994 resultados para signalisation cellulaire
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La voie de signalisation des Rcepteurs Tyrosine Kinase (RTK) occupe un rle central dans la rgulation de la croissance cellulaire, la prolifration, la diffrentiation et la motilit. Une rgulation anormale des RTKs mne plusieurs maladies humaines telles que le cancer du sein, la seconde cause de mortalit chez les femmes cause de lamplification et la mutation frquente de la protine tyrosine kinase HER2 (ERBB2). Grb2-associated binder (Gab) 2 est une protine adaptatrice qui agit en aval de plusieurs RTKs, y compris HER2, pour rguler de multiples voies de signalisation. En rponse la stimulation par de nombreux facteurs de croissances et cytokines, Gab2 est recrut la membrane plasmique o il potentialise lactivation des voies de signalisation Ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK) et PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase)/Akt (protein kinase B). En plus doccuper un rle essentiel durant le dveloppement du systme hmatopotique, Gab2 est souvent amplifi dans les cancers, notamment le cancer du sein et les mlanomes. Cependant, les mcanismes molculaires qui rgulent le fonctionnement de Gab2 sont peu connus. Il est tabli que lors de lactivation des RTKs, Gab2 est phosphoryl au niveau de plusieurs rsidus Tyrosine, menant lassociation de diffrentes protines comme p85 et Shp2. En plus de la phosphorylation en Tyrosine, notre laboratoire ainsi que dautres groupes de recherche avons identifi que Gab2 est aussi phosphoryl au niveau de rsidus Ser/Thr suite lactivation de la voie de signalisation MAPK. Cependant, la rgulation des fonctions de Gab2 par ces modifications post-traductionnelles est encore peu connue. Dans le but de comprendre comment Gab2 est rgul par la voie de signalisation MAPK, nous avons utilis diffrentes approches. Dans la premire partie de ma thse, nous avons dtermin un nouveau mcanisme dmontrant que la voie de signalisation Ras/MAPK, par le biais des protines kinases RSK (p90 ribosomal S6 kinase), phosphoryle Gab2. Ce phnomne se produit la fois in vivo et in vitro au niveau de trois rsidus Ser/Thr conservs. Des mutations au niveau de ces sites de phosphorylation entrainent le recrutement de Shp2 menant laugmentation de la motilit cellulaire, ce qui suggre que les protines RSK restreignent les fonctions dpendantes de Gab2. Ce phnomne est le rsultat de la participation de RSK dans la boucle de rtroaction ngative de la voie de signalisation MAPK. Dans la seconde partie de ma thse, nous avons dmontr que les protines ERK1/2 phosphorylent Gab2 au niveau de plusieurs rsidus pS/T-P la fois in vitro et in vivo, entrainant linhibition du recrutement de p85. De plus, nous avons tabli pour la premire fois que Gab2 interagit physiquement avec ERK1/2 dans des cellules lors de lactivation de la voie de signalisation MAPK. Par ailleurs, nous avons montr un nouveau domaine dattache du module ERK1/2 sur Gab2. Des mutations sur les rsidus essentiels de ce domaine dattache nentrainent pas seulement la dissociation de ERK1/2 avec Gab2, mais diminuent galement la phosphorylation dpendante de ERK1/2 sur Gab2. Ainsi, nos donnes montrent que la voie de signalisation MAPK rgule les fonctions de la protine Gab2 par le biais des kinases RSK et ERK1/2. Cette thse labore par ailleurs un schma complet des fonctions de Gab2 dpendantes de la voie de signalisation MAPK dans le dveloppement de nombreux cancers.
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Lincidence constante des maladies lies lge reflte un rel enjeu dans nos socits actuelles, principalement lorsquil est question des cas de cancers, daccidents crbraux et de maladies neurodgnratives. Ces dsordres sont lis laugmentation de lesprance de vie et un vieillissement de la population. Les cots, estims en milliards de dollars, reprsentent des sommes de plus en plus importantes. Bien que les efforts dploys soient importants, aucun traitement na encore t trouv. Les maladies neurodgnratives, telles que la maladie dAlzheimer, de Parkinson, dHuntington ou la sclrose latrale amyotrophique (SLA), caractrises par la dgnrescence dun type neuronal spcifique chaque pathologie, reprsentent un dfi important. Les mcanismes de dclenchement de la pathologie sont encore nbuleux, de plus il est maintenant clair que certains de ces dsordres impliquent de nombreux gnes impliqus dans diverses voies de signalisation induisant le dysfonctionnement de processus biologiques importants, tel que le mtabolisme. Dans nos socits occidentales, une problmatique, directement li notre style de vie sajoute. Laugmentation des quantits de sucre et de gras dans nos dites a amen un accroissement des cas de diabtes de type II, dobsit et de maladies coronariennes. Nanmoins, le mtabolisme du glucose, principale source nergtique du cerveau, est primordial la survie de nimporte quel organisme. Lors de ces travaux, deux tudes effectues laide de lorganisme Caenorhabditis elegans ont port sur un rle protecteur du glucose dans un contexte de vieillissement pathologique et dans des conditions de stress cellulaire. Le vieillissement semble acclr dans un environnement enrichi en glucose. Cependant, les sujets traits ont dmontr une rsistance importante diffrents stress et aussi la prsence de protines toxiques impliques dans la SLA et la maladie de Huntington. Dans un deuxime temps, nous avons dmontr que ces effets peuvent aussi tre transmis la gnration suivante. Un environnement enrichi en glucose a pour bnfice de permettre une meilleure rsistance de la progniture, sans pour autant transmettre les effets nfastes d au vieillissement acclr.
