The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota.

A prerequisite for establishment of mutualism between the host and the microbial community that inhabits the large intestine is the stringent mucosal compartmentalization of microorganisms. Microbe-loaded dendritic cells trafficking through lymphatics are arrested at the mesenteric lymph nodes, which constitute the firewall of the intestinal lymphatic circulation. We show in different mouse models that the liver, which receives the intestinal venous blood circulation, forms a vascular firewall that captures gut commensal bacteria entering the bloodstream during intestinal pathology. Phagocytic Kupffer cells in the liver of mice clear commensals from the systemic vasculature independently of the spleen through the liver's own arterial supply. Damage to the liver firewall in mice impairs functional clearance of commensals from blood, despite heightened innate immunity, resulting in spontaneous priming of nonmucosal immune responses through increased systemic exposure to gut commensals. Systemic immune responses consistent with increased extraintestinal commensal exposure were found in humans with liver disease (nonalcoholic steatohepatitis). The liver may act as a functional vascular firewall that clears commensals that have penetrated either intestinal or systemic vascular circuits.

TM6SF2 rs58542926 influences hepatic fibrosis progression in patients with non-alcoholic fatty liver disease.

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is an increasingly common condition, strongly associated with the metabolic syndrome, that can lead to progressive hepatic fibrosis, cirrhosis and hepatic failure. Subtle inter-patient genetic variation and environmental factors combine to determine variation in disease progression. A common non-synonymous polymorphism in TM6SF2 (rs58542926 c.449 C>T, p.Glu167Lys) was recently associated with increased hepatic triglyceride content, but whether this variant promotes clinically relevant hepatic fibrosis is unknown. Here we confirm that TM6SF2 minor allele carriage is associated with NAFLD and is causally related to a previously reported chromosome 19 GWAS signal that was ascribed to the gene NCAN. Furthermore, using two histologically characterized cohorts encompassing steatosis, steatohepatitis, fibrosis and cirrhosis (combined n=1,074), we demonstrate a new association, independent of potential confounding factors (age, BMI, type 2 diabetes mellitus and PNPLA3 rs738409 genotype), with advanced hepatic fibrosis/cirrhosis. These findings establish new and important clinical relevance to TM6SF2 in NAFLD.

Eliciting the mitochondrial unfolded protein response via NAD(+) repletion reverses fatty liver disease

With no approved pharmacological treatment, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is now the most common cause of chronic liver disease in western countries and its worldwide prevalence continues to increase along with the growing obesity epidemic. Here we show that a high-fat high-sucrose (HFHS) diet, eliciting chronic hepatosteatosis resembling human fatty liver, lowers hepatic NAD(+) levels driving reductions in hepatic mitochondrial content, function and ATP levels, in conjunction with robust increases in hepatic weight, lipid content and peroxidation in C57BL/6J mice. In an effort to assess the effect of NAD(+) repletion on the development of steatosis in mice, nicotinamide riboside (NR), a precursor for NAD(+) biosynthesis, was given to mice concomitant, as preventive strategy (NR-Prev), and as a therapeutic intervention (NR-Ther), to a HFHS diet. We demonstrate that NR prevents and reverts NAFLD by inducing a SIRT1- and SIRT3-dependent mitochondrial unfolded protein response (UPR(mt) ), triggering an adaptive mitohormetic pathway to increase hepatic β-oxidation and mitochondrial complex content and activity. The cell-autonomous beneficial component of NR treatment was revealed in liver-specific Sirt1 KO mice (Sirt1(hep-/-) ), while Apolipoprotein E-deficient (Apoe(-/-) ) mice challenged with a high-fat high-cholesterol diet (HFC), affirmed the use of NR in other independent models of NAFLD. CONCLUSION Our data warrant the future evaluation of NAD(+) boosting strategies to manage the development or progression of NAFLD. This article is protected by copyright. All rights reserved.

