Combining analytical methodologies for the identification of Aspergillus section Flavi strains isolated from Brazilian agricultural commodities

The use of chemical analysis of microbial components, including proteins, became an important achievement in the 80���s of the last century to the microbial identification. This led a more objective microbial identification scheme, called chemotaxonomy, and the analytical tools used in the field are mainly 1D/2D gel electrophoresis, spectrophotometry, high-performance liquid chromatography, gas chromatography, and combined gas chromatography-mass spectrometry. The Edman degradation reaction was also applied to peptides sequence giving important insights to the microbial identification. The rapid development of these techniques, in association with knowledge generated by DNA sequencing and phylogeny based on rRNA gene and housekeeping genes sequences, boosted the microbial identification to an unparalleled scale. The recent results of mass spectrometry (MS), like Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF), for rapid and reliable microbial identification showed considerable promise. In addition, the technique is rapid, reliable and inexpensive in terms of labour and consumables when compared with other biological techniques. At present, MALDI-TOF MS adds an additional step for polyphasic identification which is essential when there is a paucity of characters or high DNA homologies for delimiting very close related species. The full impact of this approach is now being appreciated when more diverse species are studied in detail and successfully identified. However, even with the best polyphasic system, identification of some taxa remains time-consuming and determining what represents a species remains subjective. The possibilities opened with new and even more robust mass spectrometers combined with sound and reliable databases allow not only the microbial identification based on the proteome fingerprinting but also include de novo specific proteins sequencing as additional step. These approaches are pushing the boundaries in the microbial identification field.

Use of a polyphasic approach including MALDI-TOF MS for identification of Aspergillus section Flavi strains isolated from food commodities in Brazil

Brazil is one the largest producers and exporters of food commodities in the world. The evaluation of fungi capable of spoilage and the production mycotoxins in these commodities is an important issue that can be of help in bioeconomic development. The present work aimed to identify fungi of the genus Aspergillus section Flavi isolated from different food commodities in Brazil. Thirty-five fungal isolates belonging to the section Flavi were identified and characterised. Different classic phenotypic and genotypic methodologies were used, as well as a novel approach based on proteomic profiles produced by matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Type or reference strains for each taxonomic group were included in this study. Three isolates that presented discordant identification patterns were further analysed using the internal transcribed spacer (ITS) region and calmodulin gene sequences. The data obtained from the phenotypic and spectral analyses divide the isolates into three groups, corresponding to taxa closely related to Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, and Aspergillus tamarii. Final polyphasic fungal identification was achieved by joining data from molecular analyses, classical morphology, and biochemical and proteomic profiles generated by MALDI-TOF MS.

A����o fungit��xica do ��leo essencial de Tanaecium nocturnum (Barb. Rodr.) Bur. e K. Shum sobre o Aspergillus flavus isolado da castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa)

Neste trabalho, avaliou-se a capacidade fungit��xica do ��leo essencial de folhas frescas de Tanaecium nocturnum sobre o Aspergillus flavus isolado da castanha-do-brasil, por meio das t��cnicas de contato e fumiga����o. Pelos resultados dos bioensaios realizados at�� 10 dias de incuba����o, verificou-se que a inibi����o total do crescimento micelial ocorreu quando se utilizou o ��leo essencial nas concentra����es de 782 ppm (t��cnica de contato) e 1000 ppm (t��cnica de fumiga����o). Em ambas as t��cnicas, o ��leo essencial inibiu a esporula����o a partir da concentra����o de 500 ppm. Observou-se que nos cinco primeiros dias de incuba����o n��o houve diferen��a significativa nos resultados apresentados pelas duas t��cnicas estudadas, havendo a partir da�� uma redu����o da atividade do ��leo essencial nas concentra����es inferiores a 1000 ppm pelo teste de fumiga����o. A a����o fungit��xica do ��leo essencial sobre o microrganismo estudado pode ser atribu��da �� presen��a do benzalde��do (composto majorit��rio do ��leo essencial estudado), em associa����o com outros compostos tamb��m presentes nesse ��leo essencial, tais como; ��lcool benz��lico, benzoato de benzila e mandelonitrila.