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Introduction : Aujourdhui, 35,3 millions de personnes vivent avec le virus de limmunodficience humaine (VIH)-1 dans le monde ; lAfrique subsaharienne concentre 70% des nouvelles infections et les femmes en reprsentent plus de la moiti. Le mode de transmission du VIH le plus rpandu est par voie mucosale gnitale suite des relations sexuelles. Le tractus gnital fminin (TGF) possde un milieu immunitaire complexe qui doit contrer linvasion par des pathognes tout en maintenant la tolrance/contrle de la flore normale vaginale tant sous la pression de procration sous influence des hormones sexuelles. De plus, les mcanismes favorisant ou prvenant linfection du TGF par le VIH ne sont pas prcisment identifis. Hypothse : Le contexte inflammatoire mucosal gnital et la rsultante de dialogues intercellulaires tel quentre les cellules pithliales gnitales (CEG) et les cellules dendritiques mylodes (mDC), qui sont des premires rencontrer le virus aux portes dentre mucosales, modulent lactivit des lymphocytes qui est dterminante dans le type de rponse immunitaire labore par lhte. Mthodologie : Des spcimens provenant dune cohorte de travailleuses du sexe (TS) recrutes Cotonou au Bnin en Afrique subsaharienne ont t analyss. Nous avons caractris le milieu mucosal gnital fminin hautement expos au VIH de TS srongatives (highly exposed seronegative; HESN) en comparaison avec celui de TS sropositives. Brivement, les liquides cervicaux-vaginaux ont t dtermins par des techniques de multiplexes/Luminex ou par ELISA et le milieu cellulaire a t dcrit suite des analyses de cytomtrie en flux (phnotypage et tri cellulaire). Rsultats : Nous avons observ la prsence augmente dun facteur soluble antiviral, immunomodulateur et antiprolifratif scrt dans le TGF des TS HESN qui est linterfron (IFN)-. La prsence augmente de cette cytokine suggre lexistence possible de connexions intercellulaires cls qui pourraient mener une rgulation homostatique du compartiment immunitaire gnital permettant de contrler linfection par le VIH-1. En tudiant lexpression de molcules impliques dans les voies de signalisation associes la production dIFN- dans les CEG et les cellules mylodes du TGF, nous avons pu mettre en vidence lexistence dun microenvironnement prsentant un profil tolrognique/rgulateur dans le TGF des TS HESN. Conclusion : Nos observations nous ont permis dlucider certaines hypothses sur un potentiel mcanisme dimmunit naturelle protecteur chez les TS HESN. De plus, nous sommes des premiers dcrire une population mylode prsentant des caractristiques de DC tolrogniques de par leur expression dinterleukine (IL)-10, de human leukocyte antigen (HLA)-G et de immunoglobulin-like transcript (ILT)-4 dans le TGF de TS HESN. Cette tude aura des implications majeures dans le dveloppement de stratgies dinterventions prventives afin de moduler des conditions inflammatoires prexistantes ainsi tablissant une dfense mucosale rapide et durable contre le VIH-1.
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La leucmie aigu lymphoblastique (LAL) est le cancer pdiatrique le plus frquent. Plusieurs rarrangements chromosomiques ont t associs cette maladie, dont la translocation t(12;21), qui est observe dans 25% des cas de LAL de type pr-B. Cette translocation engendre lexpression de la protine de fusion ETV6-AML1. Toutefois, celle-ci nest pas suffisante pour initier seule une leucmie, ce qui suggre que des mutations additionnelles sont ncessaires la transformation oncognique. Or, on observe que lallle non-rarrang dETV6 est perdu dans 75% des cas de t(12;21). Cette dltion entrane linactivation complte du facteur de transcription ETV6 et labolition de sa fonction biologique. PuisquETV6 semble jouer un rle de suppresseur de tumeurs, nous croyons que son inactivation favoriserait le dveloppement de la leucmie via la drgulation de ses gnes cibles. Ce projet visait donc identifier de nouvelles cibles transcriptionnelles dETV6, afin dlucider son implication dans la leucmie. Une exprience de RNA-Seq a permis didentifier plus de 200 gnes dont lexpression est corrle avec celle dETV6 dans des cellules souches hmatopotiques CD34+. Parmi ceux-ci, plusieurs gnes sont impliqus dans la rponse immunitaire et inflammatoire, la migration cellulaire, lhomostasie ionique et la signalisation intracellulaire. Nous avons galement mis en place une approche dimmunoprcipitation de la chromatine afin didentifier les rgions auxquelles le facteur de transcription ETV6 peut se lier. laide de cette mthode, nous avons dmontr une interaction entre ETV6 et SLCO2B1, un gne dont lexpression est galement co-rgule avec ETV6. Finalement, notre tude suggre quETV6 contribuerait la leucmogense en drgulant lexpression de certains gnes ayant des proprits oncogniques.
