Caracterização molecular de bastonetes Gram positivos irregulares e actinomicetos aeróbios obtidos de espécimes clínicos, de ensaios de esterilidade e de áreas limpas

Os bastonetes Gram positivos irregulares (BGPIs) compõem um grupo de espécies bacterianas com ampla diversidade fenotípica e que podem estar presente no meio ambiente, na microbiota humana e de animais. A identificação acurada de BGPIs em nível de gênero e espécie empregando métodos bioquímicos convencionais é bastante limitada, sendo recomendado, portanto, o uso de técnicas moleculares. No presente estudo, foram identificadas amostras de BGPIs oriundas de espécimes clínicos de humanos, de produtos farmacêuticos e de áreas limpas através da análise de sequencias do gene 16S rRNA e de outros genes conservados (housekeeping genes). Os resultados obtidos pelo sequenciamento dos genes 16S rRNA e rpoB demonstraram C. striatum multi-resistente (MDR) como responsável por surto epidêmico em ambiente hospitalar da cidade do Rio de Janeiro. Quinze cepas de C. striatum foram isoladas em cultura pura a partir de secreção traqueal de pacientes adultos submetidos a procedimentos de entubação endotraqueal. A análise por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) indicou a presença de quatro perfis moleculares, incluindo dois clones relacionados com cepas MDR (PFGE I e II). Os dados demonstram a predominância de PFGE I entre cepas MDR isoladas de unidades de terapia intensiva e enfermarias cirúrgicas. Uma potencial ligação causal entre a morte e a infecção por C. striatum MDR (PFGE tipos I e II) foi observada em cinco casos. Adicionalmente, acreditamos que este seja o primeiro estudo de identificação de espécies de Nocardia relacionadas com infecções humanas pela análise da sequencia multilocus (MLSA) no Brasil. Diferente dos dados observados na literatura (1970 a 2013) e obtidos pelos testes fenotípicos convencionais, a caracterização molecular de quatro lócus (gyrB-16S-secA1-hsp65) permitiu a identificação das espécies N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica e N. exalbida/gamkensis relacionadas com quadros de nocardiose em humanos. Cepas de N. nova isoladas de diferentes materiais clínicos de um único paciente apresentaram padrões de susceptibilidade antimicrobianos idênticos e dois perfis PFGE, indicando a possibilidade de quadros de co-infecção por N. nova em humanos. Em outra etapa da investigação, amostras de BGPIs obtidos de ambientes de salas limpas que não puderam ser identificadas por critérios convencionais foram submetidas a análise da sequência do gene 16S rRNA e caracterizadas 95,83% em nível de gênero e 35,42% em espécies. Para gêneros mais encontrados no estudo, foram analisados os genes rpoB e recA de dezessete cepas de Microbacterium e utilizado o MLSA para a identificação de sete cepas identificadas como Streptomyces. Os ensaios permitiram a identificação de três cepas de Microbacterium e de uma única amostra de Streptomyces ao nível de espécie. A análise da sequencia do gene rpoB também se mostrou eficaz na identificação de espécies de cepas de Corynebacterium. Finalmente, para as cepas ambientais pertencentes à classe Actinobacteria os dados morfológicos, bioquímicos e genotípicos permitiram documentar a cepa 3117BRRJ como representante de uma nova espécie do gênero Nocardioides, para o qual o nome Nocardioides brasiliensis sp. nov. e as cepas 3712BRRJ e 3371BRRJ como representante de um novo gênero e espécie para o qual o nome Guaraldella brasiliensis nov. foi proposto.

