Les Signaux Post Mortem (SPM) de l’apoptose endothéliale : des acteurs du remodelage vasculaire

L’immunosuppression a permis d’améliorer l’incidence du rejet aigu sans toutefois améliorer significativement le rejet chronique. Celui-ci est caractérisé par une vasculopathie du greffon (VG) similaire à une forme accélérée d’athérosclérose native accompagnée de fibrose. La pathophysiologie de la VG découle de l’hypothèse de réponse à l’insulte proposée par Russell Ross en 1977. Selon son postulat, l’endothélium stressé par des facteurs immunologiques et non immunologiques initie l’apoptose endothéliale suivi d’une réponse de réparation vasculaire via un épaississement myo-intimal aux sites d’insultes. Toutefois, lorsque les stress endothéliaux initiaux demeurent soutenus, l’apoptose endothéliale et la réponse de réparation perpétuent. Compte tenu que l’inhibition de l’apoptose endothéliale bloque le développement de la VG in vivo, notre hypothèse de travail reposait sur les répercussions paracrines de l’apoptose endothéliale sur les types cellulaires participant au remodelage vasculaire. Nous avons généré un système expérimental in vitro afin d’induire l’apoptose endothéliale en absence significative de nécrose cellulaire. À l’aide d’une approche protéomique multidimensionnelle et comparative, nous avons démontré que les cellules endothéliales apoptotiques exportent spécifiquement 27 signaux post mortem (SPM). Nous avons démontré que certains de ces SPM ont des propriétés anti-apoptotiques (TCTP et EGF), d’autre fibrogénique (CTGF), récapitulant ainsi certains phénotypes cellulaires associés au développement de la VG. Parmi les médiateurs identifiés, 16 n’avaient pas de signal de sécrétion, incluant TCTP, suggérant que des mécanismes de sécrétion non conventionnels soient favorisés durant l’apoptose. Nous avons démontré que la caspase-3 effectrice régule la voie de sécrétion non classique exosomiale associée à l’export extracellulaire de nanovésicules TCTP+VE, anti-apoptotiques et biochimiquement distinctes des corps apoptotiques. Finalement, l’ensemble des données protéomiques ont permis d’émettre l’hypothèse qu’en réponse à un stress apoptotique, la cellule exporte différents médiateurs (solubles et vésiculaires) de manière non conventionnelle nécessitant la fusion d’organelles de la voie endocytaire et autophagique avec la membrane plasmique. Ce mécanisme serait régulé durant la phase effectrice de l’apoptose permettant ainsi d’initier une réponse de réparation extracellulaire seulement lorsque le destin cellulaire a atteint un point de non retour. Ainsi, le testament protéique et nanovésiculaire légué durant l’apoptose endothéliale pourrait servir simultanément de biomarqueur de la VG et de cible thérapeutique afin de diminuer le remodelage vasculaire pathologique.

The role of transforming growth factor-beta 1 in steroidogenesis, cell proliferation, and apoptosis in cultured bovine granulosa cells

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Étude de l’expression de « Bcl-2 modifying factor » (Bmf) et son implication dans la néphropathie diabétique