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Le cancer du col utrin (CCU) est dans plus de 99% des cas provoqu par une infection avec le virus du papillome humain (VPH), dont le potentiel oncognique rside dans l'expression des proto-oncognes viraux E6/E7. Le potentiel carcinognique de ces protines virales rside essentiellement dans leurs actions sur les produits des gnes suppresseurs de tumeur p53 et RB. Les produits de ces gnes, p53 et Rb, font parti des voies de signalisation de rponse aux dommages de l'ADN cellulaire (RDA) et leur perte entraine une perte de fonctionnalit qui mne une instabilit gnomique. long terme et en prsence de d'autres facteurs ceux-ci mneront au dveloppement d'un cancer. Les protines E6 et E7 sont constitutivement exprimes dans les cellules du CCU ainsi que dans les cellules de tout autre cancer induit par le VPH et seulement dans ces dernires. La prise en charge des cas avancs de ces cancers se fait principalement par radiothrapie et chimiothrapie concomitante. La chimio-radiothrapie utilise en traitement est efficace mais rsulte en un taux lev de morbidit et un nombre important de patientes rcidiveront. Nous proposons que l'exploitation de l'expression spcifique dE6 et dE7 dans les cellules du CCU permette denvisager une stratgie de ltalit synthtique afin d'amplifier l'effet ltal de l'irradiation sur les cellules CCU. Ceci permettrait potentiellement d'augmenter l'efficacit du traitement et de diminuer les rcidives, ainsi que la morbidit lie au traitement. En s'appuyant sur cette hypothse, notre objectif est didentifier des composs dont l'action seule ou couple l'irradiation provoquerait prfrentiellement la mort des cellules exprimant les protines E6 et E7 du VPH. Les cellules testes comprennent des cellules isogniques humaines issues de kratinocytes normaux que nous avons modifies squentiellement pour obtenir les modifications associes aux cellules CCU (hTERT, E6 et E7), ainsi que les lignes de cellules de CCU HeLa et CaSki .Nous avons procd la mise au point et la validation du protocole de criblage et des mthodes dvaluation de la sensibilisation, qui se dfinit comme une perte de viabilit, un arrt ou ralentissement de la croissance, par dtection dATP ainsi que par coloration dADN gnomique au DRAQ5. Suite un criblage cibl impliquant des inhibiteurs connus de la voie de rparation des dommages lADN, nous avons identifi linhibiteur de mdm2, Nutlin-3, comme tant un compos sensibilisant et radio-sensibilisant prfrentiellement les cellules exprimant E6 et E7 du VPH. La Nutlin-3 a t teste sur des cellules HEKn-hTERT-E6-E7, des cellules CaSki et HeLa. Leffet de sensibilisation et de radio-sensibilisation a t confirm dans ces trois lignes. Tel que suggr par son action sur mdmd2, la Nutlin-3 permet la stabilisation de p53 dans les cellules HEKn-hTERT-E6-E7 et CaSki et sa ractivation dans les lignes cellulaires HeLa et CaSki. Malgr cette stabilisation de p53, de faon surprenante, leffet de la Nutlin-3 sur la sensibilisation et la radio-sensibilisation des cellules HeLa et CaSki semble indpendant de p53, tel quobserv en utilisant des cellules HeLa-GSE et CaSki-GSE dont le p53 est dficient. In vivo la Nutlin-3a montre dans un essai prliminaire linhibition de la croissance tumorale des xnogreffes HeLa chez des souris RAG2c. Ce rsultat reste confirmer avec un essai impliquant un nombre dchantillons plus grand. plus long terme, nous comptons tudier limplication de mdm2 dans leffet de sensibilisant de la Nutlin-3 dans les cellules CCUs, ainsi que les autres cibles pouvant tre impliques dans la cration de cet effet sensibilisant observ.
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Linteraction du CD40L plaquettaire avec le CD40 exprim par les mono-lymphocytaires, dont les cellules prognitrices endothliales (EPCs), mdie lhmostase. Deux sous-types dEPCs induisent la rparation vasculaire : les early outgrowth cells (EOCs) et les endothelial colony forming cells (ECFCs). Les EOCs expriment des protines adaptatrices sassociant aux rcepteurs du facteur de ncrose tumorale (TRAFs) ncessaires la signalisation du CD40. Lassociation des TRAFs au CD40 contribuerait la fonction antiplaquettaire dEOCs prtraites au CD40L, via la libration de prostacycline (PGI2) ou d'oxyde nitrique (NO). Toutefois, la contribution des TRAFs des ECFCs dans la libration de PGI2 et de NO via la rgulation des cyclo-oxygnases (COX) et des NO synthases (NOS) demeure inexplore. Cette tude vise comprendre le rle des TRAFs, COX et NOS dans les ECFCs. Nous avons diffrenci des EPCs via la culture de cellules mononuclaires du sang priphrique (PBMCs) dans un milieu croissance endothliale (EGM-2) et rvl, par microscopie optique et confocale, le phnotype monocytaire de nos EOCs et de cellules endothliales (ECs) de nos ECFCs, incluant leurs caractristiques endothliales par cytomtrie en flux. Lexpression constitutive de leNOS, liNOS, la COX-1 et faiblement la COX-2 dans nos ECFCs et ECs, des enzymes absentes de nos EOCs, a t dcele par Western Blot. Le profil d'expression des TRAFs dans nos EOCs, ECFCs, PBMCs et ECs a dmontr la prsence varie du CD40 et celle des TRAF1, 2, 3, 5 et 6, selon le type cellulaire. En conclusion, nous avons rvl la prsence de TRAFs, COX et NOS, ainsi que leur expression diffrentielle dans les EOCs et ECFCs. Des tudes portant sur lassociation des TRAFs au CD40 claireront sur les mcanismes intracellulaires impliqus dans la rgulation de la synthse de PGI2 et de NO et la fonction antiplaquettaire des EPCs.