Bases moleculares da multiresistência a drogas em Mycobacterium tuberculosis

A tuberculose (Tb) é a principal causa de morte no mundo, por um agente infeccioso. O tratamento padrão é a quimioterapia: rifampicina (RMP), isoniazida (INH) e pirazinamida (PZA). O maior problema global da Tb é o aumento de cepas multirresistentes (resistência pelo menos à INH e à RMP) do Mycobacterium tuberculosis (MTb). A resistência à INH e RMP ocorre geralmente por mutação genética nos genes KatG e rpoB, respectivamente. Os objetivos deste trabalho foram: 1. Analisar os tipos e freqüências de mutações em duas regiões iniciais do gene katG do MTb. 2. Determinar os tipos e freqüências das mutações no gene rpoB. Duas regiões do gene katG e uma do gene rpoB foram amplificadas por PCR e seqüenciadas para o diagnóstico das mutações. Para a análise do gene katG foram utilizadas 101 cepas. Dentre estas, 4 eram sensíveis e não apresentaram mutação (controle). Das 97 cepas restantes, na primeira região seqüenciada do KatG, não ocorreram mutações em 67. Nas outras 30 cepas houve 33 deleções de nucleotídeos, sendo que 24 ocorreram no último nucleotídeo do códon 4 (24,7%), o que caracterizou um novo alelo. Na região 2, dentre as 97 cepas não houve mutação em 16 - sete estavam associadas a ausência de mutação na região 1. Ocorreram 83 mutações pontuais, sendo 75,3% no códon 315. Sete cepas resistentes a INH não apresentaram mutações em nenhuma das duas regiões analisadas. As mutações na região 2 permitiram o diagnóstico de resistência à INH em 79 cepas ou 81,4%. Nove cepas que não mostraram mutações na região 2 tiveram mutações na região 1. Logo, esta região permitiu o acréscimo do diagnóstico de resistência à INH para 88 cepas, aumentando a positividade em 9,3%. Em sete casos resistentes não houve mutação em ambas as regiões. Na análise do gene rpoB usamos 120 cepas de MTb. Nenhuma mutação foi encontrada em 13 isolados resistentes à RMP. O códon que apresentou maior freqüência de mutação foi o 531 (45.6%), seguido pelo 526 (26%) e 516 (12.5%). Em outros onze códons, foi encontrado um total de 18 mutações (15.2%), principalmente nos códons 511 (3.4%) e 513 (3.4%). Nenhum dos isolados sensíveis à RMP apresentou mutações. No Estado do Rio de Janeiro, as mutações mais freqüentes foram: 516 (5%), 526 (2.5 %) e 531 (21.2%). Dentre os outros estados, as mutações mais freqüentes foram: 516 (2.5 %), 526 (11%) e 531 (19.4%). A freqüência de mutações dos isolados do Rio de Janeiro foi comparada com a encontrada nos outros estados, mas quando o removemos da análise, a freqüência de mutações nos códons 531 e 526 para os outros 15 estados é semelhante. A análise estatística mostra que este dado é significativo (p=0.002). No entanto, quando todos os estados são analisados simultaneamente, o códon 531 é novamente o mais freqüentemente mutado. A análise do gene rpoB diagnosticou a resistência à rifampicina em 89,17% das cepas. Nossos resultados confirmam que, no Brasil, mutações na região RRDR do gene rpoB podem predizer resistência a RMP.

Filogeografia e evolução molecular de lagostas sapateiras (Scyllarides spp.) da América do Sul