Objectif : Étudier les mécanismes apoptotiques impliqués dans la néphropathie diabétique en identifiant les gènes responsables de l’apoptose et activés par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules de tubules proximaux rénaux (RPTC) de différents modèles diabétiques. Méthodes : Une hybridation par puce à AND a été réalisée sur les ARN extraits à partir de RPTC de souris heterozygotes db/m+, db/db and db/db catalase (CAT)-transgénique (Tg) de 20 semaines. Des expériences de PCR en temps réel et d’immunohistochimie réalisées sur ces modèles et sur le modèle ou le diabète avait été induit par traitement au streptozotocin (STZ) ont permis de valider les gènes apoptotiques identifiés par puce à ADN. Des RPTC immortalisées de rat ont été utilisées pour montrer l’activité de ces gènes apoptotique et la régulation de leur expression. De plus, une étude additionnelle réalisée sur des sections rénales provenant de patients diabétiques et non diabétiques a démontré également une surexpression de ces gènes apoptotiques dans les IRPTC. Résultats: L’expression de Bcl-2-modifying factor (Bmf), une protéine apoptotique, semble augmentée dans les RPTC de souris db/db comparé aux souris contrôles db/m+, ou aux souris db/db CAT-tg. La surexpression de Bmf a également été identifiée dans les RPTC du modèle diabétique STZ. La normalisation de l’hyperglycémie chez ces souris par traitement à l’insuline semble normaliser également l’expression de Bmf. In vitro, la surexpression du cDNA de Bmf dans les RPTC promouvoit l’apoptose et augmente l’activité de caspase 3. La stimulation de RPTC de Rat avec le glucose élevé (25mM de D-glucose) semble augmenter l’expression de Bmf et le traitement de ces cellules avec la roténone, les Diphénylène iodonium, la catalase et l’apocynine semble renverser cette stimulation. L’inhibition de Bmf avec un siRNA semble réduire l’apoptose induite par le glucose élevé. L’expression de Bmf a également été démontrée dans les RPTC de patients diabétiques. Conclusion: Ces résultats ont démontré une surexpression de Bmf dans les RPTC de différents modèles diabétiques et suggèrent son potentiel rôle dans la régulation de l’apoptose et de l’atrophie tubulaire chez les diabétiques.

Studies on IL-18 in HIV infection : effects of the cytokine on intestinal integrity, and platelets as a new source of the cytokine

L'interleukine IL-18 (IL-18), un membre de la famille de l’IL-1, est une cytokine pro-inflammatoire multifonctionnelle. Elle est produite par les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules épithéliales, les kératinocytes et le cortex surrénal dans le corps humain. Cette cytokine est d'abord produite comme une protéine précurseure inactive, qui est par la suite clivée en une forme mature par la caspase-1 activée. La caspase, en elle-même, existe comme précurseur inactif dans les cellules humaines et requiert l'assemblage d'inflammasomes pour son activation. L'IL-18 pour joue un rôle clé dans la médiation des conditions inflammatoires. Notre laboratoire et d'autres ont montré que l'infection par le VIH est accompagnée d'une augmentation des taux circulants d'IL-18 avec une diminution des niveaux de son antagoniste, l'interleukine-18 binding protein (IL-18BP). Dans cette thèse, nous démontrons pour que l'IL-18 est également produite et sécrétée par les plaquettes humaines lors de leur activation. Les plaquettes contiennent des composants de l'inflammasome. Ils assemblent et activent la caspase-1, qui ensuite traite le précurseur de l'IL-18 dans sa forme mature au cours du processus d'activation des plaquettes. La cytokine est synthétisée de novo lors de l'activation des plaquettes. Contrairement à l'IL-18, les plaquettes expriment constitutivement l’IL-18BP, et la libèrent de manière constitutive, ainsi que lors de l'activation. L'IL-18 et l'IL-18BP sont colocalisés avec CD63, un marqueur pour les granules α des plaquettes. L'IL-18 libéré des plaquettes constitue la source principale de cette cytokine dans la circulation humaine chez les individus sains. Nous avons identifié des concentrations faibles de cette cytokine dans les lysats de plaquettes chez les individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. D'autre part, les concentrations ont été augmentées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes chez les individus infectés. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'IL-18BP dans les lysats de plaquettes d'individus sains et infectés par le VIH. Cependant, des quantités plus faibles de cet antagoniste ont été trouvées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes d'individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. Nos résultats ont des implications importantes pour les maladies inflammatoires chroniques dans laquelle une activité accrue de l'IL-18 joue un rôle pathogène. Le VIH est également accompagné par une inflammation intestinale et une diminution de l'intégrité intestinale, mesurée par la réparation de la muqueuse, la régénération et la perméabilité. Cependant, on en sait peu sur la relation entre le niveau élevé de l'IL-18 associé à l'infection au VIH et la perméabilité intestinale: ceci n'a jamais été étudié. Dans cette thèse, nous démontrons le rôle du virus et sa protéine Tat à augmenter la production d'IL-18 chez deux lignées de cellules épithéliales intestinales (HT29 et Caco2) ainsi qu'une diminution de l'IL-18BP. L'IL-18 induit une hyperperméabilité de la barrière épithéliale en perturbant à la fois les jonctions serrées et adhérentes, et ce, en modulant l'expression et la distribution de l'occludine, de claudine-2 et de la bêta-caténine. Une désorganisation de l'actine F a également été observée dans les cellules lors de l'incubation avec l'IL-18. Les mêmes observations ont été faites avec la protéine Tat du VIH-1. Après une incubation prolongée, l'IL-18 a causé la mort des cellules intestinales et induit l'apoptose par l'activation de la caspase-1 et la caspase-3. Fait intéressant, les taux plasmatiques de lipopolysaccharides chez trois catégories différentes de patients au VIH (ART-naïf, ART-traitée et contrôleurs élite) sont en corrélation avec les niveaux plasmatiques de l'IL-18. Enfin, nous avons étudié la voie de signalisation à travers laquelle l'IL-18 induit une perméabilité intestinale accrue. En bref, nos études identifient les plaquettes comme une source importante d'IL-18, et leur activation lors d'une infection à VIH contribue à des concentrations accrues de cette cytokine. Le virus entraine également l'augmentation de la production de cytokines par les cellules épithéliales intestinales. L'activité biologique accrue de ces cytokines contribue à la pathogenèse du sida en augmentant la perméabilité intestinale et en causant la mort des cellules intestinales. L'IL-18 pourrait servir de cible moléculaire pour retarder la progression du sida et réduire l'inflammation chronique dans un stade précoce d'une infection à VIH.