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Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en rponse un dsquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolonge ou une modification de l'quilibre hormonal. Le systme rnine-angiotensine (SRA) est un systme hormonal largement tudi et il est impliqu dans de nombreuses activits associes au remodelage cardiovasculaire. Lexistence d'un systme circulatoire coupl un systme de tissus locaux est une reprsentation classique, cependant de nouvelles donnes suggrent un SRA indpendant et fonctionnellement actif l'chelle cellulaire. La comprhension de l'activit intracellulaire du SRA pourrait mener de nouvelles pistes thrapeutiques qui pourraient prvenir un remodelage cardiovasculaire dfavorable. L'objectif de cette thse tait d'lucider le rle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Rcemment, les rcepteurs coupls aux protines G (RCPG), les protines G et leurs effecteurs ont t dtects sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nuclaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'tre accepts comme une ralit. Nous avons ds lors fait l'hypothse que la signalisation du SRA dlimitant le noyau tait implique dans le contrle de l'expression des gnes cardiaques. Nous avons dmontr la prsence de rcepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nuclaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nuclaire purifie de tissu cardiaque. Des quantits d'Ang II ont t dtectes dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donn lieu des liaisons prfrentielles aux sites nuclaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthse d'ARN de novo dans des noyaux isols stimuls l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-B taient beaucoup plus importants lorsque les noyaux taient exposs de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nuclaires a engendr une mobilisation de Ca2+ via les rcepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminu la rponse transcriptionnelle. Les mthodes disponibles actuellement pour l'tude de la signalisation intracrine sont limites aux mthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thse tait de synthtiser et caractriser des analogues d'Ang-II cellule-permants afin dtudier spcifiquement dans les cellules intactes l'activit intracellulaire du SRA. Nous avons synthtis et caractris pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsule en incorporant un groupement 4,5-dimthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifis du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsule synthtiss et purifis: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montr une rduction par un facteur deux ou trois de l'affinit de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison comptitive et une activit rduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augment la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isols elle gnrait une augmentation de Ca2+ nucloplasmique et initiait la synthse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-B. Les fibroblastes sont les principaux gnrateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus ractifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons mis l'hypothse que lAng-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nuclaires associs contrlaient les profils d'expression des gnes des fibroblastes via des systmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rle majeur dans le dveloppement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqu que les fibroblastes auriculaires expriment lAT1R et lAT2R nuclaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. Lexpression d'AT1R nuclaire a t rguls positivement dans les cas dinsuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nuclaire a t glycosyl post-traductionnellement. La machinerie protique des protines G, y compris Gq/11, Gi/3, et G, a t observe dans des noyaux isols de fibroblastes. AT1R et AT2R rgulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire dclenche la libration de Ca2+ nucloplasmique, la prolifration, et la synthse et scrtion de collagne qui ne sont pas inhibes par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires.
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La maladie cardiaque ischmique, la plus commune des maladies qui affectent le cur, est encore aujourdhui une importante cause de dcs dans les pays industrialiss. Une rponse cardio-mtabolique inflammatoire un changement aigu initi par une modification du mtabolisme nergtique du cur ischmique est accentue aprs que lapport en oxygne ait t rtabli. Parmi les altrations dltres dans le myocarde qui en rsultent, sont inclus laccumulation dacides gras non estrifis (AGNE) ainsi que leur oxydation au dtriment de lutilisation du glucose, ce qui amplifie la gnration despces ractives de loxygne (ROS). Les tissus en priphrie du cur tel que le tissu adipeux peuvent affecter ltendue des blessures au myocarde par la relche en circulation de substances bioactives comme les AGNE et ladiponectine. Le CD36 est le principal facilitateur de lentre dAGNE dans le cur et les adipocytes et constitue une importante cible mtabolique spcialement lors dun stress dischmie-reperfusion (I/R). Il a t rapport prcdemment par notre groupe quun ligand synthtique et slectif envers le CD36 exerce un effet protecteur puissant sur le systme vasculaire. Cependant, aucune tude in vivo na rapport deffet cardioprotecteur de ligands slectifs envers le CD36. Ainsi, ce projet visait valuer le rle et possiblement leffet cardioprotecteur de ligands slectifs du rcepteur CD36 sur la blessure au myocarde en I/R. Des souris CD36+/+ et CD36-/- ont t traites quotidiennement avec le EP 80317, le CP-3(iv) ou le vhicule pendant 14 jours avant de subir la ligature temporaire de lartre coronaire antrieure descendante gauche (LAD). Notre premire tude a montr que le EP 80317 exerce un effet cardioprotecteur puissant tel que montr par la rduction de la surface des lsions et lamlioration de la fonction cardiaque in vivo suivant la blessure au myocarde en I/R. De plus, le EP 80317 a rduit linternalisation totale dAGNE dans le myocarde, mesure in vivo par limagerie mtabolique cardiaque, en accord avec la diminution du niveau circulant dAGNE. Une rduction de la lipolyse rvle par une perfusion de radiotraceur de palmitate et une augmentation du niveau dexpression de gnes adipogniques et anti-lipolytiques appuient davantage leffet du EP 80317 dans la prvention de la mobilisation dltre dacides gras du tissu adipeux. Notre deuxime tude a investigu le mcanisme cardioprotecteur dune nouvelle gnration de ligands dots dune plus grande affinit de liaison envers le CD36. Cette tude a montr que le CP-3(iv) est aussi pourvu dun puissant effet cardioprotecteur comme le montre la rduction de la taille de linfarctus et lamlioration de la fonction cardiaque post-I/R du myocarde qui est fonction dune signalisation mtabolique et anti-oxydante de ladiponectine. En effet, laugmentation des principales voies de signalisation rgulant la scrtion de ladiponectine et des gnes antioxydants a t dmontre dans le tissu adipeux suivant lI/R du myocarde et un traitement avec le CP-3(iv). Lactivation de la protine kinase B ou Akt dans le myocarde avec la diminution de la gnration de ROS et de la signalisation de mort cellulaire appuient davantage le rle cardioprotecteur du CP-3(iv) dans lI/R du myocarde. En conclusion, le travail prsent dans cette thse soutient quune signalisation du CD36 par le EP 80317 et le CP-3(iv) pourrait savrer tre une nouvelle approche thrapeutique dans le traitement de la maladie cardiaque ischmique. Ces ligands synthtiques slectifs envers le CD36 provoquent un effet salutaire sur le myocarde ischmique par le biais dune amlioration du profil mtabolique dans les premires heures de la reperfusion. Le EP 80317 rduit le niveau dltre dAGNE et leur internalisation dans le cur en situation dexcs, tandis que le CP-3(iv) augmente le niveau bnfique dadiponectine et son effet cardioprotecteur.
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Le trafic vsiculaire permet un change coordonn de molcules entre les diffrents organites de la cellule et dpend largement des petites GTPases de la famille des Rabs dont le nombre varie entre 27 chez la Drosophile et 70 chez lHomme. Un des prochains dfis consiste donc lucider les mcanismes cellulaires qui coordonnent lactivit de ces Rabs, laquelle garantit un transport vsiculaire ordonn au sein de la cellule. Les Rabs agissent comme des interrupteurs molculaires grce leur capacit cycler entre un tat actif et inactif. Lactivit des Rabs est contrle par des protines rgulatrices puis des effecteurs en aval coordonnent leurs diffrentes fonctions. La petite GTPase Rab11 est essentielle au dveloppement de plusieurs organismes incluant la Drosophile, C. elegans et la souris puisquelle se retrouve au cur de diffrentes voies de transport. Dailleurs, le trafic de molcules dpendant de Rab11 est perturb dans plusieurs pathologies. Malgr son rle central dans le trafic vsiculaire, la rgulation de Rab11 reste peu comprise in vivo. Cette thse se penche sur les mcanismes molculaires contrlant les fonctions de Rab11 et de ses effecteurs lors de la migration cellulaire collective et lors de la cytocinse. Nous avons identifi Evi5 comme un nouvel acteur cl de la migration cellulaire collective, et nous montrons quelle possde une activit Rab11-GAP essentielle pour maintenir les rcepteurs de guidance actifs de faon polarise au front de migration. Nous avons ensuite dtermin que Rab11 rgule la communication cellulaire lors de la migration collective par lentremise de son interaction avec la Mosine. Une question reste toutefois en suspens : sachant que Rab11 compte plus de 13 effecteurs, quels sont les mcanismes assurant la spcificit de linteraction entre cette GTPase et un effecteur particulier? Une partie de la rponse provient peut-tre de nos observations que les membres des Rab11-FIPs de classe I, une famille deffecteurs de Rab11, interagissent avec les protines dchafaudage 14-3-3. Chez la Drosophile, Rip11 est le seul reprsentant des Rab11-FIPs de classe I et nous montrons que Rip11 aurait des fonctions inattendues durant la cytocinse qui seraient coordonnes par 14-3-3. Nos recherches permettent de dresser un portrait plus authentique des mcanismes molculaires rgulant les diffrentes fonctions de Rab11 et de ses effecteurs in vivo.