Nos últimos anos, duas espécies de lagostas sapateiras, Scyllarides brasiliensis e S. deceptor, vêm se destacando nos desembarques pesqueiros de lagostas do Atlântico Sul Ocidental. Para espécies comercialmente importantes, o desenvolvimento de estudos que permitam conhecer a variabilidade e entender a dinâmica populacional é fundamental. Assim, o objetivo do primeiro capítulo desta tese foi avaliar a diversidade genética e a estrutura populacional dessas duas lagostas ao longo de aprox. 2.800 km da costa da América do Sul. Para as análises, foram empregados marcadores mitocondriais (citocromo oxidase I: COI; e a região controle: RC) e marcadores nucleares (13 loci de microssatélites desenvolvidos nesta tese). As duas espécies apresentaram altos níveis de variabilidade (S. deceptor: N = 200, mtDNA: h > 0,841, π > 0,005; microssatélites: He = 0,685; S. brasiliensis: N = 211, He = 0,554), distribuídos homogeneamente entre as localidades (S. deceptor: ΦST < -0,004, ΦCT < 0,016, FST global = 0,001, Dest global = 0,003, FCT < 0,002, P > 0,05, K = 1; S. brasiliensis: FST global = 0,004, Dest global = 0,001, FCT < 0,004, P > 0,05, K = 1). A ausência de estruturação nas duas espécies pode estar relacionada a características biológicas que promovem a conectividade entre localidades geograficamente distantes, como alta fecundidade e alto potencial de dispersão das larvas planctônicas. Além disso, os dados mitocondriais sugerem que a história demográfica de S. deceptor foi marcada por eventos de expansão populacionais e geográficos possivelmente relacionados às condições ambientais favoráveis dos episódios interglaciais do Pleistoceno Médio-Tardio. Diversos estudos têm mostrado que os fenômenos de inserção de regiões mitocondriais no DNA nuclear (NuMts) e heteroplasmia limitam a correta amplificação e identificação dos marcadores mitocondriais. Em estudos filogenéticos e de genética de populações, a presença inadvertida de sequências de diversas origens viola o principio de ortologia, o que pode resultar em inferências evolutivas erradas. Assim, o objetivo do segundo capítulo desta tese foi identificar e caracterizar os possíveis NuMts e sequências heteroplásmicas de três regiões mitocondriais (COI, RC e o gene da subunidade maior do RNA ribossomal: 16S) em quatro espécies do gênero Scyllarides (S. aequinoctialis, S. brasiliensis, S. deceptor e S. delfosi). A clonagem e sequenciamento de extratos de DNA genômico e DNA enriquecido com mtDNA revelaram que os genomas destas espécies podem exibir NuMts (que divergem entre 0,6 e 17,6% do mtDNA) e heteroplasmia (que divergem < 0,2% do mtDNA prevalente). Os NuMts surgiram possivelmente de vários eventos independentes de integração ao núcleo ao longo da história evolutiva do gênero Scyllarides. Dependendo do seu grau de similaridade com o mtDNA, a presença de NuMts nas análises filogenéticas no nível de gênero pode causar superestimativa do número de espécies e alterações nos comprimentos dos ramos e nas relações filogenéticas entre espécies.

Variabilidade genética em acessos e cultivares de quatro espécies de Brachiaria estimada por marcadores RAPD.

A importância do gênero Brachiaria para o desenvolvimento da pecuária nas regiões tropicais e subtropicais é notória. Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria ruziziensis e Brachiaria humidicola estão entre as principais espécies utilizadas como forrageiras e fazem parte do programa de melhoramento da Embrapa Gado de Corte. Neste trabalho, a técnica de Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) foi utilizada para estimar a variabilidade genética em 14 genótipos dessas quatro espécies, incluindo cultivares e acessos utilizados como genitores em cruzamentos inter e intra-específicos. Foram utilizados 47 primers que amplificaram 396 bandas, escoradas como "1" para presença e "0" para ausência, e uma matriz de similaridade genética foi construída usando o coeficiente de Jaccard. Os valores de similaridade genética variaram de 0,49 a 0,87, dos quais os acessos mais similares (C48 e B105) pertencem à mesma espécie, B. brizantha. As cultivares B. brizantha cv. Marandu e B. humidicola cv. BRS Tupi foram as mais divergentes. As análises de agrupamento obtidas pelos métodos Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average (UPGMA) e de Tocher foram similares, dividindo os acessos em quatro grupos que correspondem às espécies estudadas. O dendrograma obtido com o método UPGMA mostrou que B. brizantha, B. decumbens e B. ruziziensis são geneticamente mais próximas entre si do que B. humidicola. Além disso, este trabalho possibilitou a identificação de primers que podem ser utilizados com a finalidade de identificação precoce de híbridos quando esses genótipos forem utilizados como genitores.

Análise da diversidade genética em Stylosanthes guianensis utilizando marcadores RAPD.

O conhecimento da variabilidade genética e da relação entre diferentes acessos de Stylosanthes guianensis é importante para maximizar o uso dos recursos genéticos disponíveis. Este trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genética em 20 acessos dessa espécie, pertencentes ao banco de germoplasma da Embrapa Gado de Corte, usando marcadores RAPD (DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso). Foram selecionados 40 primers randômicos, que produziram um total de 210 bandas; destas, 82 polimórficas (39,05%). Os dados obtidos foram utilizados para gerar uma matriz de similaridade genética usando o coeficiente de Jaccard. A similaridade genética variou de 0,747 a 0,945, o que indicou uma variabilidade genética pouco acentuada entre os acessos estudados. Os acessos com menor similaridade genética foram SG01 e SG14. Os resultados das análises de agrupamento com os métodos UPGMA (Agrupamento com Média Aritmética Não Ponderada) e Tocher foram similares. Apesar da baixa variabilidade genética detectada entre os 20 acessos, estes foram separados em nove grupos distintos pelo método UPGMA e seis grupos pelo método de Tocher.