Significant lethality following liver resection in A20 heterozygous knockout mice uncovers a key role for A20 in liver regeneration

Hepatic expression of A20, including in hepatocytes, increases in response to injury, inflammation and resection. This increase likely serves a hepatoprotective purpose. The characteristic unfettered liver inflammation and necrosis in A20 knockout mice established physiologic upregulation of A20 as integral to the anti-inflammatory and anti-apoptotic armamentarium of hepatocytes. However, the implication of physiologic upregulation of A20 in modulating hepatocytes' proliferative responses following liver resection remains controversial. To resolve the impact of A20 on hepatocyte proliferation and the liver's regenerative capacity, we examined whether decreased A20 expression, as in A20 heterozygous knockout mice, affects outcome following two-third partial hepatectomy. A20 heterozygous mice do not demonstrate a striking liver phenotype, indicating that their A20 expression levels are still sufficient to contain inflammation and cell death at baseline. However, usually benign partial hepatectomy provoked a staggering lethality (>40%) in these mice, uncovering an unsuspected phenotype. Heightened lethality in A20 heterozygous mice following partial hepatectomy resulted from impaired hepatocyte proliferation due to heightened levels of cyclin-dependent kinase inhibitor, p21, and deficient upregulation of cyclins D1, E and A, in the context of worsened liver steatosis. A20 heterozygous knockout minimally affected baseline liver transcriptome, mostly circadian rhythm genes. Nevertheless, this caused differential expression of >1000 genes post hepatectomy, hindering lipid metabolism, bile acid biosynthesis, insulin signaling and cell cycle, all critical cellular processes for liver regeneration. These results demonstrate that mere reduction of A20 levels causes worse outcome post hepatectomy than full knockout of bona fide liver pro-regenerative players such as IL-6, clearly ascertaining A20's primordial role in enabling liver regeneration. Clinical implications of these data are of utmost importance as they caution safety of extensive hepatectomy for donation or tumor in carriers of A20/TNFAIP3 single nucleotide polymorphisms alleles that decrease A20 expression or function, and prompt the development of A20-based liver pro-regenerative therapies.

Phenotypic alterations in insulin-deficient mutant mice

Two mouse insulin genes, Ins1 and Ins2, were disrupted and lacZ was inserted at the Ins2 locus by gene targeting. Double nullizygous insulin-deficient pups were growth-retarded. They did not show any glycosuria at birth but soon after suckling developed diabetes mellitus with ketoacidosis and liver steatosis and died within 48 h. Interestingly, insulin deficiency did not preclude pancreas organogenesis and the appearance of the various cell types of the endocrine pancreas. The presence of lacZ expressing β cells and glucagon-positive α cells was demonstrated by cytochemistry and immunocytochemistry. Reverse transcription-coupled PCR analysis showed that somatostatin and pancreatic polypeptide mRNAs were present, although at reduced levels, accounting for the presence also of δ and pancreatic polypeptide cells, respectively. Morphometric analysis revealed enlarged islets of Langherans in the pancreas from insulin-deficient pups, suggesting that insulin might function as a negative regulator of islet cell growth. Whether insulin controls the growth of specific islet cell types and the molecular basis for this action remain to be elucidated.

Vascular tumors in livers with targeted inactivation of the von Hippel–Lindau tumor suppressor

von Hippel–Lindau (VHL) disease is a pleomorphic familial tumor syndrome that is characterized by the development of highly vascularized tumors. Homozygous disruption of the VHL gene in mice results in embryonic lethality. To investigate VHL function in the adult we have generated a conditional VHL null allele (2-lox allele) and null allele (1-lox allele) by Cre-mediated recombination in embryonic stem cells. We show here that mice heterozygous for the 1-lox allele develop cavernous hemangiomas of the liver, a rare manifestation of the human disease. Histologically these tumors were associated with hepatocellular steatosis and focal proliferations of small vessels. To study the cellular origin of these lesions we inactivated VHL tissue-specifically in hepatocytes. Deletion of VHL in the liver resulted in severe steatosis, many blood-filled vascular cavities, and foci of increased vascularization within the hepatic parenchyma. These histopathological changes were similar to those seen in livers from mice heterozygous for the 1-lox allele. Hypoxia-inducible mRNAs encoding vascular endothelial growth factor, glucose transporter 1, and erythropoietin were up-regulated. We thus provide evidence that targeted inactivation of mouse VHL can model clinical features of the human disease and underline the importance of the VHL gene product in the regulation of hypoxia-responsive genes in vivo.