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Jusqu prsent, la metformine a principalement t employe comme mdicament contrlant lhyperglycmie des personnes atteintes de diabte de type II. Des tudes pidmiologiques ont dmontr que les personnes, prenant de la metformine, dveloppent moins de cancers. Par exemple, la prise de metformine rduit respectivement de 78% et de 46% les chances de dvelopper un cancer hpatique ou pancratique. Rcemment, il a t montr que la metformine permet de rduire le dveloppement de tumeur au niveau de la peau, suite lexposition des rayons UVB. Dans cette tude, jai dmontr que la prsence de metformine permet une meilleure survie de la levure Saccharomyces cerevisiae suite lexposition des rayons UVC ou UVA. De plus, jai dmontr que la prsence de metformine augmente le recrutement de lhistone Htz1 la chromatine. Pour une souche htz1, le niveau de survie suite lexposition aux rayons UVA est considrablement diminu. Htz1 permet le recrutement de Rad14 au site de dommages lADN faits par les rayons UV. Htz1 est donc important pour la dtection de ces sites. Enfin, le recrutement nuclaire de Rad14 en prsence de metformine a considrablement augment. En absence de Rad14, le niveau de survie suite lexposition aux rayons UVA diminue significativement. Donc, Htz1 et Rad14 sont deux protines cls dans la protection contre les rayons UV apports par la metformine. En conclusion, avec les diffrents rsultats de cette tude, il est possible de dire que la metformine permet une forme de protection contre les rayons UVC et UVA.
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Streptococcus suis est un important pathogne porcin et agent zoonotique responsable de mningites et de septicmies. ce jour, les mcanismes impliqus dans la rponse immunitaire de lhte lors de linfection par S. suis sont peu connus; et il en est de mme pour les stratgies utilises par S. suis afin de djouer cette rponse. Laugmentation de lincidence et de la svrit des cas humains souligne le besoin dune meilleure comprhension des interactions entre S. suis et le systme immunitaire afin de gnrer une rponse immunitaire efficace contre ce pathogne. Les cellules dendritiques (DCs) sont de puissantes cellules prsentatrices dantignes qui stimulent les lymphocytes T et B, assurant la liaison entre limmunit inne et limmunit adaptative. Lobjectif principal de ce projet tait dvaluer le rle jou par diffrents facteurs de virulence de S. suis sur la modulation de la fonction des DCs et de la rponse T-dpendante. Nous avons examin leffet des facteurs cls pour la virulence de S. suis, dont la capsule polysaccharidique (CPS), les modifications de la paroi cellulaire (D-alanylation de lacide lipotichoque et N-dactylation du peptidoglycane) et la toxine suilysine, sur lactivation et la maturation de DCs murines drives de la moelle osseuse (bmDCs). Suite linfection par S. suis, les bmDCs sont actives et subissent un processus de maturation caractris par laugmentation de lexpression de molcules de co-stimulation et la production de cytokines pro-inflammatoires. La CPS est le principal facteur interfrant avec la production de cytokines, mme si les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine peuvent galement moduler la production de certaines cytokines. Enfin, la CPS, les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine interfrent avec la dposition du complment la surface des bactries et, en consquence, avec le killing dpendant du complment. Les rsultats ont t confirms laide de bmDCs porcines. Nous avons aussi voulu identifier les rcepteurs cellulaires impliqus dans la reconnaissance de S. suis par les DCs. Nous avons dmontr que la production de cytokines et lexpression des molcules de co-stimulation par les DCs sont fortement dpendantes de la signalisation par MyD88, suggrant que les DCs reconnaissent S. suis et deviennent actives majoritairement via la signalisation par les rcepteurs de type Toll (TLRs). En effet, on remarque une diminution de la production de plusieurs cytokines ainsi que de lexpression de certaines molcules de co-stimulation chez les DCs TLR2-/- ou TLR2-/- et TLR9-/- double ngatives. Finalement, le rcepteur NOD2 semblait jouer un rle partiel dans lactivation des DCs suite une infection par S. suis.Enfin, nous avons valu les consquences de la modulation des fonctions des DCs sur le dveloppement de la rponse T-dpendante. Les splnocytes totaux produisent plusieurs cytokines en rponse S. suis. Des analyses in vivo et ex vivo ont permis dobserver limplication des cellules T CD4+ et le dveloppement dune rponse de type T helper 1 (TH1) bien que la quantit de cytokines TH1 produites lors de linfection in vivo par S. suis demeure assez basse. La CPS de S. suis interfre avec la production de plusieurs cytokines par les cellules T in vitro. Exprimentalement, linfection induite par S. suis rsulte en de faibles niveaux de production danticorps anti-S. suis, mais aussi danticorps dirigs contre lovalbumine utilise comme antigne rapporteur. Cette interfrence est corrle avec la svrit des signes cliniques, suggrant que S. suis interfre avec le dveloppement dune rponse immunitaire adaptative approprie qui serait requise pour contrler la progression de linfection. Les rsultats de cette tude mneront une meilleure comprhension de la rponse immunitaire de lhte lors de linfection par S. suis.