Estudo de modelagem molecular por homologia para análise genômica funcional. I - BIP (Binding Protein).

2005

Método molecular para estudos ecológicos de bactérias diazotróficas do gênero Paenibacillus em amostras ambientais.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver e testar um protocolo de PCR específico para a amplificação de espécies de bactérias fixadoras de nitrogênio do gênero Paenibacillus, utilizando-se a estratégia de clonagem e sequenciamento do gene nifH. .

Caracterização molecular de milho e sorgo para aplicação nos programas de melhoramento da Embrapa.

2009

Resultados de pesquisa da Embrapa Soja - 2000: ecofisiologia e biologia molecular.

Maximização do aproveitamento das disponibilidades climáticas pela soja; Bases agronômicas e fisiológicas das respostas da soja à disponibilidade hídrica (04.2000.331-01); Bases agronômicas e fisiológicas das respostas da soja às condições térmicas e fotoperiódicas (04.2000.331-02); Identificação, clonagem e sequenciamento de genes diferencialmente expressos em resposta às variações climáticas em soja (04.2000.331-03); Manejo dos recursos disponíveis do ambiente para produção de soja (04.2000.331-04); Estratégias para amenizar impactos decorrentes das adversidades climáticas (04.2000.331-05); Modelos de simulação do desenvolvimento da cultura da soja em resposta às variáveis do ambiente (04.2000.331-06); Genética aplicada ao melhoramento da soja; Identificação de marcadores moleculares ligados a genes de resistência a doenças (04.2000.322-01); Variabilidade genética de patógenos de soja (04.2000.322-02); Caracterização do germoplasma ativo de soja com marcadores moleculares tipo AFLP e micros-satélites (04.2000.322-03); Genética quantitativa aplicada ao melhoramento da soja: diversidade genética e resistência a doenças (04.2000.322-04); Desenvolvimento de soja transgênica com genes de interesse ao melhoramento (04.2000.322-05); Zoneamento agroclimático das principais culturas de grãos do Brasil; Caracterização da aptidão climática de regiões para o cultivo de soja no Brasil (01.2000.051-03).

Molecular dissociation of FHA-induced IL-10 and IL-12 secretion by human dendritic cells.

info:eu-repo/semantics/nonPublished

Manipulación de la senescencia de alfalfa (Medicago sativa L.) por ingeniería genética

En plantas forrajeras como la alfalfa, la senescencia foliar produce tanto una pérdida de la biomasa de forraje como una reducción de la calidad del mismo. Una estrategia molecular para retrasar la senescencia mediante la ingeniería genética se basa en la expresión de la secuencia codificante de la isopentenil transferasa (ipt), enzima clave en la biosíntesis de citoquininas. Para lograrlo resulta crítico la utilización de promotores con expresión no constitutiva que permitan la producción sitio-específica y autorregulada de citoquininas. La manipulación de la senescencia constituye un objetivo particularmente atractivo en especies forrajeras. Se transformaron clones de alfalfa con las construcción AtMYB32-ipt, se logró la regeneración de 3 plantas transgénicas, las cuales fueron confirmadas por PCR al amplificar el transgen ipt. La expresión del transgen se confirmó por RT-PCR y a través de la técnica de Southern blot se observó un patrón de inserción múltiple. También se estableció el patrón de expresión de la construcción AtMYB32-gus, la cual se limitó a los tejidos vasculares, con cierta variabilidad de expresión en la parte aérea las plantas. Los fenotipos observados en las plantas AtMYB32-ipt fueron desde plantas normales a plantas que perdieron la dominancia apical con raíces necrosadas en su mayoría. Se evaluó la senescencia foliar a través de bioensayos de hojas de plantas que incorporaron el transgen ipt y plantas que no lo incorporaron, se observó una senescencia foliar retrasada en plantas transgénicas, se cuantificó dicho retraso a través de los contenidos de clorofila a y b, proteínas foliares totales y cambios en el perfil de las proteínas foliares en geles SDS-PAGE (subunidad mayor de Rubisco). Se observó a los 35 días un mayor contenido de clorofila a y b, proteínas foliares y una mayor intensidad de las bandas de la subunidad mayor de Rubisco en las plantas que incorporaron el transgen ipt