Methionine adenosyltransferase 1A knockout mice are predisposed to liver injury and exhibit increased expression of genes involved in proliferation

Liver-specific and nonliver-specific methionine adenosyltransferases (MATs) are products of two genes, MAT1A and MAT2A, respectively, that catalyze the formation of S-adenosylmethionine (AdoMet), the principal biological methyl donor. Mature liver expresses MAT1A, whereas MAT2A is expressed in extrahepatic tissues and is induced during liver growth and dedifferentiation. To examine the influence of MAT1A on hepatic growth, we studied the effects of a targeted disruption of the murine MAT1A gene. MAT1A mRNA and protein levels were absent in homozygous knockout mice. At 3 months, plasma methionine level increased 776% in knockouts. Hepatic AdoMet and glutathione levels were reduced by 74 and 40%, respectively, whereas S-adenosylhomocysteine, methylthioadenosine, and global DNA methylation were unchanged. The body weight of 3-month-old knockout mice was unchanged from wild-type littermates, but the liver weight was increased 40%. The Affymetrix genechip system and Northern and Western blot analyses were used to analyze differential expression of genes. The expression of many acute phase-response and inflammatory markers, including orosomucoid, amyloid, metallothionein, Fas antigen, and growth-related genes, including early growth response 1 and proliferating cell nuclear antigen, is increased in the knockout animal. At 3 months, knockout mice are more susceptible to choline-deficient diet-induced fatty liver. At 8 months, knockout mice developed spontaneous macrovesicular steatosis and predominantly periportal mononuclear cell infiltration. Thus, absence of MAT1A resulted in a liver that is more susceptible to injury, expresses markers of an acute phase response, and displays increased proliferation.

Efeito da cirurgia bariátrica sobre parâmetros clínicos, laboratoriais e fatores de risco cardiovascular

