Identidade e propriedades de isolados de potyvírus provenientes de Capsicum spp.

Vinte isolados virais provenientes de Capsicum spp. foram coletados em Minas Gerais, São Paulo, Espírito Santo e Rio de Janeiro visando definir a etiologia dos mosaicos. Para a caracterização biológica realizou-se teste de gama de hospedeiros e inoculação em cultivares diferenciadoras de pimentão (Capsicum annuum). Dois isolados provenientes de batata (Solanum tuberosum) (PVY N-BR e PVY O-BR) foram utilizados como controles. Os resultados indicaram considerável grau de variabilidade biológica entre os isolados, embora todos tenham sido identificados preliminarmente como Potato virus Y (PVY). A reação das cultivares diferenciadoras classificou os isolados como patótipo 1 ou 1.2 de PVY. Anti-soros foram produzidos a partir de partículas virais purificadas de um isolado fraco e um forte. O uso desses anti-soros em ELISA indireto levou a resultados positivos contra os isolados testados. Os anti-soros reagiram também contra PVY N-BR e PVY O-BR, embora este último tenha apresentado reação mais fraca. Para caracterização molecular, seqüenciaram-se os genes da polimerase (NIb) e da proteína capsidial (cp), e da região 3' não-traduzida (3'NTR) de isolados biologicamente distintos. A análise filogenética confirmou a identidade de seis isolados como Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), um potyvírus descrito recentemente infetando pimentão no Brasil. Esse resultado sugere que o PepYMV pode ser a espécie de potyvírus predominante em Capsicum spp. no Brasil. O fato de isolados de PepYMV apresentarem gama de hospedeiros semelhante à do PVY, e de os dois vírus apresentarem relacionamento sorológico, ressalta a utilidade da análise molecular para a classificação de potyvírus provenientes de Capsicum spp.

Expressão em Escherichia coli da proteína capsidial do Watermelon mosaic virus e produção de anti-soro

Um anti-soro policlonal específico para Watermelon mosaic virus (WMV) foi produzido por meio da imunização de coelhos com proteína capsidial purificada, expressa in vitro em células de Escherichia coli. O gene cp foi amplificado via RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos, a partir de RNA viral extraído de preparações virais concentradas. O fragmento amplificado foi clonado em pBLUESCRIPT KS+ e completamente seqüenciado para confirmação de sua identidade e integridade. Em seguida, o fragmento foi subclonado no vetor de expressão pRSET-A. Plasmídeos recombinantes foram utilizados para a expressão da proteína capsidial em E. coli BL21::DE3. A proteína foi purificada por meio de cromatografia de afinidade em coluna de Ni+-NTA, a partir de proteínas totais extraídas de E. coli. Uma vez purificada, a proteína foi quantificada e utilizada para imunização dos coelhos. O anti-soro foi testado quanto a sua especificidade e sensibilidade em testes de Western blot, DAS-ELISA, imunodifusão e ELISA indireto. Todos os testes demonstraram que o anti-soro produzido a partir da expressão in vitro da proteína capsidial é altamente específico para a detecção do WMV em extratos foliares, não tendo sido observada nenhuma reação heteróloga interespecífica.

Caracterização da região 5'-terminal de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus

O presente trabalho caracteriza a região 5'-terminal de um isolado do Southern bean mosaic virus encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP). O RNA foi extraído de partículas virais purificadas e submetido a RT-PCR usando oligonucleotídeos desenhados para amplificar cerca de 590 nt da região 5'-terminal do RNA viral. Foi obtido um fragmento de tamanho esperado que, após clonagem e seqüenciamento, mostrou a existência de uma região não codificadora com 92 nt e a primeira ORF, começando no primeiro AUG (posição 93) e terminando no códon UGA na posição 534. Na região não codificadora foi detectado um segmento parcialmente complementar ao RNA ribossomal 18S. A ORF1 codifica uma proteína de 147 aminoácidos com massa molecular estimada de 17080 Da. A extremidade 3' da ORF1 sobrepõe a extremidade 5' da ORF2 em 34 nucleotídeos. Os resultados obtidos indicam que a região 5'-terminal do RNA do SBMV-SP é similar ao isolado Arkansas (SBMV-ARK) descrito na América do Norte.

Análise filogenética de potyvírus causando endurecimento dos frutos do maracujazeiro no Nordeste do Brasil

Amostras foliares de plantas de maracujá-amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa) com sintomas típicos de endurecimento dos frutos foram coletadas nos estados de Pernambuco, Paraíba e Sergipe. A infecção viral foi comprovada por meio de teste sorológico e gama de hospedeiros. Os seis isolados virais obtidos foram capazes de infetar várias espécies testadas, porém apresentando diferenças na intensidade dos sintomas induzidos nessas hospedeiras. Teste de ELISA indireto demonstrou que os isolados obtidos a partir de plantas de maracujá são sorologicamente relacionados entre si e com o potyvírus Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV). A seqüência de aminoácidos da proteína capsidial foi determinada para os seis isolados. A comparação dessas seqüências com as de outros potyvírus indicou uma identidade máxima com isolados de CABMV (86 a 94%). A identidade com isolados de Passionfruit woodiness virus (PWV) foi de 68 a 76%. Análise filogenética realizada a partir das seqüências de aminoácidos agrupou os isolados em estudo junto a isolados de CABMV, distante de isolados de PWV. Em conjunto, os resultados indicam que os isolados de maracujá analisados constituem na verdade uma estirpe do CABMV.