Caracterización molecular y funcional de bacterias del género Azotobacter aisladas de suelos de la República Argentina : el rol de las auxinas en la respuesta a la inoculación de trigo

Conocer la diversidad genética de Azotobacter en suelos de Argentina es de gran interés científico-tecnológico debido a su uso actual y futuro en la agricultura. Por otra parte, los mecanismos de promoción del crecimiento vegetal de Azotobacter aún no han sido completamente elucidados. En este trabajo se llevó a cabo el aislamiento y la caracterización genotípica y fenotípica de cepas de Azotobacter. La especie más frecuentemente aislada fue A. chroococcum, mientras que reportamos por primera vez la presencia de A. salinestris y A. armeniacus en suelos argentinos. La producción de sideróforos, la solubilización de fosfatos y la producción de auxinas se evaluaron en 21 de los aislamientos obtenidos. Todas las cepas evaluadas produjeron sideróforos y auxinas, con diferencias entre ellas en la cantidad producida de auxinas, mientras que ninguna cepa solubilizó fosfatos. Se seleccionaron 6 cepas con valores contrastantes de producción de auxinas y se determinó su capacidad de producir ácido indol-3-acético (AIA), ácido giberélico (GA3) y zeatina (Z) por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, la capacidad de fijar N2 por la reducción de acetileno-etileno y la capacidad de promover la germinación y el crecimiento temprano de plántulas de trigo. Las 6 cepas seleccionadas produjeron distintos niveles de AIA, GA3 y Z y difirieron en la capacidad de fijar N2. La mayor producción de AIA correlacionó con un mayor desarrollo de raíces seminales y pelos radicales de las plantas inoculadas, y esas respuestas fueron reproducidas por la aplicación exógena de AIA. Además, se observaron efectos positivos de la inoculación sobre el crecimiento aéreo, los cuales no pudieron ser atribuidos a la producción de auxinas. Los resultados obtenidos demuestran que las fitohormonas producidas por Azotobacter jugarían un rol muy importante en la promoción temprana del crecimiento de las plántulas de trigo

Caracterización molecular y funcional de bacterias del género Azotobacter aisladas de suelos de la República Argentina : el rol de las auxinas en la respuesta a la inoculación de trigo

Conocer la diversidad genética de Azotobacter en suelos de Argentina es de gran interés científico-tecnológico debido a su uso actual y futuro en la agricultura. Por otra parte, los mecanismos de promoción del crecimiento vegetal de Azotobacter aún no han sido completamente elucidados. En este trabajo se llevó a cabo el aislamiento y la caracterización genotípica y fenotípica de cepas de Azotobacter. La especie más frecuentemente aislada fue A. chroococcum, mientras que reportamos por primera vez la presencia de A. salinestris y A. armeniacus en suelos argentinos. La producción de sideróforos, la solubilización de fosfatos y la producción de auxinas se evaluaron en 21 de los aislamientos obtenidos. Todas las cepas evaluadas produjeron sideróforos y auxinas, con diferencias entre ellas en la cantidad producida de auxinas, mientras que ninguna cepa solubilizó fosfatos. Se seleccionaron 6 cepas con valores contrastantes de producción de auxinas y se determinó su capacidad de producir ácido indol-3-acético (AIA), ácido giberélico (GA3)y zeatina (Z)por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, la capacidad de fijar N2 por la reducción de acetileno-etileno y la capacidad de promover la germinación y el crecimiento temprano de plántulas de trigo. Las 6 cepas seleccionadas produjeron distintos niveles de AIA, GA3 y Z y difirieron en la capacidad de fijar N2. La mayor producción de AIA correlacionó con un mayor desarrollo de raíces seminales y pelos radicales de las plantas inoculadas, y esas respuestas fueron reproducidas por la aplicación exógena de AIA. Además, se observaron efectos positivos de la inoculación sobre el crecimiento aéreo, los cuales no pudieron ser atribuidos a la producción de auxinas. Los resultados obtenidos demuestran que las fitohormonas producidas por Azotobacter jugarían un rol muy importante en la promoción temprana del crecimiento de las plántulas de trigo