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La voie de signalisation Ras/MAPK (Ras/mitogen-activated protein kinase) rgule une varit de protines intracellulaires qui jouent un rle important dans la croissance et la prolifration cellulaire. La rgulation inapproprie de cette voie de signalisation conduit au dveloppement de nombreux cancers comme le mlanome, qui est caractris par des mutations activatrices au niveau des gnes NRAS et BRAF. La protine kinase RSK (p90 ribosomal S6 kinase) est un composant central de la voie Ras/MAPK, mais son rle dans la croissance et la prolifration cellulaire nest pas bien compris. RSK a t montre pour participer la rsistance des mlanomes aux chimiothrapies, mais le mcanisme molculaire reste encore lucider. Nous montrons laide dun anticorps phospho-spcifique que MDM2 est phosphoryle en rponse des agonistes et des mutations oncogniques activant spcifiquement la voie Ras/MAPK. En utilisant des mthodes in vitro et in vivo, nous avons constat que RSK phosphoryle directement MDM2 sur les Srines 166 et 186, ce qui suggre que MDM2 est un substrat de RSK. La mutagnse dirige envers ces sites nous indique que ces rsidus rgulent lubiquitination de MDM2, suggrant que RSK rgule la stabilit de MDM2 et de p53. De plus, nous avons observ que linhibition de RSK conduit une augmentation du niveau protique de p53 aprs un dommage lADN dans les cellules de mlanomes. En conclusion, nos travaux suggrent un rle important de la protine kinase RSK dans la rgulation de MDM2 et de sa cible, p53. Ltude de ces mcanismes molculaires aidera mieux dfinir le rle de RSK dans la croissance tumorale, mais galement dans la rsistance aux agents chimiothrapeutiques.
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Les anomalies du tube neural (ATN) sont des anomalies dveloppementales o le tube neural reste ouvert (1-2/1000 naissances). Afin de prvenir cette maladie, une connaissance accrue des processus molculaires est ncessaire. Ltiologie des ATN est complexe et implique des facteurs gntiques et environnementaux. La supplmentation en acide folique est reconnue pour diminuer les risques de dvelopper une ATN de 50-70% et cette diminution varie en fonction du dbut de la supplmentation et de lorigine dmographique. Les gnes impliqus dans les ATN sont largement inconnus. Les tudes gntiques sur les ATN chez lhumain se sont concentres sur les gnes de la voie mtabolique des folates du leur rle protecteur dans les ATN et les gnes candidats infrs des souris modles. Ces derniers ont montr une forte association entre la voie non-canonique Wnt/polarit cellulaire planaire (PCP) et les ATN. Le gne Protein Tyrosine Kinase 7 est un membre de cette voie qui cause lATN svre de la craniorachischisis chez les souris mutantes. Ptk7 interagit gntiquement avec Vangl2 (un autre gne de la voie PCP), o les doubles htrozygotes montrent une spina bifida. Ces donnes font de PTK7 comme un excellent candidat pour les ATN chez lhumain. Nous avons re-squenc la rgion codante et les jonctions intron-exon de ce gne dans une cohorte de 473 patients atteints de plusieurs types dATN. Nous avons identifi 6 mutations rares (frquence alllique <1%) faux-sens prsentes chez 1.1% de notre cohorte, dont 3 sont absentes dans les bases de donnes publiques. Une variante, p.Gly348Ser, a agi comme un allle hypermorphique lorsqu'elle est surexprime dans le modle de poisson zbre. Nos rsultats impliquent la mutation de PTK7 comme un facteur de risque pour les ATN et supporte l'ide d'un rle pathogne de la signalisation PCP dans ces malformations.
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Le cycle glycrolipides/acides gras libres (GL/FFA) est une voie mtabolique cl qui relie le mtabolisme du glucose et des acides gras et il est compos de deux processus mtaboliques appels lipogense et lipolyse. Le cycle GL/FFA, en particulier la lipolyse des triglycrides, gnre diverses molcules de signalisation pour rguler la scrtion d'insuline dans les cellules bta pancratiques et la thermogense non-frissonnante dans les adipocytes. Actuellement, les lipides provenant spcifiquement de la lipolyse impliqus dans ce processus sont mal connus. Lhydrolyse des triglycrides dans les cellules est ralise par les actions successives de la triglycride lipase adipocytaire pour produire le diacylglycrol, ensuite par la lipase hormono-sensible pour produire le monoacylglycrol (MAG) et enfin par la MAG lipase (MAGL) qui relche du glycerol et des acides gras. Dans les cellules bta, la MAGL classique est trs peu exprime et cette tude a dmontr que lhydrolyse de MAG dans les cellules est principalement ralise par l'/-Hydrolase Domain-6 (ABHD6) nouvellement identifie. Linhibition dABHD6 par son inhibiteur spcifique WWL70, conduit une accumulation des 1-MAG longues chaines satures l'intrieur des cellules, accompagne dune augmentation de la scrtion d'insuline stimule par le glucose (GSIS). Baisser les niveaux de MAG en surexprimant ABHD6 dans la ligne cellulaire bta INS832/13 rduit la GSIS, tandis quune augmentation des niveaux de MAG par le knockdown dABHD6 amliore la GSIS. L'exposition aigu des monoacylglycrols exognes stimule la scrtion d'insuline de manire dose-dpendante et restaure la GSIS supprime par un inhibiteur de lipases appel orlistat. En outre, les souris avec une inactivation du gne ABHD6 dans tous les tissus (ABHD6-KO) et celles avec une inactivation du gne ABHD6 spcifiquement dans la cellule