Évaluation de l’ototoxicité secondaire au bleu de méthylène chez le cochon d’Inde : étude animale prospective

INTRODUCTION: Le bleu de méthylène est un colorant grandement utilisé dans le domaine médical, notamment pour ses propriétés de coloration histologique. Il est également utilisé comme agent photosensibilisant dans la thérapie photodynamique antimicrobienne, qui une fois photoactivé devient efficace pour l’éradication de plusieurs germes multirésistants. L’objectif de cette étude est d’investiguer le potentiel ototoxique du bleu de méthylène. MÉTHODES: Vingt cochons d’Inde divisés en deux groupes, ont reçu une solution de bleu de méthylène et de gentamicine dans l’oreille testée. L’oreille controlatérale a reçu une solution saline contrôle. Nous avons procédés à des potentiels évoqués auditifs du tronc cérébral avant et une semaine suivant la série d’injections. À la suite des dissections, des analyses histologiques et immunohistochimiques ont été réalisées. RÉSULTATS: La différence moyenne de perte auditive dans le groupe gentamicine comparativement au groupe normal salin était de 66.25 dB (p<0.001). Toutefois, la différence moyenne de perte auditive dans le groupe ayant reçu du bleu de méthylène comparativement à celui ayant reçu des injections de la solution saline était de 1.50 dB, et n’a pas été démontré comme étant statistiquement significative (p=0.688). De plus, la captation de caspase-3 en immunohistochimie (marqueur d’apoptose) n’a pas été significative dans le groupe recevant le bleu de méthylène. CONCLUSION: À la lumière de nos résultats, les injections intratympaniques de bleu de méthylène n’ont pas démontrées de potentiel ototoxique. Nous recommandons des études supplémentaires afin d’en préciser son utilisation sécuritaire dans le domaine otologique.

Impact de l'hypotension chez le rat avec encéphalopathie hépatique due à la maladie de foie chronique : implication pour les complications neurologiques suivant la transplantation hépatique