Introdução - Na prevenção primária das doenças cardiovasculares, a adoção de estilo de vida saudável representa uma das estratégias mais importantes. Entretanto, baixos índices de adesão e o abandono da dieta constituem obstáculo importante ao tratamento. Neste sentido, as intervenções cirúrgicas surgiram como um mecanismo promotor da restrição alimentar e têm ganhado importância não só pelo tratamento da obesidade como também no controle dos fatores de risco cardiovascular e na possível redução da mortalidade. Através de estudos clínicos foi possível observar que estas estratégias cirúrgicas promovem profundas modificações estruturais no trato gastrointestinal gerando aumento da saciedade e da sensibilidade à insulina. Em especial para os pacientes diabéticos, por si só associados a maior risco cardiovascular, as cirurgias bariátricas seriam capazes de promover um efeito muito intenso e agudo sobre os marcadores relacionados ao desenvolvimento da aterosclerose. Um evento muito definido no tempo como uma intervenção cirúrgica pode ser muito útil para o estudo e identificação de mecanismos que ainda não estão completamente estabelecidos no processo aterosclerótico. Objetivos - Analisar o comportamento das variáveis laboratoriais, clínicas e estruturais relacionadas ao desenvolvimento e progressão da aterosclerose em indivíduos diabéticos submetidos à cirurgia bariátrica. Métodos - Foram incluídos vinte voluntários diabéticos refratários ao tratamento clínico e que apresentavam obesidade abdominal. Deste grupo, metade foi aleatoriamente selecionada para realização da cirurgia bariátrica e metade foi mantida em tratamento clínico otimizado. Todos os participantes foram submetidos a exames clínicos e bioquímicos nas mesmas ocasiões, até trinta dias antes da cirurgia, três e vinte e quatro meses após a cirurgia. Nestas ocasiões além do perfil lipídico e da glicemia, determinamos os hormônios incretínicos, adipocinas. A avaliação da quantidade de gordura epicárdica e a presença de esteatose hepática será realizada somente após dois anos de seguimento em conjunto com as demais variáveis,. Foram incluídos também 10 indivíduos saudáveis e com IMC dentro da normalidade, como parte do grupo controle. Estes indivíduos foram submetidos à coleta de sangue em dois momentos para avaliação dos mesmos metabólitos. Resultados - No momento pré-intervenção os indivíduos do grupo cirúrgico e clinico eram diferentes em relação ao IMC, Glicemia e Triglicérides, sendo assim, os resultados obtidos foram ajustados minimizando o impacto destas diferenças. Após o seguimento de 3 meses, o grupo cirúrgico apresentou redução significativa nos valores de peso, IMC (33,4 ± 2,6 vs. 27,4±2,8 kg/m2, p < 0,001), HbA1c (9,26 ± 2,12 vs. 6,18±0,63%, p < 0,001), CT (182,9 ± 45,4 vs. 139,8 ± 13 mg/dl, p < 0,001), HDL (33,1 ± 7,7 vs. 38,4 ± 10,6 mg/dL, p < 0,001), TG (369,5 ± 324,6 vs. 130,8 ± 43,1 mg/dL, p < 0,001), Pro-insulina (12.72±9,11 vs. 1,76±1,14 pM, p < 0,001), RBP-4 (9,85±2,53 vs. 7,3±1,35 ng/ml, p < 0,001) e CCK (84,8±33,2 vs. 79,9 ± 31,1, ng/ml, p < 0,001), houve também aumento significativo nos níveis de HDL-colesterol (33,1 ± 7,7 vs. 38,4 ± 10,6 mg/dL, p < 0,001), Glucagon (7,4 ± 7,9 vs. 10,2±9,7 pg/ml, p < 0,001) e FGF- 19 (74,1 ± 45,8 vs. 237,3 ± 234 pg/ml, p=0,001). Um dado interessante foi que os valores de Pro-insulina, RBP-4, HbA1c e HDL- colesterol no grupo cirúrgico atingiram valores similares àqueles do grupo controle três meses após a intervenção, sendo que o FGF-19 apresentava valor duas vezes maior do que o encontrado no grupo de indivíduos saudáveis (237 ± 234 vs. 98 ± 102,1 pg/ml). O grupo clínico não apresentou variação nas variáveis clinicas, apenas nos valores de glucagon com redução significativa no período pós-intervenção (18,1 ± 20,7 vs. 16,8 ± 18,4 pg/ml, p < 0,001). Conclusão - Concluímos que indivíduos diabéticos descompensados e refratários ao tratamento clínico, quando submetidos à cirurgia bariátrica, apresentam uma alteração profunda do ponto de vista clínico, metabólico e hormonal, em relação ao indivíduos de mesmo perfil mantidos em tratamento clínico otimizado. Esta importante alteração, observada já com três meses após a intervenção, pode representar uma importante redução do risco cardiovascular nestes indivíduos. Individualmente, a notável modificação dos valores de FGF-19 associadas à intervenção devem ser estudadas com maior profundidade para compreensão de seu significado e sua potencial utilidade como marcador ou como um dos protagonistas no mecanismo de prevenção cardiovascular

PGC-1 alfa como regulador inflamatório na esteato-hepatite não-alcoólica

A doença hepática gordurosa não-alcoólica (NAFLD, do inglês) é a manifestação clínica hepática da síndrome metabólica, cuja incidência aumenta consideravelmente em todo o mundo. A NAFLD pode progredir para um estado de esteatohepatite não-alcoólica (NASH, do inglês), caracterizado por inflamação hepatocelular, com ou sem fibrose. Dados na literatura mostram que o coativador-1 alfa do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama (PGC-1alfa), além de estar envolvido em diversos processos metabólicos, representa uma estratégia terapêutica promissora na modulação da inflamação. Neste projeto investigamos as alterações inflamatórias no fígado induzida por dieta hiperlipídica e o papel do PGC-1alfa nesse processo. Camundongos C57black/6 receberam dieta hiperlipídica contendo 30% de gordura por 10 semanas. O peso dos animais foi avaliado semanalmente. Após a eutanásia, o tecido adiposo intra-abdominal (retroperitoneal e periepididimal) foi coletado e pesado. Analisamos o perfil glicêmico e lipídico sérico e expressão de genes envolvidos no metabolismo glicêmico e lipídico. Avaliou-se também o aspecto histológico e a inflamação do tecido hepático por quantificação das citocinas IL-6, TNF-alfa e IL-1beta. A dieta rica em gordura conduziu a um aumento dos depósitos de gordura intra-abdominal, hiperglicemia e hiperlipidemia. Os animais também apresentavam esteatohepatite, com aumento de citocinas pró-inflamatórias e diminuição na expressão de PGC-1alfa no tecido hepático. O envolvimento do PGC-1alfa na produção de mediadores inflamatórios por hepatócitos foi avaliado em células HepG2 utilizando RNA de interferência (RNAi). O knockdown da expressão de PGC-1alfa causou aumento na expressão e liberação de IL-6 em hepatócitos via aumento na fosforilação de IkBalfa e consequente ativação do NFkB. Portanto, nossos dados mostram que o PGC-1alfa inibe a produção de mediadores inflamatórios (IL-6) em hepatócitos, e fornecem novas evidências das conexões existentes entre as vias metabólicas e imunes

