer into leukemia-engrafted NSG mice

Acute myeloid leukemia (AML) is a very aggressive cancer of the hematopoietic system. Chemotherapy and immunotherapeutical approaches including hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) are the only curative options available. The beneficial graft-versus-leukemia (GVL) effect of cellular immunotherapy is mostly mediated by donor-derived CD8+ T lymphocytes that recognize minor histocompatibility antigens (mHags) and leukemia-associated antigens (LAAs) presented on the surface of AML blasts (Falkenburg et al. 2008; Kolb 2008). A main complication is graft-versus-host disease (GVHD) that can be induced when cytotoxic T lymphocytes (CTLs) recognize broadly expressed antigens. To reduce the risk of GVHD, specific allogeneic T-cell therapy inducing selective GVL responses could be an option (Barrett & Le Blanc 2010; Parmar et al. 2011; Smits et al. 2011). This requires efficient in vitro strategies to generate AML-reactive T cells with an early differentiation phenotype as well as vigorous effector functions and humanized mouse models to analyze the anti-leukemic potential of adoptively transferred T cells in vivo. In this study, AML-reactive CTL clones and oligoclonal T-cell lines could be reliably generated from the naive subset of healthy HLA-class I-identical donors by stimulation with primary AML blasts in mini-mixed-lymphocyte / leukemia cultures (MLLCs) in eight different patient / donor pairs. These CTLs were promising candidates for cellular immunotherapy because of their relatively early differentiation phenotype and strong proliferative and lytic capabilities. The addition of the common γ-chain cytokine IL-21 to the stimulation protocol enabled more precursors to develop into potent leukemia-reactive CTLs, presumably by its beneficial effects on cell survival and antigen-specific proliferation during the first weeks of cultures. It also strengthened the early-stage phenotype. Three long-term cultured CTLs exemplarily transferred into leukemia-engrafted immunodeficient NSG mice mediated a significant reduction of the leukemic burden after a single transfusion. These results demonstrate that CTL clones with reactivity to patient-derived AML blasts can be isolated from the naive compartment of healthy donors and show potent anti-leukemic effects in vivo. The herein described allo-MLLC approach with in vitro “programmed” naive CTL precursors independent of a HSCT setting is a valuable alternative to the conventional method of isolating in vivo primed donor CTLs out of patients after transplantation (Kloosterboer et al. 2004; Warren et al. 2010). This would make leukemia-reactive CTLs already available at the time point of HSCT, when residual leukemia disease is minimal and the chances for complete leukemia eradication are high. Furthermore, leukemia-reactive CTLs effectively expanded by this in vitro protocol can be used as screening populations to identify novel candidate LAAs and mHags for antigen-specific immunotherapy.

Funktionelle Analyse der Plasmamembran-Ca 2+-ATPase 2 -PMCA2- in Modellen der Neurodegeneration