L’encéphalopathie hépatique (EH) est une complication neuropsychiatrique de la maladie de foie telle que la cirrhose, caractérisée par des dysfonctions cognitives et motrices. Le seul traitement curatif est la transplantation hépatique (TH). Historiquement, l’EH est considérée comme un désordre métabolique réversible et il est attendu qu’il soit résolu suivant la TH. Cependant, il a été démontré que des complications neurologiques persistent chez 47% des patients transplantés. La TH est une opération chirurgicale complexe accompagnée de stress péri-opératoire telle que la perte sanguine et l’hypotension. L’hypothèse de ce projet d’étude est que l’EH minimale (EHm) rend le cerveau plus susceptible à une perte neuronale suite à une insulte hypotensive. Nous avons donc caractérisé un modèle d’hypotension chez des rats cirrhotiques avec ligation de la voie biliaire (BDL) dans lequel une hypovolémie de l’artère fémorale a été faite. Avec ce modèle, nous avons étudié l’impact de différentes pressions sanguines de 120 minutes sur le compte neuronal. Nos résultats démontrent que les BDL hypotendus à une pression artérielle moyenne de 60 mmHg et 30 mmHg ont une diminution du compte neuronal et que les neurones mourraient par apoptose (observée par la présence de caspase-3 clivée). Nous avons également déterminé que le flot sanguin cérébral était altéré chez les rats cirrhotiques BDL. Le second objectif était d’évaluer si le traitement de l’EHm par l’ornithine phénylacétate (OP) permettait d’éviter la perte neuronale chez les BDL hypotendus. Nos résultats ont démontrés que l’OP permettait de partiellement rétablir les fonctions cognitives chez les rats BDL. De plus, les rats BDL traités avec l’OP peuvent éviter la mort neuronale. Cependant, le processus apoptotique est toujours enclenché. Ce résultat suggère la possibilité de mort cellulaire retardée par l’OP. Ces résultats suggèrent que les patients cirrhotiques avec EHm sont plus susceptibles à une mort neuronale induite par hypotension. La combinaison de l’EHm et l’hypotension permet d’expliquer les complications neurologiques rencontrées chez certains patients. Le diagnostic et le traitement de ce syndrome doit donc être fait chez les patients cirrhotiques pour éviter ces complications post-TH.

Rôle du microenvironnement apoptotique tissulaire et du MFG-E8 dans la modulation de la réponse inflammatoire

L’inflammation fait partie des processus réactionnels de défense dont dispose l’organisme en réponse aux agressions, assurant l’intégrité de l’hôte. En réponse au dommage tissulaire, plusieurs médiateurs inflammatoires interviennent dans le processus de l’inflammation. Lors de ces dommages, des signaux de dangers provenant de cellules endommagées sont relâchés dans l’environnement tissulaire, pouvant causer des dommages cellulaires et tissulaires. Les macrophages, tout comme d’autres cellules, peuvent être activés par ces signaux de danger, menant à la sécrétion de molécules telles que des cytokines et des chimiokines pouvant modifier le microenvironnement tissulaire. Les insultes au tissu sain peuvent entrainer la mort cellulaire telle que l’apoptose. Les molécules pouvant être relâchées lors de celle-ci contribuent au microenvironnement, notamment de par l’influence de celles-ci sur le macrophage. Parmi ces médiateurs, nous avons identifié le Milk Fat Globule-Epidermal growth factor 8 (MFG-E8), un acteur important dans la résolution de l’inflammation, comme étant relâché spécifiquement par les cellules apoptotiques. Nous avons émis l’hypothèse que le microenvironnement apoptotique tissulaire, via la relâche de MFG-E8, module le phénotype du macrophage, modifiant le microenvironnement, la réponse inflammatoire ainsi que le devenir de l’insulte tissulaire. Nos objectifs sont 1) de caractériser ce microenvironnement apoptotique tissulaire et la cinétique de relâche du MFG-E8 par les cellules apoptotiques, 2) d’en évaluer son rôle dans la modulation du phénotype du macrophage ainsi que 3) d’en étudier, in vivo, son influence sur l’environnement inflammatoire et le devenir tissulaire. Dans le premier article présenté, nous avons démontré que les cellules endothéliales apoptotiques relâchent le MFG-E8 de façon Caspase-3 dépendante. La stimulation des macrophages par l’environnement conditionné par les cellules endothéliales apoptotiques mène à l’adoption d’un profil macrophagien davantage anti-inflammatoire et moindrement pro-inflammatoire. Ce phénotype est réduit par l’inhibition de la Caspase-3 et il dépend de la présence de MFG-E8. De plus, le potentiel du MFG-E8 à la reprogrammation du macrophage pro-inflammatoire a été démontré via un modèle expérimental de péritonite. Ce changement phénotypique médié par MFG-E8 implique une signalisation STAT3. Ayant démontré que les cellules épithéliales apoptotiques, à l’instar des cellules endothéliales apoptotiques, relâchent elles aussi de façon apoptose-dépendante le MFG-E8, nous avons étudié plus exhaustivement un modèle in vivo riche en apoptose épithéliale, l’obstruction urétérale unilatérale. Dans ce deuxième article présenté, nous rapportons l’implication bénéfique de MFG-E8 dans ce modèle de pathologie rénale obstructive. Nous avons constaté que la présence ou l’administration de MFG-E8 réduit le dommage tissulaire et la fibrose. La protection conférée par MFG-E8 est médiée via la modulation de l’activation de l’inflammasome. De plus, nos résultats illustrent l’importance du phénotype anti-inflammatoire du macrophage médié par le MFG-E8 dans la régulation négative de l’activation de l’inflammasome rénal et du dommage tissulaire. Cette thèse présente la première description de la relâche Caspase-3-dépendante de MFG-E8 par les cellules apoptotiques. Elle démontre également l’importance du MFG-E8 dans le microenvironnement apoptotique inflammatoire dans l’atténuation du phénotype pro-inflammatoire du macrophage. De plus, nous avons démontré son rôle protecteur dans des modèles in vivo de transplantation aortique et de réparation tissulaire, de même que dans un modèle de maladie rénale chronique où nous avons montré que cette protection conférée par MFG-E8 est médiée par la régulation négative de l’inflammasome tissulaire. Nos résultats suggèrent ainsi que le MFG-E8 pourrait être considéré comme un interrupteur inflammatoire et ainsi comme une cible potentielle dans la modulation de maladies inflammatoires.

