Fluorescence-intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology

A methodology, fluorescence-intensity distribution analysis, has been developed for confocal microscopy studies in which the fluorescence intensity of a sample with a heterogeneous brightness profile is monitored. An adjustable formula, modeling the spatial brightness distribution, and the technique of generating functions for calculation of theoretical photon count number distributions serve as the two cornerstones of the methodology. The method permits the simultaneous determination of concentrations and specific brightness values of a number of individual fluorescent species in solution. Accordingly, we present an extremely sensitive tool to monitor the interaction of fluorescently labeled molecules or other microparticles with their respective biological counterparts that should find a wide application in life sciences, medicine, and drug discovery. Its potential is demonstrated by studying the hybridization of 5′-(6-carboxytetramethylrhodamine)-labeled and nonlabeled complementary oligonucleotides and the subsequent cleavage of the DNA hybrids by restriction enzymes.

Innovative analytical strategies for the development of sensor devices and mass spectrometry methods

Il lavoro presentato in questa tesi di Dottorato è incentrato sullo sviluppo di strategie analitiche innovative basate sulla sensoristica e su tecniche di spettrometria di massa in ambito biologico e della sicurezza alimentare. Il primo capitolo tratta lo studio di aspetti metodologici ed applicativi di procedure sensoristiche per l’identificazione e la determinazione di biomarkers associati alla malattia celiaca. In tale ambito, sono stati sviluppati due immunosensori, uno a trasduzione piezoelettrica e uno a trasduzione amperometrica, per la rivelazione di anticorpi anti-transglutaminasi tissutale associati a questa malattia. L’innovazione di questi dispositivi riguarda l’immobilizzazione dell’enzima tTG nella conformazione aperta (Open-tTG), che è stato dimostrato essere quella principalmente coinvolta nella patogenesi. Sulla base dei risultati ottenuti, entrambi i sistemi sviluppati si sono dimostrati una valida alternativa ai test di screening attualmente in uso per la diagnosi della celiachia. Rimanendo sempre nel contesto della malattia celiaca, ulteriore ricerca oggetto di questa tesi di Dottorato, ha riguardato lo sviluppo di metodi affidabili per il controllo di prodotti “gluten-free”. Il secondo capitolo tratta lo sviluppo di un metodo di spettrometria di massa e di un immunosensore competitivo per la rivelazione di prolammine in alimenti “gluten-free”. E’ stato sviluppato un metodo LC-ESI-MS/MS basato su un’analisi target con modalità di acquisizione del segnale selected reaction monitoring per l’identificazione di glutine in diversi cereali potenzialmente tossici per i celiaci. Inoltre ci si è focalizzati su un immunosensore competitivo per la rivelazione di gliadina, come metodo di screening rapido di farine. Entrambi i sistemi sono stati ottimizzati impiegando miscele di farina di riso addizionata di gliadina, avenine, ordeine e secaline nel caso del sistema LC-MS/MS e con sola gliadina nel caso del sensore. Infine i sistemi analitici sono stati validati analizzando sia materie prime (farine) che alimenti (biscotti, pasta, pane, etc.). L’approccio sviluppato in spettrometria di massa apre la strada alla possibilità di sviluppare un test di screening multiplo per la valutazione della sicurezza di prodotti dichiarati “gluten-free”, mentre ulteriori studi dovranno essere svolti per ricercare condizioni di estrazione compatibili con l’immunosaggio competitivo, per ora applicabile solo all’analisi di farine estratte con etanolo. Terzo capitolo di questa tesi riguarda lo sviluppo di nuovi metodi per la rivelazione di HPV, Chlamydia e Gonorrhoeae in fluidi biologici. Si è scelto un substrato costituito da strips di carta in quanto possono costituire una valida piattaforma di rivelazione, offrendo vantaggi grazie al basso costo, alla possibilità di generare dispositivi portatili e di poter visualizzare il risultato visivamente senza la necessità di strumentazioni. La metodologia sviluppata è molto semplice, non prevede l’uso di strumentazione complessa e si basa sull’uso della isothermal rolling-circle amplification per l’amplificazione del target. Inoltre, di fondamentale importanza, è l’utilizzo di nanoparticelle colorate che, essendo state funzionalizzate con una sequenza di DNA complementare al target amplificato derivante dalla RCA, ne permettono la rivelazione a occhio nudo mediante l’uso di filtri di carta. Queste strips sono state testate su campioni reali permettendo una discriminazione tra campioni positivi e negativi in tempi rapidi (10-15 minuti), aprendo una nuova via verso nuovi test altamente competitivi con quelli attualmente sul mercato.