Morphobiometric and molecular characterization of Bursaphelenchus Fuchs, 1937 (Nematoda: Aphelenchoididae) species associated with Pinus pinaster Ainton in Portugal

Abstract - The genus Bursaphelenchus comprises almost 100 species mainly from the northern hemisphere, with conifers as the most important hosts. Among the various nematode species, the pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is the casual agent of pine wilt disease (PWD), and the most important forest pest for pines worldwide, classified as an A1 quarantine organism within the European Union. In 1999 this nematode was detected for the first time in Portugal and Europa associated with maritime pine, Pinus pinaster. Following detection, a national program denominated "Programa Nacional de Luta contra o Nemátodo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) was created to, among other objectives, determine the distribution of the PWN and its associated vector(s) and host(s), and therefore intensive surveys covering the entire country were conducted with thousands of wood samples and suspected insects being analyzed. This thesis presents the listing, distribution, frequency and the insects associated with Bursaphelenchus species found associated with maritime pine in Portugal, identifying and characterizing the various species by morphological, biometrical and molecular biology (ITS-RFLP and rDNA sequencing analysis) techniques. To achieve the objectives, a total of 4813 maritime pine wood samples and 3294 insects from 22 species and six families were individually analyzed. A total of nine Bursaphelenchus species were found, namely: B. antoniae, B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae and B. xylophilus, all of them (with the exception of B. xylophilus) being new records for Portugal. Some of the species appear to have a widespread distribution, such as B. leoni, B. teratospicularis and B. tusciae while others were very rarely found and apparently have a localized distribution range within the country, namely B. antoniae and B. mucronatus. The majority of the species is characteristic of the Mediterranean region and can also be found in countries such as Spain, Italy and Greece, reflecting the affinity of our fauna with those locations. The association of B. hellenicus and B. tusciae with maritime pine is here reported for the first time. Six of the Bursaphelenchus species were also found associated with insects, mainly from the family Scolytidae (Coleoptera). Some of these interactions were described for the first time, namely: B. hellenicus with both Ips sexdentatus and Hylurgus ligniperda, B. sexdentati with both H. ligniperda and Orthotomicus erosus and B. tusciae with H. ligniperda. The exclusive association of B. xylophilus with the cerambycid Monochamus galloprovincialis was also confirmed. The nematode's dauer juveniles were usually found in low numbers in the insect vectors (ca 10-100 per insect), although for B. xylophilus a few thousand specimens per insect were sometimes found. The location of the dauer juveniles differed according to the species, although they were more common under the elytra and wings of the adult insects. A species new to science was detected and formally described as B. antoniae, associated with Hylobius sp. (Coleoptera; Curculionidae) beetles. Morphologically, this new species is very similar to B. hylobianum, although it's distinct ITS-RFLP molecular pattern (with only the enzyme Haelll producing comparable restriction bands) and the failure of hybridization supported the two species as distinct entities. Additional phylogenetic analysis of the 18S rDNA sequence further supported the taxonomical proximity of B. antoniae with B. hylobianum. Concerning the PWN, detailed studies on the development and morphology of B. xylophilus were conducted, and comparative measurements of field-collected and laboratory-maintained populations demonstrated that nematodes from the second group displayed larger size in all morphometric parameters, which could derive from more adequate conditions of nourishment and/or temperature. Taxonomical studies on the development stages of B. xylophilus confirmed the existence of four propagative juvenile stages (J1,J2,J3 and J4), an adult stage with both sexes and two dispersal stages (jIII e jIV), with the measurements of the gonad length allowing the separation of the propagative stages. It is hoped that the acquired knowledge will be useful on future surveys of nematodes of the Bursaphelenchus genus collected from either wood material or insect vectors, and facilitate the correct distinction and identification of the various species which are now known to occur. ### Resumo - 0 género Bursaphelenchus compreende quase 100 espécies, distribuídas sobretudo nos países do hemisfério norte do globo terrestre. Embora algumas espécies já tenham sido detectadas em plantas herbáceas, os hospedeiros vegetais mais comuns deste género são as coníferas, particularmente pinheiros. 