Effet des acides gras polyinsaturés EPA et DHA dans un modèle d’infarctus du myocarde

Plusieurs études montrent que les acides gras (AG) oméga-3 sont bénéfiques pour la santé cardiovasculaire. Une étude antérieure dans notre laboratoire a montré que l’administration des acides gras oméga-3 réduit la taille de l'infarctus du myocarde (IM). Cependant, la question demeure de savoir si les deux principaux acides gras oméga-3 à longue chaîne, l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et l'acide docosahexaénoïque (DHA) possèdent la même efficacité à réduire la taille de l'infarctus. Le but de ce projet sera de déterminer l’efficacité relative de chacun de ces acides gras oméga-3 à protéger le cœur dans un modèle d’ischémie/reperfusion et d’étudier certaines voies de cardioprotection. Des rats mâles adultes Sprague-Dawley ont été nourris pendant 14 jours avec une diète comprenant l'un: 1- aucun AG oméga-3; 2- 5 g d'EPA / kg de nourriture; 3- 5 g de DHA / kg de nourriture; 4- 2,5 g de chaque oméga-3 AG / kg de nourriture; 5- 5 g chaque AG oméga-3 / kg de nourriture. Par la suite, les animaux ont été soumis à une ischémie pendant 40 minutes, causée par l'occlusion de l'artère coronaire gauche descendante. Au bout de 24 heures de reperfusion, la taille de l'infarctus est déterminée. Dans un sous-groupe d'animaux, l'activité d’Akt et des caspase-3 sont mesurées dans la région ischémique après 30 minutes de reperfusion. Finalement, à 15 minutes de reperfusion, l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale mPTP est déterminée dans un autre sous-groupe. Les résultats indiquent que les diètes EPA ou DHA réduisent de manière significative la taille de l'infarctus par rapport à la diète sans AG oméga-3, tandis que la combinaison de deux acides gras oméga-3 n'a pas montré de diminution de la taille de l'infarctus. L'activité de la caspase-3 est réduite pour le groupe DHA puis, l'activité d'Akt est augmentée avec les diètes EPA et DHA seules. Finalement, en présence d’une diète enrichie uniquement de DHA, l'ouverture des mPTP est retardée comparativement aux autres diètes.