Caracterização da região 3'-terminal do genoma de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus

O presente trabalho caracteriza a região 3'-terminal do genoma de um isolado do Southern bean mosaic virus encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP). O RNA foi extraído de partículas virais purificadas e submetido a RT-PCR usando oligonucleotídeos desenhados para amplificar 972 nt da região 3'-terminal do RNA viral. Foi obtido fragmento de tamanho esperado que inclui o gene da proteína capsidial e a região 3'-terminal não codificadora. O gene da proteína capsidial (ORF4) contém 801 nucleotídeos, incluindo-se o códon de terminação UGA, com seqüência deduzida de 266 aminoácidos e massa molecular estimada de 28.800 Da. Sessenta e um aminoácidos terminais da ORF2 estão sobrepostos na ORF4. O "sinal de localização nuclear", encontrado dentro do "Domínio R" na região 5'-terminal da ORF4 de alguns sobemovírus, não foi identificado no SBMV-SP. Esse dado pode explicar a ausência de partículas virais do SBMV-SP no núcleo celular. A seqüência do SBMV-SP apresentou identidade de nucleotídeos e aminoácidos de, respectivamente, 91% e 93% com o isolado "Arkansas" (SBMV-ARK) descrito nos EUA. Os resultados obtidos indicam que o SBMV-SP e o SBMV-ARK são isolados muito proximamente relacionados.

Viróides e virusóides: relíquias do mundo de RNA

Até meados do século XX, os vírus eram considerados os representantes mais simples da escala biológica. A descoberta dos RNAs satélites e dos viróides por volta de 1970 foi surpreendente, pois comprovou-se a existência de uma nova classe de moléculas auto-replicativas ainda mais simples, denominada agentes sub-virais. Há indícios de que os viróides e virusóides (que formam uma classe de RNAs satélites), teriam feito parte do "Mundo de RNA" (que precedeu o mundo atual baseado no DNA e proteínas), podendo ser considerados fósseis moleculares dessa era antiga. A simplicidade desses agentes sub-virais e o fato de que a molécula de RNA deve interagir diretamente com fatores do hospedeiro para o desenvolvimento do seu ciclo infeccioso colocam esses patógenos como um modelo para o estudo de processos metabólicos celulares. Nos últimos anos, tem-se observado um volume grande de publicações visando elucidar aspectos da interação viróide/hospedeiro, como os mecanismos da patogênese, movimento dos viróides nas plantas hospedeiras, silenciamento gênico e atividades das ribozimas. Mudanças recentes ocorridas na taxonomia desses patógenos com a criação de famílias, gêneros e espécies, além da descoberta de novos viróides, também têm sido verificadas. A presente revisão visa atualizar o leitor quanto aos recentes avanços nas pesquisas com viróides, principalmente na taxonomia, filogenia e em vários aspectos moleculares da interação viróide/hospedeiro. Estão incluídas também algumas características dos virusóides e sua relação evolutiva com os viróides.

Detecção e análise da variabilidade de seqüências do Banana streak virus (BSV) em bananeiras no Brasil

A técnica de PCR utilizando-se "primers" degenerados para o gênero Badnavirus foi utilizada para a detecção e análise da variabilidade de seqüências do Banana streak virus (BSV) provenientes de bananeiras. A partir desta metodologia seqüências do vírus puderam ser detectadas em cultivares diplóides (AA), triplóides (AAA; AAB) e tetraplóides (AAAB). Foram encontrados quatro padrões de seqüência do BSV (estirpes BSVBR-1, BSVBR-2, BSVBR-3 e BSVBR-4), diferenciadas através da análise do perfil eletroforético das amostras amplificadas. A estirpe BSVBR-1 prevalece nos estados do Acre, Amazonas, Bahia, Ceará, Goiás, Minas Gerais, Piauí, Rio de Janeiro, Rondônia, Santa Catarina, e São Paulo, enquanto que, a estirpe BSVBR-2 foi encontrada em amostras oriundas do Amazonas e do Ceará. As estirpes BSVBR-3 e BSVBR-4 foram encontradas apenas no Ceará. Este trabalho revela a presença de diferentes estirpes do BSV no Brasil, bem como a existência de cultivares de bananeiras sadias e livres de seqüências virais do BSV integradas ao seu genoma.