Análise de acetona em ar exalado: desenvolvimento de método eletroanalítico e algoritmo para processamento de sinais

Propõe-se método novo e completo para análise de acetona em ar exalado envolvendo coleta com pré-concentração em água, derivatização química e determinação eletroquímica assistida por novo algoritmo de processamento de sinais. Na literatura recente a acetona expirada vem sendo avaliada como biomarcador para monitoramento não invasivo de quadros clínicos como diabetes e insuficiência cardíaca, daí a importância da proposta. Entre as aminas que reagem com acetona para formar iminas eletroativas, estudadas por polarografia em meados do século passado, a glicina apresentou melhor conjunto de características para a definição do método de determinação por voltametria de onda quadrada sem a necessidade de remoção de oxigênio (25 Hz, amplitude de 20 mV, incremento de 5 mV, eletrodo de gota de mercúrio). O meio reacional, composto de glicina (2 mol·L-1) em meio NaOH (1 mol·L-1), serviu também de eletrólito e o pico de redução da imina em -1,57 V vs. Ag|AgCl constituiu o sinal analítico. Para tratamento dos sinais, foi desenvolvido e avaliado um algoritmo inovador baseado em interpolação de linha base por ajuste de curvas de Bézier e ajuste de gaussiana ao pico. Essa combinação permitiu reconhecimento e quantificação de picos relativamente baixos e largos sobre linha com curvatura acentuada e ruído, situação em que métodos convencionais falham e curvas do tipo spline se mostraram menos apropriadas. A implementação do algoritmo (disponível em http://github.com/batistagl/chemapps) foi realizada utilizando programa open source de álgebra matricial integrado diretamente com software de controle do potenciostato. Para demonstrar a generalidade da extensão dos recursos nativos do equipamento mediante integração com programação externa em linguagem Octave (open source), implementou-se a técnica da cronocoulometria tridimensional, com visualização de resultados já tratados em projeções de malha de perspectiva 3D sob qualquer ângulo. A determinação eletroquímica de acetona em fase aquosa, assistida pelo algoritmo baseado em curvas de Bézier, é rápida e automática, tem limite de detecção de 3,5·10-6 mol·L-1 (0,2 mg·L-1) e faixa linear que atende aos requisitos da análise em ar exalado. O acetaldeído, comumente presente em ar exalado, em especial, após consumo de bebidas alcoólicas, dá origem a pico voltamétrico em -1,40 V, contornando interferência que prejudica vários outros métodos publicados na literatura e abrindo possibilidade de determinação simultânea. Resultados obtidos com amostras reais são concordantes com os obtidos por método espectrofotométrico, em uso rotineiro desde o seu aperfeiçoamento na dissertação de mestrado do autor desta tese. Em relação à dissertação, também se otimizou a geometria do dispositivo de coleta, de modo a concentrar a acetona num volume menor de água gelada e prover maior conforto ao paciente. O método completo apresentado, englobando o dispositivo de amostragem aperfeiçoado e o novo e efetivo algoritmo para tratamento automático de sinais voltamétricos, está pronto para ser aplicado. Evolução para um analisador portátil depende de melhorias no limite de detecção e facilidade de obtenção eletrodos sólidos (impressos) com filme de mercúrio, vez que eletrodos de bismuto ou diamante dopado com boro, entre outros, não apresentaram resposta.

Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para o monitoramento dos produtos das vias metabólicas do triptofano em linhagem celular de glioma humano