Adrenergic and muscarinic receptor subtypes functional regulation during diabetogenesis: Effect of curcumin and vitamin D3 pre-treatment

In the present study, the initial phase was directed to confirm the effects of curcumin and vitamin D3 in preventing or delaying diabetes onset by studying the blood glucose and insulin levels in the pre-treated and diabetic groups. Behavioural studies were conducted to evaluate the cognitive and motor function in experimental rats. The major focus of the study was to understand the cellular and neuronal mechanisms that ensure the prophylactic capability of curcumin and vitamin D3. To elucidate the mechanisms involved in conferring the antidiabetogenesis effect, we examined the DNA and protein profiles using radioactive incorporation studies for DNA synthesis, DNA methylation and protein synthesis. Furthermore the gene expression studies of Akt-1, Pax, Pdx-1, Neuro D1, insulin like growth factor-1 and NF-κB were done to monitor pancreatic beta cell proliferation and differentiation. The antioxidant and antiapoptotic actions of curcumin and vitamin D3 were examined by studying the expression of antioxidant enzymes - SOD and GPx, and apoptotic mediators like Bax, caspase 3, caspase 8 and TNF-α. In order to understand the signalling pathways involved in curcumin and vitamin D3 action, the second messengers, cAMP, cGMP and IP3 were studied along with the expression of vitamin D receptor in the pancreas. The neuronal regulation of pancreatic beta cell maintenance, proliferation and insulin release was studied by assessing the adrenergic and muscarinic receptor functional regulation in the pancreas, brain stem, hippocampus and hypothalamus. The receptor number and binding affinity of total muscarinic, muscarinic M1, muscarinic M3, total adrenergic, α adrenergic and β adrenergic receptor subtypes were studied in pancreas, brain stem and hippocampus of experimental rats. The mRNA expression of muscarinic and adrenergic receptor subtypes were determined using Real Time PCR. Immunohistochemistry studies using confocal microscope were carried out to confirm receptor density and gene expression results. Cell signalling alterations in the pancreas and brain regions associated with diabetogenesis and antidiabetogenesis were assessed by examining the gene expression profiles of vitamin D receptor, CREB, phospholipase C, insulin receptor and GLUT. This study will establish the anti-diabetogenesis activity of curcumin and vitamin D3 pre-treatment and will attempt to understand the cellular, molecular and neuronal control mechanism in the onset of diabetes.Administration of MLD-STZ to curcumin and vitamin D3 pre-treated rats induced only an incidental prediabetic condition. Curcumin and vitamin D3 pretreated groups injected with MLD-STZ exhibited improved circulating insulin levels and behavioural responses when compared to MLD-STZ induced diabetic group. Activation of beta cell compensatory response induces an increase in pancreatic insulin output and beta cell mass expansion in the pre-treated group. Cell signalling proteins that regulate pancreatic beta cell survival, insulin release, proliferation and differentiation showed a significant increase in curcumin and vitamin D3 pre-treated rats. Marked decline in α2 adrenergic receptor function in pancreas helps to relent sympathetic inhibition of insulin release. Neuronal stimulation of hyperglycemia induced beta cell compensatory response is mediated by escalated signalling through β adrenergic, muscarinic M1 and M3 receptors. Pre-treatment mediated functional regulation of adrenergic and cholinergic receptors, key cell signalling proteins and second messengers improves pancreatic glucose sensing, insulin gene expression, insulin secretion, cell survival and beta cell mass expansion in pancreas. Curcumin and vitamin D3 pre-treatment induced modulation of adrenergic and cholinergic signalling in brain stem, hippocampus and hypothalamus promotes insulin secretion, beta cell compensatory response, insulin sensitivity and energy balance to resist diabetogenesis. Pre-treatment improved second messenger levels and the gene expression of intracellular signalling molecules in brain stem, hippocampus and hypothalamus, to retain a functional neuronal response to hyperglycemia. Curcumin and vitamin D3 protect pancreas and brain regions from oxidative stress by their indigenous antioxidant properties and by their ability to stimulate cellular free radical defence system. The present study demonstrates the role of adrenergic and muscarinic receptor subtypes functional regulation in curcumin and vitamin D3 mediated anti-diabetogenesis. This will have immense clinical significance in developing effective strategies to delay or prevent the onset of diabetes.