0 nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus, é considerado a espécie mais importante deste género uma vez que é o agente causal da doença da murchidão dos pinheiros ("pine wilt disease"). Originário dos Estados Unidos, onde não causa grande impacte, o NMP foi introduzido em alguns países da Ásia (China, Japão, Coreia e Taiwan) e mais recentemente na Europa (Portugal). Nestas regiões é responsável pela destruição de milhares de hectares de coníferas, assumindo uma elevada importância económica. Em Portugal, depois da sua detecção em 1999, associado a Pinus pinaster, foi implementado um programa nacional "Programa Nacional de Luta contra o Nemátodo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) que permitiu determinar a área afectada pela praga (a sul do rio Tejo, península de Setúbal) bem como definir e implementar estratégias de controlo e prevenção da disseminação do NMP a outras zonas de Portugal. Recentemente, em Junho de 2008, foi confirmada a presença de B. xylophilus em outras regiões de Portugal levando as autoridades oficiais a definir todo o território continental como zona afectada e de restrição. As prospecções intensivas realizadas nos últimos anos incluíram a recolha e análise de milhares de amostras de madeira de pinheiro bem como de insectos associados ao pinheiro bravo conduzindo à identificação de várias espécies de Bursaphelenchus. Assim, os estudos conduzidos neste trabalho tiveram como objectivos efectuar uma caracterização morfológica, biométrica e molecular das espécies associadas a P. pinaster em Portugal bem como a sua distribuição geográfica e abundância. Os estudos biométricos foram realizados com populações extraídas directamente do meio natural. Foi ainda realizada uma pesquisa que permitiu identificar os insectos a que estão associadas essas espécies, os seus possíveis vectores. Foram analisadas no total 4813 amostras de P. pinaster e 3294 insectos (22 espécies pertencentes a seis famílias diferentes). Foram identificadas um total de nove espécies: B. antoniae n. sp., B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae e B. xylophilus. Foram realizados estudos morfológicos e biométricos de todas as espécies com excepção de B. mucronatus; o reduzido número de exemplares encontrados em apenas uma amostra foram utilizados para efectuar o diagnóstico molecular desta espécie (ITS-RFLP). Apesar de ter havido, sempre que possível, a confirmação molecular, na maioria dos casos a caracterização morfológica e biométrica permitiu a correcta identificação das espécies. Contudo, foi imprescindível a análise molecular em algumas amostras, nomeadamente para a identificação de B. xylophilus e B. sexdentati; dada a grande semelhança entre B. xylophilus e B. mucronatus e tendo sido encontradas algumas populações de B. xylophilus que possuíam fêmeas com cauda mucronada, foi necessária a realização da confirmação molecular. Com excepção de B. xylophilus, todas as outras espécies foram reportadas pela primeira vez em Portugal. Juntamente com B. xylophilus, B. pinasteri foi a espécie encontrada nas amostras de madeira de pinheiro com maior frequência. Algumas destas espécies como B. leoni, B. teratospicularis e B. tusciae foram reportadas em diferentes localidades do norte, centro e sul de Portugal, apresentando uma vasta distribuição geográfica; este resultado está em consonância com a forte associação destas espécies a climas mediterrânicos tal como acontece em Espanha, França, Itália e Grécia. Em oposição, espécies como B. antoniae e B. mucronatus foram encontradas apenas numa ocasião na região centro (Leiria) e norte (Figueira da Foz) do país, respectivamente. Bursaphelenchus mucronatus é igualmente pouco frequente em Espanha onde ocorre sobretudo na região norte, na Galiza. Esta espécie preferirá climas mais frios, ocorrendo com uma maior frequência nas regiões de latitude norte; esta análise é corroborada pela presença constante em países como Alemanha, Finlândia, França, Noruega, Rússia e Suécia. A nível mundial são descritas neste trabalho pela primeira vez as associações das espécies B. hellenicus e B. tusciae ao hospedeiro vegetal P. pinaster.