prsentent une GSIS stimule, et leurs lots montrent une augmentation de la production de monoacylglycrol et de la scrtion d'insuline en rponse au glucose. Linhibition dABHD6 chez les souris diabtiques (modle induit par de faibles doses de streptozotocine) restaure la GSIS et amliore la tolrance au glucose. De plus, les rsultats montrent que les MAGs non seulement amliorent la GSIS, mais potentialisent galement la scrtion dinsuline induite par les acides gras libres ainsi que la scrtion dinsuline induite par divers agents et hormones, sans altration de l'oxydation et l'utilisation du glucose ainsi que l'oxydation des acides gras. Nous avons dmontr que le MAG se lie la protine damorage des vsicules appele Munc13-1 et lactive, induisant ainsi lexocytose de l'insuline. Sur la base de ces observations, nous proposons que le 1-MAG chaines satures agit comme facteur de couplage mtabolique pour rguler la scrtion d'insuline et que ABHD6 est un modulateur ngatif de la scrtion d'insuline. En plus de son rle dans les cellules bta, ABHD6 est galement fortement exprim dans les adipocytes et son niveau est augment avec l'obsit. Les souris dpourvues globalement dABHD6 et nourris avec une dite riche en gras (HFD) montrent une faible diminution de la prise alimentaire, une diminution du gain de poids corporel et de la glycmie jeun et une amlioration de la tolrance au glucose et de la sensibilit l'insuline et ont une activit locomotrice accrue. En outre, les souris ABHD6-KO affichent une augmentation de la dpense nergtique et de la thermogense induite par le froid. En conformit avec ceci, ces souris prsentent des niveaux levs dUCP1 dans les adipocytes blancs et bruns, indiquant le brunissement des adipocytes blancs. Le phnotype de brunissement est reproduit dans les souris soit en les traitant de manire chronique avec WWL70 (inhibiteur dABHD6) ou des oligonuclotides anti-sense ciblant lABHD6. Les tissus adipeux blanc et brun isols de souris ABHD6-KO montrent des niveaux trs levs de 1-MAG, mais pas de 2-MAG. L'augmentation des niveaux de MAG soit par administration exogne in vitro de 1-MAG ou par inhibition ou dltion gntique dABHD6 provoque le brunissement des adipocytes blancs. Une autre vidence indique que les 1-MAGs sont capables de transactiver PPAR et PPAR et que l'effet de brunissement induit par WWL70 ou le MAG exogne est aboli par les antagonistes de PPAR et PPAR. Ladministration in vivo de lantagoniste de PPAR GW6471 des souris ABHD6-KO inverse partiellement les effets causs par linactivation du gne ABHD6 sur le gain de poids corporel, et abolit laugmentation de la thermogense, le brunissement du tissu adipeux blanc et l'oxydation des acides gras dans le tissu adipeux brun. Lensemble de ces observations indique que ABHD6 rgule non seulement lhomostasie de l'insuline et du glucose, mais aussi l'homostasie nergtique et la fonction des tissus adipeux. Ainsi, 1-MAG agit non seulement comme un facteur de couplage mtabolique pour rguler la scrtion d'insuline en activant Munc13-1 dans les cellules bta, mais rgule aussi le brunissement des adipocytes blancs et amliore la fonction de la graisse brune par l'activation de PPAR et PPAR. Ces rsultats indiquent que ABHD6 est une cible prometteuse pour le dveloppement de thrapies contre l'obsit, le diabte de type 2 et le syndrome mtabolique.
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La relocalisation et la degradation mediee par ubiquitination sont utilisees par la cellule pour controler la localisation et lexpression de ses proteines. LE3 ubiquitine ligase MARCH1 est implique dans la regulation post-traductionnelle de CMH-II et de CD86. Dans ce memoire, on propose un role additionnel a MARCH1. Nos resultats experimentaux nous portent a croire que MARCH1 pourrait moduler le metabolisme cellulaire en favorisant la relocalisation et la degradation denzymes impliquees dans la glycolyse. La grande majorite des cellules utilise la phosphorylation oxydative pour generer de lATP en presence doxygene. Dans un environnement hypoxique, cette derniere est non fonctionnelle et la cellule doit utiliser la glycolyse anaerobique pour produire son ATP. Une cellule cancereuse a des besoins energetiques superieurs en raison de laugmentation de sa biomasse et de sa proliferation incontrolee. Pour subvenir a ces besoins, elle maximise sa production denergie en modifiant son metabolisme; cest leffet Warburg. On retrouve dans les cellules immunitaires des modifications similaires au metabolisme cellulaire suite a un signal dactivation. Ici, nous montrons que la respiration mitochondriale maximale, la reserve respiratoire et la glycolyse maximale sont diminuees dans les cellules presentatrice dantigenes qui expriment MARCH1. Nous avons montre que MARCH1 etait localisable au niveau de la mitochondrie, ce qui lui permet dinteragir avec les enzymes de la glycolyse. Finalement, nous avons quantifie lexpression de Eno1 et de LDHB par Western Blot, pour montrer une augmentation de lexpression de ces enzymes en absence de MARCH1. A la lumiere de ces resultats, nous discutons des avantages que procure la diminution de lexpression de MARCH1 dans un contexte inflammatoire, suite a lactivation des cellules presentatrices dantigenes. Ce phenomene permettrait une presentation antigenique plus efficace, une augmentation de la production denergie et une meilleure resistance aux ROS produits lors de la reponse inflammatoire.