The cytoprotective effect of alpha-tocopherol and daidzein against d-galactosamine-induced oxidative damage in the rat liver

We hypothesized that the hepatotoxicity that develops after the induction of oxidative stress (induced by d-galactosamine [GalN]) can be ameliorated by alpha-tocopherol (ATC) and the soy isoflavone daidzein. To test this, we ranked and assigned male Wistar rats into 6 groups, which involved pretreatment (ATC or daidzein) for 1 hour followed by treatment (GalN) for 23 hours. Histopathologic analysis showed that GalN administration induced marked necrosis (P < .001), steatosis (P < .001), both lobular and portal inflammations (P < .001), overall histopathologic score (P < .001), and activation of caspase-3 in the liver (P < .001). Immunohistochemical staining of malondialdehyde-protein adducts, a measure of oxidative stress, was increased in response to GalN (P < .001). Paradoxically, there were increases in total (P < .05) and cytosolic superoxide dismutase (P < .001) activities after GalN administration, indicative of an up-regulation of antioxidant defenses. The concentration of total protein (P < .001), albumin (P < .01), and globulin fractions (P < .001) in the plasma, as well as the activity of aspartate aminotransferase (P < .001), was significantly perturbed after GalN treatment, reflective of overall acute hepatic injury. Administration of daidzein showed a significant amelioration of the Ga1N-induced increase in malondialdehyde-protein adducts (P < .01) and cytosolic superoxide dismutase activities (P < .01) in the liver. However, all other variables were not significantly altered in response to daidzein. In response to ATC pretreatment, the total histopathologic score (P < .05), degree of necrosis (P < .05), and both lobular (P < .05) and portal (P = .05) inflammations were significantly ameliorated. To conclude, both daidzein and ATC protect the liver against oxidative damage possibly via different pathways.

Zinc-histidine complex protects cultured cortical neurons against oxidative stress-induced damage

The levels of zinc in the brain are directly affected by dietary zinc and deficiency has been associated with alcohol withdrawal seizures, excitotoxicity, impaired learning and memory and an accelerated rate of dysfunction in aged brain. Although zinc is essential for a healthy nervous system, high concentrations of zinc are neurotoxic, thus it is important to identify the most effective forms of zinc for treatment of conditions of the central nervous system. Accumulating evidence suggests that zinc-histidine complex (Zn(HiS)(2)) has greater biological potency and enhanced bioavailability compared with other zinc salts and also has antioxidant potential. Therefore, in this study we investigated the ability of zinc-histidine to protect cultured cortical neurons against hydrogen peroxide-induced damage. Pre-treating neurons for 18h with subtoxic concentrations of zinc-histidine (5-25 muM) improved neuronal viability and strongly inhibited hydrogen peroxide-induced (75 muM, 30 min) cell damage as assessed by MTT turnover and morphological analysis 24 It later. Low concentrations of zinc-histidine were more neuroprotective than zinc chloride. There was evidence of an anti-apoptotic mechanism of action as zinc-histidine inhibited hydrogen peroxide-induced caspase-3 activation and c-jun-N-terminal kinase phosphorylation. In summary, zinc supplementation with zinc-histidine protects cultured neurons against oxidative insults and inhibits apoptosis which suggests that zinc-histidine may be beneficial in the treatment of diseases of the CNS associated with zinc deficiency. (C) 2004 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

Activation of pro-survival Akt and ERK1/2 signalling pathways underlie the anti-apoptotic effects of flavanones in cortical neurons

There is growing interest in the potential beneficial effects of flavonoids in the aging and diseased brain. We have investigated the potential of the flavanone hesperetin and two of its metabolites, hesperetin-7-O-beta-D-glucuronide and 5-nitro-hesperetin, to inhibit oxidative stress-induced neuronal apoptosis. Exposure of cortical neurons to hydrogen peroxide led to the activation of apoptosis signal-regulating kinase 1 via its de-phosphorylation at Ser963, the phosphorylation of c-jun N-terminal kinase and c-Jun (Ser73) and the activation of caspase 3 and caspase 9. Whilst hesperetin glucuronide failed to exert protection, both hesperetin and 5-nitro-hesperetin were effective at preventing neuronal apoptosis via a mechanism involving the activation/phosphorylation of both Akt/protein kinase B and extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2). Protection against oxidative injury and the activation of Akt and ERK1/2 followed a bell-shaped response and was most apparent at 100 nmol/L concentrations. The activation of ERK1/2 and Akt by flavanones led to the inhibition of the pro-apoptotic proteins, apoptosis signal-regulating kinase 1, by phosphorylation at Ser83 and Bad, by phosphorylation at both Ser136 and Ser112 and to the inhibition of peroxide-induced caspase 9 and caspase 3 activation. Thus, flavanones may protect neurons against oxidative insults via the modulation of neuronal apoptotic machinery.