Avaliação da gordura hepática utilizando ressonância magnética

A esteatose hepática, que se caracteriza pelo acúmulo excessivo de gordura nas células do fígado, é um problema que vem preocupando a comunidade médico-científica, pois sua incidência vem aumentando a nível global, com expectativa de se tornar a doença crônica hepática de maior predominância em várias partes do mundo. Apesar de ser considerada uma doença benigna, a esteatose pode evoluir para doenças mais graves como cirrose, fibrose avançada, esteato hepatite (com ou sem fibrose) ou carcinoma. Entretanto, é potencialmente reversível, mesmo em quadros mais graves, o que reforça a urgência de se desenvolver métodos confiáveis para detecção e avaliação, inclusive ao longo de tratamento. Os métodos atuais para diagnóstico e quantificação da gordura hepática ainda são falhos: com a ultrassonografia não se é capaz de realizar quantificação; a tomografia computadorizada faz uso de radiação ionizante; a punção (biópsia), considerada o padrão ouro, é precisa, mas invasiva e pontual. A Ressonância Magnética (RM), tanto com espectroscopia (MRS) como com imagem (MRI), são alternativas completamente não invasivas, capazes de fornecer o diagnóstico e quantificação da gordura infiltrada no fígado. Entretanto, os trabalhos encontrados na literatura utilizam sequências de pulsos desenvolvidas especialmente para esse fim, com métodos de pós-processamento extremamente rebuscados, o que não é compatível com o estado atual dos equipamentos encontrados em ambientes clínicos nem mesmo ao nível de experiência e conhecimento das equipes técnicas que atuam em clínicas de radiodiagnóstico. Assim, o objetivo central do presente trabalho foi avaliar o potencial da RM como candidato a método de diagnóstico e de quantificação de gordura em ambientes clínicos, utilizando, para isso, sequências de pulsos convencionais, disponíveis em qualquer sistema comercial de RM, com protocolos de aquisição e processamento compatíveis com àqueles realizados em exames clínicos, tanto no que se refere à simplicidade como ao tempo total de aquisição. Foram avaliadas diferentes abordagens de MRS e MRI utilizando a biópsia hepática como padrão de referência. Foram avaliados pacientes portadores de diabetes tipo II, que apresentam alta prevalência de esteatose hepática não alcoólica, além de grande variabilidade nos percentuais de gordura. Foram realizadas medidas de correlação, acurácia, sensibilidade e especificidade de cada uma das abordagens utilizadas. Todos os métodos avaliados apresentaram alto grau de correlação positiva (> 87%) com os dados obtidos de maneira invasiva, o que revela que os valores obtidos utilizando RM estão de acordo com aquilo observado pela biópsia hepática. Muito embora os métodos de processamento utilizados não sejam tão complexos quanto seriam necessários caso uma quantificação absoluta fosse desejada, nossas análises mostraram alta acurácia, especificidade e sensibilidade da RM na avaliação da esteatose. Em conclusão, a RM se apresenta, de fato, como uma excelente candidata para avaliar, de forma não invasiva, a fração de gordura hepática, mesmo quando se considera as limitações impostas por um ambiente clínico convencional. Isso sugere que essas novas metodologias podem começar a migrar para ambientes clínicos sem depender das sequências complexas e dos processamentos exóticos que estão descritos na literatura mais atual.