Combined bioremediation and enzyme production by Aspergillus sp. in olive mill and winery wastewaters

Olive mill wastewaters (OMW) and vinasses (VS) are effluents produced respectively by olive mills and wineries, both sectors are of great economic importance in Mediterranean countries. These effluents cause a large environmental impact, when not properly processed, due to their high concentration of phenolic compounds, COD and colour. OMW may be treated by biological processes but, in this case, a dilution is necessary, increasing water consumption. The approach here in proposed consists on the bioremediation of OMW and VS by filamentous fungi. In a screening stage, three fungi (Aspergillus ibericus, Aspergillus uvarum, Aspergillus niger) were selected to bioremediate undiluted OMW, two-fold diluted OMW supplemented with nutrients, and a mixture of OMW and VS in the proportion 1:1 (v/v). Higher reductions of phenolic compounds, colour and COD were achieved mixing both residues; with A. uvarum providing the best results. In addition, the production of enzymes was also evaluated during this bioremediation process, detecting in all cases lipolytic, proteolytic and tannase activities. A. ibericus, A. uvarum and A. niger achieved the highest value of lipase (1253.7 �� 161.2 U/L), protease (3700 �� 124.3 U/L) and tannase (284.4 �� 12.1 U/L) activities, respectively. Consequently, this process is an interesting alternative to traditional processes to manage these residues, providing simultaneously high economic products, which can be employed in the same industries.

The isolation of Aspergillus spp from harvested maize in three Portuguese regions

In Portugal, maize is the cereal that involves more agriculture explorations. Aspergillus spp., among other species, are usually associated with this cereal, during drying and storage, making this commodity susceptible to mycotoxins (such as aflatoxins, ochratoxins, and cyclopiazonic acid). The aim of this study was to evaluate the mycotoxigenic potential of isolated Aspergillus strains from these maize samples and correlate it with the sampling place, the weather conditions, and local practices during drying and storage. The samples were collected between November 2008 and April 2009 in maize association of producers facilities in Coimbra, Santar��m and Portalegre. The isolated strains were divided in three distinct groups, Aspergillus section Flavi, Aspergillus section Nigri and others Aspergillus. The preliminary results show that there are differences between the incidence of these groups in the three sampling places, especially in Coimbra, probably due to a lower mean temperatures and higher humidity levels. These data will be presented and discussed.

Aspergillus infection in the ascending aorta of a patient with aortic and mitral valve prostheses

We report the case of implantation of metallic mitral and aortic valve prostheses 6 months earlier, with subsequent multiple embolic episodes. The anatomicopathological examination of the thrombus of the third embolic episode was compatible with Aspergillus sp, which was treated with amphotericin B, followed by oral itraconazole. On the fourth embolism, vegetations were visualized in the ascending aorta on echocardiography and resonance imaging, and the patient underwent replacement of the aortic segment by a Haemashield tube and exploration of the aortic prosthesis, which was preserved, because no signs of endocarditis were found. Four months later, the patient died due to cardiogenic shock secondary to acute myocardial infarction caused by probable coronary embolism and partial dysfunction of the aortic prosthesis.

Estudio de la micobiota y sus micotoxinas en ingredientes y raciones de animales dom��sticos. Estrategias orientadas a la prevenci��n de las micotoxicosis. Studies on mycobiota and incidence of mycotoxins in raw material and feedstuff for domestic animals. Different strategies for mycotoxicosis prevention.

Numerosas investigaciones han desarrollado estrategias para la remoci��n de micotoxinas en alimentos por diferentes m��todos, aunque muchos de ellos no han llegado a ser utilizados debido a los elevados costos o a las dificultades pr��cticas involucradas en el proceso de detoxificaci��n. Estos argumentos estimulan a los investigadores a desarrollar nuevas estrategias de decontaminaci��n que eviten el uso de agentes qu��micos y que reduzcan las p��rdidas en el valor nutritivo y la palatabilidad de los alimentos decontaminados. Una de las alternativas promisorias es la detoxificaci��n biol��gica. Las levaduras capaces de adsorber micotoxinas y con habilidades probi��ticas o prebi��ticas son promisorias para reducir la exposici��n humana a las micotoxinas. En el tracto gastrointestinal se encuentra normalmente un gran n��mero de especies de bacterias comensales y pat��genas; sin embargo, cuando se incrementa la cantidad de microorganismos pat��genos se pueden producir alteraciones de la salud y muerte. La industria argentina de alimentos destinados a animales necesita reducir los niveles de micotoxinas presentes en ingredientes o en insumos terminados. Si bien los resultados obtenidos en el mundo en la tem��tica son preliminares y promisorios, en nuestro pa��s a��n no se han desarrollado estrategias biol��gicas de decontaminaci��n de micotoxinas aplicadas a estos alimentos. Estudios de incidencia de micoflora y detecci��n de micotoxinas en alimentos balanceados para aves, llevados a cabo por nuestro grupo de investigaci��n en la regi��n del sur de C��rdoba demostraron la presencia de los principales g��neros toxicog��nicos (Aspergillus, Penicillium y Fusarium) y sus micotoxinas asociadas (aflatoxinas, zearalenona y fumonisinas). En relaci��n a porcinotecnia, la zona sur de la provincia de C��rdoba es considerada una de las tres zonas de mayor densidad porcina en Argentina. Sin embargo, la contaminaci��n de los granos con micotoxinas representa un serio problema debido a que producen rechazo del alimento, disminuci��n de la tasa de crecimiento y reducci��n inmunol��gica. Si consideramos la evoluci��n en la producci��n lechera en los ��ltimos a��os ha seguido una l��nea de intensificaci��n que ha conllevado un cambio en la utilizaci��n de los alimentos, evolucionando del simple pastoreo a los sistemas de alimentaci��n ��nica, basados en la formulaci��n de alimentos balanceados que constituyen la clave de la alimentaci��n de los animales. Diferentes estudios epidemiol��gicos usando t��cnicas moleculares han demostrado que con frecuencia la infecci��n por A. fumigatus ocurre como consecuencia de la adquisici��n ex��gena del hongo. La magnitud del problema se manifiesta en la continua b��squeda de medidas de prevenci��n y control de estas micotoxicosis. Debido a este impacto negativo que ejercen las toxinas f��ngicas lo cual, afecta los par��metros productivos como ganancia de peso y conversi��n alimenticia con graves p��rdidas a la industria animal tanto en el mercado interno como externo.