Calcium (Ca2+) ist ein ubiquitär vorkommendes Signalmolekül, das an der Regulation zahlreicher zellulärer Prozesse, von der Proliferation bis zum programmierten Zelltod, beteiligt ist. Daher müssen die intrazellulären Ca2+-Spiegel streng kontrolliert werden. Veränderungen der Ca2+-Homöostase während der altersassoziierten Neurodegeneration können dazu beitragen, dass Neuronen vulnerabler sind. So wurden erhöhte Ca2+-Konzentrationen in gealterten Neuronen, begleitet von einer erhöhten Vulnerabilität, beobachtet (Hajieva et al., 2009a). Weiterhin wird angenommen, dass der selektive Untergang von dopaminergen Neuronen bei der Parkinson Erkrankung auf eine erhöhte Ca2+-Last zurückzuführen sein könnte, da diese Neuronen einem ständigen Ca2+-Influx,rnaufgrund einer besonderen Isoform (CaV 1.3) spannungsgesteuerter Ca2+-Kanäle des L-Typs, ausgesetzt sind (Chan et al., 2007). Bislang wurden die molekularen Mechanismen, die einem Ca2+-Anstieg zu Grunde liegen und dessen Auswirkung jedoch nicht vollständig aufgeklärt und daher in der vorliegenden Arbeit untersucht. Um Veränderungen der Ca2+-Homöostase während der altersassoziiertenrnNeurodegeneration zu analysieren wurden primäre Mittelhirnzellen aus Rattenembryonen und SH-SY5Y-Neuroblastomazellen mit dem Neurotoxin 1-Methyl-4-Phenyl-Pyridin (MPP+), das bei der Etablierung von Modellen der Parkinson-Erkrankung breite Anwendung findet, behandelt. Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration wurden mit einem auf dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-basierten Ca2+-Indikator,rn„Cameleon cpYC 3.6“ (Nagai et al., 2004), ermittelt. Dabei wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass MPP+ die Abregulation der neuronenspezifischen ATP-abhängigen Ca2+-Pumpe der Plasmamembran (PMCA2) induziert, die mit der Ca2+-ATPase des endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und dem Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) das zelluläre Ca2+-Effluxsystem bildet, was zu einer erhöhten zytosolischen Ca2+-Konzentration führt. Die PMCA2-Abnahme wurde sowohl auf Transkriptionsebene als auch auf Proteinebene demonstriert, während keine signifikanten Veränderungen der SERCA- und NCX-Proteinmengen festgestellt wurden. Als Ursache der Reduktion der PMCA2-Expression wurde eine Abnahme des Transkriptionsfaktors Phospho-CREB ermittelt, dessen Phosphorylierungsstatus abhängig von der Proteinkinase A (PKA) war. Dieser Mechanismus wurde einerseits unter MPP+-Einfluss und andererseits vermittelt durch endogene molekulare Modulatoren gezeigt. Interessanterweise konnten die durch MPP+ induzierte PMCA2-Abregulation und der zytosolische Ca2+-Anstieg durch die Aktivierung der PKA verhindert werden. Parallel dazu wurde eine MPP+-abhängige verringerte mitochondriale Ca2+-Konzentration nachgewiesen, welche mit einer Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials korrelierte. Darüber hinaus kam es als Folge der PMCA2-Abnahme zu einem verminderten neuronalen Überleben.rnVeränderungen der Ca2+-Homöostase wurden auch während der normalen Alterung inrnprimären Fibroblasten und bei Mäusen nachgewiesen. Dabei wurden verringerte PMCA und SERCA-Proteinmengen in gealterten Fibroblasten, einhergehend mit einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration demonstriert. Weiterhin wurden verringerte PMCA2-Proteinmengen im Mittelhirn von gealterten Mäusen (C57B/6) detektiert.rnDer zelluläre Ca2+-Efflux ist somit sowohl im Zuge der physiologischen Alterung als auch in einem altersbezogenen Krankheitsmodell beeinträchtigt, was das neuronale Überleben beeinflussen kann. In zukünftige Studien soll aufgeklärt werden, welche Auswirkungen einer PMCA2-Reduktion genau zu dem Verlust von Neuronen führen bzw. ob durch eine PMCA2-Überexpression neurodegenerative Prozesse verhindert werden können.

Bringing results to fruition through publication: An analysis of a peer-reviewed, open access and context-focused journal's editorial practice

When it comes to helping to shape sustainable development, research is most useful when it bridges the science–implementation/management gap and when it brings development specialists and researchers into a dialogue (Hurni et al. 2004); can a peer-reviewed journal contribute to this aim? In the classical system for validation and dissemination of scientific knowledge, journals focus on knowledge exchange within the academic community and do not specifically address a ‘life-world audience’. Within a North-South context, another knowledge divide is added: the peer review process excludes a large proportion of scientists from the South from participating in the production of scientific knowledge (Karlsson et al. 2007). Mountain Research and Development (MRD) is a journal whose mission is based on an editorial strategy to build the bridge between research and development and ensure that authors from the global South have access to knowledge production, ultimately with a view to supporting sustainable development in mountains. In doing so, MRD faces a number of challenges that we would like to discuss with the td-net community, after having presented our experience and strategy as editors of this journal. MRD was launched in 1981 by mountain researchers who wanted mountains to be included in the 1992 Rio process. In the late 1990s, MRD realized that the journal needed to go beyond addressing only the scientific community. It therefore launched a new section addressing a broader audience in 2000, with the aim of disseminating insights into, and recommendations for, the implementation of sustainable development in mountains. In 2006, we conducted a survey among MRD’s authors, reviewers, and readers (Wymann et al. 2007): respondents confirmed that MRD had succeeded in bridging the gap between research and development. But we realized that MRD could become an even more efficient tool for sustainability if development knowledge were validated: in 2009, we began submitting ‘development’ papers (‘transformation knowledge’) to external peer review of a kind different from the scientific-only peer review (for ‘systems knowledge’). At the same time, the journal became open access in order to increase the permeability between science and society, and ensure greater access for readers and authors in the South. We are currently rethinking our review process for development papers, with a view to creating more space for communication between science and society, and enhancing the co-production of knowledge (Roux 2008). Hopefully, these efforts will also contribute to the urgent debate on the ‘publication culture’ needed in transdisciplinary research (Kueffer et al. 2007).