Non-alcoholic fatty liver disease associated with hypobetalipoproteinemia: report of three cases and a novel mutation in APOB gene

Background: Non-alcoholic fatty liver disease, the leading cause of chronic liver disease in children, is defined by hepatic fat infiltration >5% of hepatocytes, in the absence of excessive alcohol intake, evidence of viral, autoimmune or drug-induced liver disease. Conditions like rare genetic disorders must be considered in the differential diagnosis. Case Report: Two male brothers, and a non-related girl, all overweight, had liver steatosis. One of the brothers and the girl had elevated transaminases; all three presented with low total cholesterol, low density lipoproteins and very low density lipoproteins cholesterol levels, hypotriglyceridemia and low apolipoprotein B. A liver biopsy performed in the brother with citolysis confirmed steatohepatitis and the molecular study of apolipoprotein B gene showed a novel homozygous mutation (c.9353dup p.Asn3118Lysfs17). Patients with cytolysis lost weight, however liver steatosis persists. Conclusion: Fatty liver disease might be a consequence of hypobetalipoproteinemia. Evidence is scarce due to low number of reported cases.

Nutrição na fisiopatologia e tratamento do fígado gordo não-alcoólico

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014

Pro-fibrotic polymorphisms predictive of advanced liver fibrosis in the severely obese

Background/Aims: Insulin resistance and systemic hypertension are predictors of advanced fibrosis in obese patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Genetic factors may also be important. We hypothesize that high angiotensinogen (AT) and transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) producing genotypes increase the risk of liver fibrosis in obese subjects with NAFLD. Methods: One hundred and five of 130 consecutive severely obese patients having a liver biopsy at the time of laparoscopic obesity surgery agreed to have genotype analysis. Influence of specific genotype or combination of genotypes on the stage of hepatic fibrosis was assessed after controlling for known risk factors. Results: There was no fibrosis in 70 (67%), stages 1-2 in 21 (20%) and stages 3-4 fibrosis in 14 (13%) of subjects. There was no relationship between either high AT or TGF-beta1 producing genotypes alone and hepatic fibrosis after controlling for confounding factors. However, advanced hepatic fibrosis occurred in five of 13 subjects (odds ratio 5.7, 95% confidence interval 1.5-21.2, P = 0.005) who inherited both high AT and TGF-beta1 producing polymorphisms. Conclusions: The combination of high AT and TGF-beta1 producing polymorphisms is associated with advanced hepatic fibrosis in obese patients with NAFLD. These findings support the hypothesis that angiotensin II stimulated TGF-beta1 production may promote hepatic fibrosis. (C) 2003 European Association for the Study of the Liver. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.

Modest weight loss and physical activity in overweight patients with chronic liver disease results in sustained improvements in alanine aminotransferase, fasting insulin, and quality of life

Background and aim: Obesity is a risk factor for progression of fibrosis in chronic liver diseases such as non-alcoholic fatty liver disease and hepatitis C. The aim of this study was to investigate the longer term effect of weight loss on liver biochemistry, serum insulin levels, and quality of life in overweight patients with liver disease and the effect of subsequent weight maintenance or regain. Patients: Thirty one patients completed a 15 month diet and exercise intervention. Results: On completion of the intervention, 21 patients (68%) had achieved and maintained weight loss with a mean reduction of 9.4 (4.0)% body weight. Improvements in serum alanine aminotransferase (ALT) levels were correlated with the amount of weight loss (r=0.35, p=0.04). In patients who maintained weight loss, mean ALT levels at 15 months remained significantly lower than values at enrolment (p=0.004), while in regainers (n=10), mean ALT levels at 15 months were no different to values at enrolment (p=0.79). Improvements in fasting serum insulin levels were also correlated with weight loss (r=0.46, p=0.04), and subsequent weight maintenance sustained this improvement. Quality of life was significantly improved after weight loss. Weight maintainers sustained recommended levels of physical activity and had higher fasting insulin levels (p=0.03) at enrolment than weight regainers. Conclusion: In summary, these findings demonstrate that maintenance of weight loss and exercise in overweight patients with liver disease results in a sustained improvement in liver enzymes, serum insulin levels, and quality of life. Treatment of overweight patients should form an important component of the management of those with chronic liver disease.