Producci��n de ��cido Itac��nico por Aspergillus terreus y de ��cido Hialur��nico por Streptococcus equi subsp. equi en Biorreactores de Tanque Agitado. Production of Itaconic Acid by Aspergillus terreus and of Hyaluronic Acid by Sreptococcus equi subsp. equi in Stirred Tank Bioreactors.

El proyecto aborda el problema general de establecer una metodolog��a para el cambio de escala de la producci��n de metabolitos en biorreactores de tanque agitado.En el desarrollo de procesos de producci��n de metabolitos a partir de microorganismos, el cambio de escala es particularmente complejo, dado que los microorganismos experimentan un continuo cambio en sus rutas metab��licas durante el per��odo de producci��n. Esto hace que en el proceso del cambio de escala, las mayores dificultades se encuentren en el desarrollo del in��culo y problemas ocasionados por modificaciones en las caracter��sticas de transferencia de calor, masa y momento.Dentro de este contexto general se definen dos objetivos espec��ficos. Estos son: el estudio de la producci��n de ��cido itac��nico por Aspergillus terreus y el de la producci��n de ��cido hialur��nico por Streptococcus equi. subsp. equi, con la finalidad de desarrollar una metodolog��a de trabajo experimental y te��rica que permita sistematizar el estudio del factibilidad t��cnico-econ��mica de plantas de producci��n, vinculando la investigaci��n del procesos a escala de laboratorio con la producci��n a mayor escala.La hip��tesis de trabajo es que el estudio de la producci��n de Aspergillus terreus y de Streptococcus equi en un biorreactor de tanque agitado a escala de laboratorio permitir�� establecer los par��metros que contribuir��n a realizar el cambio de escala de su producci��n y esto ser�� verificado experimentalmente.Los trabajos se realizar��n utilizando un biorreactor a escala de laboratorio especialmente dise��ado para este tipo de trabajo. Los resultados experimentales se interpretar��n con t��cnicas estad��sticas y matem��ticas de diferente complejidad a efectos de establecer los criterios de cambio de escala y luego se realizar��n experiencias en un biorreactor piloto con el objeto de verificar la metodolog��a seleccionada.El desarrollo del proyecto permitir��:1.- obtener informaci��n t��cnica ��til sobre la producci��n de ��cido itac��nico, el que tiene importantes aplicaciones en la industria del pl��stico. La producci��n por medio del Aspergillus terreus MJL05 se realizar�� utilizando glicerol como fuente de carbono, el que constituye el principal subproducto en los procesos de manufactura de biodiesel. De este modo se podr�� analizar la factibilidad t��cnica de una ruta alternativa para emplear este subproducto.2.- obtener informaci��n t��cnica ��til sobre la producci��n de ��cido hialur��nico, biopol��mero de alto valor agregado con importantes aplicaciones en medicina, y contribuir as�� a realizar el cambio de escala de su producci��n.

Solubiliza����o quantitativa de fosfatos insol��veis, por algumas esp��cies dos g��neros Aspergillus e Penicillium