O metabolismo do triptofano (Trp) se dá pela via das quinureninas (QUIN), pela via serotoninérgica (SER) e pela via das aminas traço. A primeira gera QUIN e uma variedade de outros metabólitos secundários. Quando conduzida pela enzima indolamina 2,3 dioxigenase (IDO) contribui para os fenômenos de tolerância e imune escape de células tumorais; e quando conduzida pela triptofano 2,3 dioxigenase (TDO) no fígado, participa na síntese da niacina e NAD. A via SER leva à formação do neurotransmissor serotonina (SER), que pode gerar o hormônio melatonina (MEL), respectivamente e outros metabólitos biologicamente ativos. Outra via menos estudada, a via das aminas traço, produz produtos neuroativos. Dada a abrangência e importância das rotas metabólicas do Trp, nós desenvolvemos e validamos uma metodologia bioanalítica robusta, seletiva e sensível por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), acoplado espectrometria de massas (MS) para a determinação simultânea do Trp e seus 15 metabólitos. Para tanto, escolhemos para a avaliação das três vias, linhagens de glioma humano. A escolha por este tipo celular deveu-se ao grande interesse de estudos de metabolismo de Trp em células tumorais, no qual células de glioma tem sido modelo. Nos ensaios com as células de glioma acompanhamos os efeitos de um indutor e inibidores da primeira etapa de metabolização do Trp pela via das quinureninas, ou seja, IFN-γ (indutor da IDO), 1-metiltriptofano (1-MT; inibidor competitivo da IDO) e 680C91 (inibidor seletivo da TDO). Pudemos observar o impacto que a indução ou a inibição do primeiro passo teve sobre os metabólitos subsequentes e as diferenças no metabolismo das duas linhagens estudadas, A172 e T98G. A linhagem T98G só tem atividade de IDO, enquanto que a A172 tem tanto atividade IDO quanto TDO. A indução por IFN-γ mostrou que essa citocina não só atua na formação da via QUIN, mas possui um impacto modesto nas demais rotas. Observamos também que a inibição do 1-MT mostrou seu impacto nos metabólitos invdividualmente, do que a simples relação Trp-QUIN. Contudo, nosso resultados nos permitiu mostrar pela primeira vez a descrição completa dessas vias, em especial nessas linhagens celulares, podendo supor estratégias terapêuticas nessas rotas que estão relacionadas a progressão ou não tumoral.

Desenvolvimento e validação de metodologia para determinação de resíduos de pesticidas piretróides por HPLC em feijão

Um método rápido utilizando cromatografia liquida (LC) foi desenvolvido para determinação simultânea de 7 pesticidas piretróides (bifentrina, cipermetrina, fenpropatrina, fenvalerato, permetrina, lambda-cialotrina, e deltametrina). Os resíduos são extraídos com acetona e a partição realizada de acordo com o método multi-resíduos DFG-S19, substituindo diclorometano por acetato de etila/ciclohexano (1+1) e purificação usando cromatografia de permeação a gel com uma coluna Biobeads SX3 e acetato de etila/ciclohexano (1+1) como eluente. A separação por LC é realizada com uma coluna LiChrospher 100 RP-18 e acetonitrila/água (8+2) como fase móvel. Os pesticidas são detectados em 212nm. As recuperações dos 7 pesticidas piretróides em amostras de feijão fortificadas em 0,010; 0,100; e 1,000 mg/kg ficaram entre 71-105%. A diferença particular deste método é o limite de quantificação, os quais ficaram entre 0,004-0,011 mg/kg, abaixo de muitos outros métodos de LC descritos na literatura. A cromatografia a gás (GC) com detector de captura de elétrons é mais sensível que a LC, mas o método com LC facilita a identificação dos picos. A GC apresenta muitos picos enquanto a LC apresenta apenas um para a maioria dos piretróides. A análise com LC é uma boa alternativa para a determinação de resíduos de piretróides em feijão. Durante o ano de 2005, um total de 48 amostras de feijão comercializadas na cidade de São Paulo, foram analisadas. Nenhum resíduo de pesticida piretróide foi detectado nas amostras.

Evaluation of the multi-element capabilities of collision/reaction cell inductively coupled plasma - mass spectrometry in wine analysis

This work explores the multi-element capabilities of inductively coupled plasma - mass spectrometry with collision/reaction cell technology (CCT-ICP-MS) for the simultaneous determination of both spectrally interfered and non-interfered nuclides in wine samples using a single set of experimental conditions. The influence of the cell gas type (i.e. He, He+H2 and He+NH3), cell gas flow rate and sample pre-treatment (i.e. water dilution or acid digestion) on the background-equivalent concentration (BEC) of several nuclides covering the mass range from 7 to 238 u has been studied. Results obtained in this work show that, operating the collision/reaction cell with a compromise cell gas flow rate (i.e. 4 mL min−1) improves BEC values for interfered nuclides without a significant effect on the BECs for non-interfered nuclides, with the exception of the light elements Li and Be. Among the different cell gas mixtures tested, the use of He or He+H2 is preferred over He+NH3 because NH3 generates new spectral interferences. No significant influence of the sample pre-treatment methodology (i.e. dilution or digestion) on the multi-element capabilities of CCT-ICP-MS in the context of simultaneous analysis of interfered and non-interfered nuclides was observed. Nonetheless, sample dilution should be kept at minimum to ensure that light nuclides (e.g. Li and Be) could be quantified in wine. Finally, a direct 5-fold aqueous dilution is recommended for the simultaneous trace and ultra-trace determination of spectrally interfered and non-interfered elements in wine by means of CCT-ICP-MS. The use of the CCT is mandatory for interference-free ultra-trace determination of Ti and Cr. Only Be could not be determined when using the CCT due to a deteriorated limit of detection when compared to conventional ICP-MS.