Pectin and pectic-oligosaccharides induce apoptosis in in vitro human colonic adenocarcinoma cells

Background: Dietary fibres have been associated with decreased risk of various cancers, although the mechanisms are unclear. Induction of apoptosis in tumour cells is thought to be an important protective mechanism against colorectal cancer. This work investigates the effects of pectins and pecticoligosaccharides (POS) on the human colonic adenocarcinoma cell line HT29. Materials and Methods: The anti-proliferative effects of pectin and POS were studied by testing the HT29 cells for cytotoxicity, differentiation and/or apoptosis by lactate dehydrogenase, alkaline phosphatase and caspase-3 activity assays. DNA agarose gel electrophoresis was also carried out. Results: A significant reduction in attached cell numbers was observed after three days incubation. This decrease was neither due to cells undergoing necrosis nor differentiation. Increased apoptosis frequency, after incubation with 1% (w/v) pectin andlor POS, was demonstrated by caspase-3 activity and DNA laddering on agarose gel electrophoresis. Conclusion: Dietary pectins and their degradation products may contribute to the reported protective effects of fruits against colon cancer.

The reaction of flavanols with nitrous acid protects against N-nitrosamine formation and leads to the formation of nitroso derivatives which inhibit cancer cell growth

Studies have suggested that diets rich in polyphenols Such as flavonoids may lead to a reduced risk of gastrointestinal cancers. We demonstrate the ability of monomeric and dimeric flavanols to scavenge reactive nitrogen species derived from nitrous acid. Both epicatechin and dimer B2 (epicatechin dimer) inhibited nitrous acid-induced formation of 3-nitrotyrosine and the formation of the carcinogenic N-nitrosamine, N-nitrosodimethylamine. The reaction of monomeric and dimeric epicatechin with nitrous acid led to the formation of mono- and di-nitroso flavanols, whereas the reaction with hesperetin resulted primarily in the formation of nitrated products. Although, epicatechin was transferred across the jejunum of the small intestine yielding metabolites, its nitroso form was not absorbed. Dimer B2 but not epicatechin monomer inhibited the proliferation of, and triggered apoptosis in, Caco-2 cells. The latter was accompanied by caspase-3 activation and reductions in Akt phosphorylation, suggesting activation of apoptosis via inhibition of prosurvival signaling. Furthermore, the dinitroso derivative of dimer B2, and to a lesser extent the dinitroso-epicatechin, also induced significant toxic effects in Caco-2 cells. The inhibitory effects on cellular proliferation were paralleled by early inhibition of ERK 1/2 phosphorylation and later reductions in cyclin D I levels, indicating modulation of cell cycle regulation in Caco-2 cells. These effects highlight multiple routes in which dietary derived flavanols may exert beneficial effects in the gastrointestinal tract. (c) 2005 Elsevier Inc. All rights reserved.

Role of quercetin and its in vivo metabolites in protecting H9c2 cells against oxidative stress

The aim of this study was to investigate the potential of quercetin and two of its "in vivo" metabolites, 3'-O-methyl quercetin and 4'-O-methyl quercetin, to protect H9c2 cardiomyoblasts against H2O2-induced oxidative stress. As limited data are available regarding the potential uptake and cellular effects of quercetin and its metabolites in cardiac cells, we have evaluated the cellular association/uptake of the three compounds and their involvement in the modulation of two pro-survival signalling pathways: ERK1/2 signalling cascade and PI3K/Akt pathway. The three flavonols associated with cells to differing extents. Quercetin and its two O-methylated metabolites were able to reduce intracellular ROS production but only quercetin was able to counteract H2O2 cell damage, as measured by MTT reduction assay, caspase-3 activity and DNA fragmentation assays. Furthermore, only quercetin was observed to modulate pro-survival signalling through ERK1/2 and PI3K/Akt pathway. In conclusion we have demonstrated that quercetin, but not its O-methylated metabolites, exerts protective effects against H2O2 cardiotoxicity and that the mechanism of its action involves the modulation of PI3K/Akt and ERK1/2 signalling pathways. (c) 2006 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.