Molecular study of cell degeneration and evolution induced by mRNA mistranslation

As proteínas existentes nas células são produzidas pelo mecanismo de tradução do mRNA, no qual a informação genética contida nos genes é descodificada em cadeias polipeptídicas. O código genético, que define as regras de descodificação do genoma, minimiza os erros de tradução do mRNA, garantindo a síntese de proteínas com elevada fidelidade. Esta é essencial para a estabilidade do proteoma e para a manutenção e funcionamento dos processos celulares. Em condições fisiológicas normais, os erros da tradução do mRNA ocorrem com frequências que variam de 10-3 a 10-5 erros por codão descodificado. Situações que aumentam este erro basal geralmente estão associadas ao envelhecimento, stresse e a doenças; no entanto, em certos organismos o código genético é traduzido naturalmente com elevado erro, indicando que a síntese de proteínas aberrantes pode de algum modo ser vantajosa. A fim de estudar a resposta celular aos erros de tradução do mRNA, construímos leveduras que incorporam serina no proteoma em resposta a um codão de leucina, usando a expressão constitutiva de um tRNASer mutante. Este fenómeno genético artificial provocou uma forte diminuição da esporulação, da viabilidade e da eficiência de mating, afectando imensamente a reprodução sexual da levedura. Observou-se também uma grande heterogeneidade no tamanho e na forma das células e elevada instabilidade genómica, com o aparecimento de populações poliplóides e aneuplóides. No sentido de clarificar as bases celulares e moleculares daqueles fenótipos e compreender melhor a biologia do erro de tradução do mRNA, construímos também células de levedura que inserem serina em resposta a um codão de leucina de modo indutível e controlado. Utilizaram-se perfis de mRNA total e de mRNA associado a polissomas para elucidar a resposta celular ao erro de tradução do mRNA. Observou-se a indução de genes envolvidos na resposta ao stresse geral, stresse oxidativo e na unfolded protein response (UPR). Um aumento significativo de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e um forte impacto negativo na capacidade das células pós-mitóticas re-iniciarem o crescimento foram também observados. Este fenótipo de perda de viabilidade celular foi resgatado por scavangers de ROS, indicando que o stresse oxidativo é a principal causa de morte celular causada pelos erros de tradução. Este estudo levanta a hipótese de que o stresse oxidativo e a acumulação de ROS, ao invés do colapso súbito do proteoma, são as principais causas da degeneração celular e das doenças humanas associadas aos erros de tradução do genoma. ABSTRACT: Proteins are synthesized through the mechanism of translation, which uses the genetic code to transform the nucleic acids based information of the genome into the amino acids based information of the proteome. The genetic code evolved in such a manner that translational errors are kept to a minimum and even when they occur their impact is minimized by similar chemical properties of the amino acids. Protein synthesis fidelity is essential for proteome stability and for functional maintenance of cellular processes. Indeed, under normal physiological conditions, mistranslation occurs at frequencies that range from 10-3 to 10-5 errors per codon decoded. Situations where this basal error frequency increases are usually associated to aging and disease. However, there are some organisms where genetic code errors occur naturally at high level, suggesting that mRNA mistranslation can somehow be beneficial. In order to study the cellular response to mRNA mistranslation, we have engineered single codon mistranslation in yeast cells, using constitutive expression of mutant tRNASer genes. These mistranslating strains inserted serines at leucine-CUG sites on a proteome wide scale due to competition between the wild type tRNALeu with the mutant tRNASer. Such mistranslation event decreased yeast sporulation, viability and mating efficiencies sharply and affected sexual reproduction strongly. High heterogeneity in cell size and shape and high instability in the genome were also observed, with the appearance of some polyploid or aneuploid cell populations. To further study the cellular and molecular basis of those phenotypes and the biology of mRNA mistranslation, we have also engineered inducible mRNA misreading in yeast and used total mRNA and polysome associated mRNA profiling to determine whether codon misreading affects gene expression. Induced mistranslation up-regulated genes involved in the general stress response, oxidative stress and in the unfolded protein response (UPR). A significant increase in reactive oxygen species (ROS) and a strong negative impact on the capacity of post-mitotic cells to re-initiate growth in fresh media were also observed. This cell viability phenotype was rescued by scavengers of ROS, indicating that oxidative stress is the main cause of cell death caused by mRNA mistranslation. This study provides strong support for the hypothesis that oxidative stress and ROS accumulation, rather than sudden proteome collapse or major proteome disruption, are the main cause of the cellular degeneration observed in human diseases associated mRNA mistranslation.