The stability and formulation of topical analgesics

High-performance liquid chromatographic methods are developed for the simultaneous determination of various salicylates, their p-hydroxy isomers and nicotinic acid esters. The method is sensitive enough to detect trace amounts (~µM/L)of the product generated from cross reactivity between the drugs and the vehicle. The developed method also allows analysis of various topical products containing salicylate and nicotinate esters in their formulations. Applying this method, the degradation profiles of salicylates, nicotinates, p-hydroxy benzoate, o-methoxy benzoate and aspirin prodrugs in alkaline media are determined. The profile for alkyl salicylate degradation is found to be first order (A---? B) When the alcoholic radical is similar to that of the ester. In alcohol having a radical different from that of the ester function, the degradation is found to proceed through competitive transesterification and hydrolysis. The intermediates are identified following synthesis and isolation. The rate and extent of transesterification depends on the proportion of alcohol present in the system. Equations are presented to model the time profiles of reactant and product concentration. The reactions are base catalysed and the predominant pathway involves a concerted solvent attack upon the salicylate anion. Competitive hydrolysis of both ester components also follows this mechanism at moderate pH values but rates increase under strongly alkaline conditions as direct hydroxide attack becomes significant. In contrast, transesterification is independent of base concentration once full ionization is accomplished. The competitive hydrolysis is modelled using equations involving the dielectric constant of the medium. A range of other esters are also shown to undergo base-catalysed transesterification. In non-alcoholic solution phenyl salicylate undergoes a concentration-dependent oligomerisation which yields salsalate among the products. Competitive transesterification and hydrolysis also occur in products for topical use which have vehicles based upon alcohol, glycol or glycol polymers. Such reactions may compromise stability assessments, pharmaceutical integrity and delivery profiles.

Occurrence and transformation of organomercury in the Florida Everglades

In this study, a new method was developed based on aqueous phenylation, purge-and-trap preconcentration, gas chromatography (GC) separation, and detection by atomic fluorescence spectrometry (AFS) or inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). This technique is suitable for simultaneous determination of trace or ultratrace levels of CH3Hg+ and CH3CH2Hg+ in environmental samples. Method detection limits were 0.03 ng/L for both CH3Hg+ and CH3CH2Hg+ when AFS was used as the detector and 0.02 and 0.01 ng/L for CH3Hg+ and CH 3CH2Hg+ with ICPMS, respectively. The new method has the additional benefits of being free from interference by Cl - and dissolved organic matter. Using the method developed, both CH3Hg+ and CH3CH2Hg+ were detected in a number of soil and sediment samples collected from the Florida Everglades. The identity of CH3CH2Hg+ was verified by purge-and-trap-GC/MS analysis. The possibility of analytical artifact was excluded by using stable isotope tracer technique in combination with ICPMS detection. CH3CH 2Hg+ in the soil samples analyzed was at ng/g level, similar to that of CH3Hg+. The prevalence of CH 3CH2Hg+ in the soil of the Florida Everglades suggests that ethylation plays an important role in the geochemistry of Hg in this wetland. Soil incubation and sawgrass culture experiments using stable isotope tracers revealed that CH3Hg+ was mainly produced by microbial activities under anaerobic conditions, agreeing well with the general understanding of methylation mechanisms of Hg in the environment. Ethylation of Hg was not confirmed in these experiments, indicating that ethylation of Hg most probably follows different mechanisms in comparison to methylation. Further experiments revealed that trace levels of ethyllead species were able to transfer ethyl group to Hg in both deionized water and freshwater matrixes, producing CH3CH2Hg+. This might partially account for the occurrence of CH3CH2Hg+ in the relatively pristine environment of the Florida Everglades.