No presente trabalho, os autores estudaram, em condi����es de laborat��rio, as rela����es entre algumas especies dos g��neros Aspergillus e Penicillium e tres fosfatos insol��veis, determinando quantitativamente o f��sforo solubilizado e imobilizado. Dos resultados, os autores extra��ram as seguintes conclus��es: 1. Todas as linhagens estudadas demonstraram alta capacidade solubilizadora nos testes em placas de petri. No entante, quando analisadas quantitativamente, apenas o A. niger foi capaz de solubilizar quantidades apreci��veis de fosfatos insol��veis. 2. A an��lise dos dados, obtidos com as linhagens de Penicillium spp, indicou que ambas aumentaram significativamente os n��veis de f��sforo sol��vel para os tratamentos com fosfato de alum��nio, em rela����o a seus hom��logos est��reis; diminuiram significativamente os n��veis de f��sforo sol��vel das testemunhas e, n��o alteraram significativamente os n��veis dos tratamentos com fosfato de ferro. Por outro lado, nos tratamentos com apatita de Arax�� o n��vel de fosforo sol��vel n��o foi alterado significativamente com a linhagem 4 Ra��z III e, diminuiu significativamente, com a linhagem 8 RIZ III. 3. �� linhagem de Aspergillus sp. apresentou comportamento diferente dos demais fungos, diminuindo significativamente os n��veis de f��sforo sol��vel de todos os tratamentos. 4. A ader��ncia de numerosas part��culas de fosfatos insol��veis �� trama miceliana, �� fator de erro que pode explicar as discrepancias nos valores obtidos pela determina����o indireta do f��sforo assimil��vel do solo, empregando-se t��cnicas biol��gicas com A. niger ou outros fungos.

Esp��cies de Aspergillus produtoras de aflatoxina, na regi��o Araraquarense, SP

No presente trabalho foram isoladas, e estudadas quanto �� produ����o de aflatoxina, esp��cies do g��nero Aspergillus, principalmente as linhagens de A. flavus ocorrentes na regi��o Araraquarense. o isolamento, seguindo m��todos usuais em microbiologia, foram executados em amostras de amendoim, provenientes de duas ��pocas do ano, ou seja, da safra das ����guas�� e da safra da ��seca��. Ap��s o isolamento as culturas foram classificadas. Dessa classifica����o p��de-se obter: 102 culturas de A. flavus; 4 culturas de A. oryzae; var. effusus; 2 culturas de A. oryzae; 2 culturas de A. parasiticus e 1 cultura do Grupo A. ochraceus. Durante os trabalhos 4 culturas foram perdidas, dessa forma foram estudadas realmente 107 culturas. Todas as culturas, a seguir, foram estudadas para a verifica����o de sua habilidade em produzir aflatoxina. A extra����o da toxina foi feita no mic��lio e no meio de cultura, usando-se t��cnicas padr��es. A separa����o dos metab��litos foi feita em placas de camada delgada de silicagel, usando-se como solvente o benzeno-acetato de etila-etnol e quantificadas sob luz ultra-violeta. Analisando-se as 107 culturas de Aspergillus, notou-se que apenas 33 delas (31%) produziram aflatoxina, sendo que destas, 4 produriram apenas no meio de cultura, enquanto que duas produziram aflatoxina apenas no mic��lio. Observando-se ainda o comportamento das culturas que produziram aflatoxina, verificou-se que a produ����o da toxina no mic��lio foi muito maior que no meio da cultura, algumas produzindo elevadas quantidades (at�� 400 ppm de B1 e 300 ppm de G1). 3) Uma percentagem razo��vel de amostras (65% na s��rie A e 70% na s��rie B) produziram aflatoxina em pelo menos uma das col��nias isoladas. 4) Algumas col��nias produziram elevada quantidade de aflatoxina, chegando a 400 ppm de Bi e 300 ppm de d. 5) Uma baixa propor����o do total das col��nias (31%) produziu aflatoxina. 6) Dentre as demais esp��cies de Aspergillus apenas uma col��nia de A. oryzae produziu aflatoxina e mesmo assim, s�� no meio de cultura. 7) N��o houve correla����o entre a produ����o de aflatoxina no meio de cultura e no mic��lio (r = 0,027), por��m houve uma correla����o fortemente positiva entre a produ����o de aflatoxina Bx e Gx no meio de cultura (r = 0,988) e tamb��m no mic��lio (r = 0,826).

Estudo do controle qu��mico do Aspergillus flavus e produ����o de afl��toxina no amendoim (Arachis hypogaea L.) no campo

No presente trabalho foi estudada a possibilidade de controle da produ����o de aflatoxina pelo Aspergillus flavus em amendoim, pela aplica����o de fungicidas sobre as vagens logo ap��s seu arrancamento. Quatro fungicidas eficientes selecionados previamente em testes "in vitro" (Ferbam, Thiram, Ortofenilfenato de s��dio e Captaiol) foram utilizados em experimentos levados a efeito durante quatro anos nas regi��es de Caiabu, Campinas, Mar��lia, Pirapozinho e Ribeir��o Preto. Os resultados levaram �� conclus��o, dentro do ��mbito e condi����es do experimento, de que nos anos em que houve chuva na colheita, os tratamentos anti-f��ngicos foram ineficientes e que em anos secos as pr��prias condi����es do tempo se encarregaram de inibir o A. flavus.