Analyse simultanée des hormones stéroïdiennes et leurs formes chimiques dans les matrices d'eau et d'urine par SPE-LC-MS/MS en ligne.

Dans les dernières années, les perturbateurs endocriniens ont été observés dans les rivières qui reçoivent des entrées importantes d’eaux usées. Parmi les perturbateurs endocriniens, les hormones stéroïdiennes naturelles et synthétiques sont des composés dont le potentiel d'imiter ou d'interférer avec les fonctions hormonales normales (développement, croissance et reproduction), est reconnu même au niveau ultra-traces (ng L-1). Bien que les hormones conjuguées soient moins actives que les hormones libres, elles peuvent être clivées et redevenir libres une fois exposées aux processus microbiens avant ou pendant le traitement des eaux usées. En raison de la nécessité d'identifier et de quantifier ces composés dans l'eau, une nouvelle méthode, entièrement automatisée, a été développée pour la détermination simultanée des deux formes de plusieurs hormones stéroïdiennes (conjuguées et libres) dans les matrices d'eau et dans l’urine des femmes. La méthode est basée sur l'extraction en phase solide couplée en ligne à la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS). Plusieurs paramètres ont été évalués dans le but d'optimiser l'efficacité de la méthode, tels que le type et le débit de la phase mobile, des différentes colonnes de SPE et de chromatographie, ainsi que différentes sources et modes d'ionisation des échantillons pour la MS. La méthode démontre une bonne linéarité (R2 > 0.993), ainsi qu'une précision avec un coefficient de variance inférieure à 10%. Les limites de quantification varient d’un minimum de 3 à 15 ng L-1 pour un volume d'injection entre 1 mL et 5 mL et le recouvrement des composés varie de 72 % à 117 %.

Analyse simultanée des hormones stéroïdiennes et leurs formes chimiques dans les matrices d'eau et d'urine par SPE-LC-MS/MS en ligne

Dans les dernières années, les perturbateurs endocriniens ont été observés dans les rivières qui reçoivent des entrées importantes d’eaux usées. Parmi les perturbateurs endocriniens, les hormones stéroïdiennes naturelles et synthétiques sont des composés dont le potentiel d'imiter ou d'interférer avec les fonctions hormonales normales (développement, croissance et reproduction), est reconnu même au niveau ultra-traces (ng L-1). Bien que les hormones conjuguées soient moins actives que les hormones libres, elles peuvent être clivées et redevenir libres une fois exposées aux processus microbiens avant ou pendant le traitement des eaux usées. En raison de la nécessité d'identifier et de quantifier ces composés dans l'eau, une nouvelle méthode, entièrement automatisée, a été développée pour la détermination simultanée des deux formes de plusieurs hormones stéroïdiennes (conjuguées et libres) dans les matrices d'eau et dans l’urine des femmes. La méthode est basée sur l'extraction en phase solide couplée en ligne à la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS). Plusieurs paramètres ont été évalués dans le but d'optimiser l'efficacité de la méthode, tels que le type et le débit de la phase mobile, des différentes colonnes de SPE et de chromatographie, ainsi que différentes sources et modes d'ionisation des échantillons pour la MS. La méthode démontre une bonne linéarité (R2 > 0.993), ainsi qu'une précision avec un coefficient de variance inférieure à 10%. Les limites de quantification varient d’un minimum de 3 à 15 ng L-1 pour un volume d'injection entre 1 mL et 5 mL et le recouvrement des composés varie de 72 % à 117 %.

Dispersive liquid–liquid microextraction for metals enrichment: A useful strategy for improving sensitivity of laser-induced breakdown spectroscopy in liquid samples analysis

A rapid and efficient Dispersive Liquid–Liquid Microextraction (DLLME) followed by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy detection (LIBS) was evaluated for simultaneous determination of Cr, Cu, Mn, Ni and Zn in water samples. Metals in the samples were extracted with tetrachloromethane as pyrrolidinedithiocarbamate (APDC) complexes, using vortex agitation to achieve dispersion of the extractant solvent. Several DLLME experimental factors affecting extraction efficiency were optimized with a multivariate approach. Under optimum DLLME conditions, DLLME-LIBS method was found to be of about 4.0–5.5 times more sensitive than LIBS, achieving limits of detection of about 3.7–5.6 times lower. To assess accuracy of the proposed DLLME-LIBS procedure, a certified reference material of estuarine water was analyzed.