Variabilidade biológica de isolados do Citrus leprosis virus (CiLV) oriundos de cultivares de laranjeira

A leprose, causada pelo Citrus leprosis virus (CiLV), é uma das principais doenças presentes em pomares cítricos fluminenses. O objetivo deste trabalho foi comparar o quadro sintomatológico desenvolvido por isolados de CiLV obtidos de cultivares comerciais de laranjeira (Lima, Pêra e Seleta), inoculados mecanicamente em Chenopodium amaranticolor, em três diluições. Após cinco a sete dias da inoculação foram observadas lesões necróticas, com pequeno halo clorótico quando observadas contra a luz. O maior número de lesões, nas três diluições, foi obtido do isolado de 'Seleta', seguido por 'Pêra' e 'Lima'. A melhor diluição utilizada para a observação das lesões foi de 1:10. Os resultados demonstram uma possível variabilidade biológica entre os isolados virais e/ou uma menor ou maior replicação viral, dependendo da cultivar, indicando um possível mecanismo de resistência da planta ao vírus.

Diagnóstico e Condutas Dermatológicas em uma Unidade Básica de Saúde

A frequência de dermatoses é alta, apresentando grande impacto na qualidade de vida dos pacientes. Contudo, há poucas políticas públicas nesta área de saúde, e o tempo destinado ao ensino dermatológico na graduação médica é restrito. Objetivos Definir as hipóteses diagnósticas e as condutas mais frequentes adotadas nas consultas realizadas em uma Unidade Básica de Saúde (UBS). Métodos Foram utilizados cadernos de registro de atendimento da UBS para análise de variantes como idade, sexo, diagnóstico, conduta e encaminhamento dos pacientes. Os dados foram analisados estatisticamente pelo programa SPSS 15.0. Resultados As hipóteses diagnósticas mais frequentes foram: eczemas, tumores benignos, transtornos pigmentares, onicopatias, infecções fúngicas, bacterianas e virais, lesões acneiformes foliculares e eritematodescamativas. Conclusão As hipóteses diagnósticas mais frequentes nas consultas de um médico generalista diferem daquelas feitas pelo especialista. Os resultados deste estudo deverão promover uma discussão sobre o ensino da Dermatologia nos cursos de Medicina.

Vaporização a laser do cervix para tratamento da neoplasia intraepitelial cervical

O câncer cérvico-uterino é muito comum em vários países da América Latina. As estatísticas de mortalidade e as taxas de incidência demonstram a sua real importância. O cânver cérvico-uterino freqüentemente é uma doença progressiva iniciada com mudanças intra-epiteliais, que podem se transformar em um processo invasivo, sendo o nosso objetivo tratar precocemente estas lesões quando ainda é possível a cura de 100%. Em nosso estudo prospectivo foram selecionadas 21 pacientes com neoplasia cervical intra-epitelial reatreadas pela citplogia e diagnosticadas pela histopatologia após biópsia dirigida pela colposcopia. O método terapêutico empregado foi a vaporização a laser com o CO2. Tiveram como pré-requisito os seguintes critérios: informação segura pela colposcopia da zona de transformação e afastar a presença de câncer invasivo; a neoplasia epitelial cervical deve ocupar a ectocervix sem nenhuma extensão para o canal cervical e correlação positiva entre a citologia, colposcopia e histologia. O uso de laser CO2 com microscópio permitiu precisão na aplicação e com vantagens de ser um procedimento ambulatorial diminuindo estresse cirúrgico das pacientes. Foi realizado sem anestesia e com duração média de 15 minutos. A cicatrização completou-se em torno de três semanas e com cuidados operatórios mínimos. Somente dois casos tiveram sangramento vaginal discreto no quinto e décimo dia de pós-operatório, resolvido com tamponamento vaginal por 24 horas. A colposcopia, cirurgia e o seguimento foram feitos pelo autor, tendo uma paciente sido submetida a uma segunda vaporização no quinto mês de controle. Somente uma paciente teve recidiva no 26° mês de seguimento e complementará o tratamento. As vinte outras restantes estão em controle sem recidiva de doença. Em vista dos resultados obtivemos um percentual de cura de 95%, que coincide com a literatura. O uso de laser CO2 no tratamento das neoplasias cervicais intra-epiteliais (NIC) ou virais tem sido estimulado como uma alternativa digna de ser seguida pelas seguintes razões: cirurgia de não contato, tratamento rápido e indolor, diminuição das custas da internação; complicações mínimas e sem efeito subseqüente sobre a fertilidade e competência cervical, menor necrose térmica, e possibilidade de novo tratamento ambulatorial. Por estas razões e pelo alto percentual de cura podemos concluir que a cirurgia proposta foi vantajosa para o tratamento da neoplasia cervical intra-epitelial, quando comparada com outros métodos de tratamento.

Avaliação da Soroprevalência dos Vírus Herpes Simples Tipos 1 e 2 em Parturientes

Objetivos: avaliar a soroprevalência da infecção causada pelo HSV-2 entre as parturientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP) e padronizar técnicas laboratoriais para atender a este propósito. Métodos: foram avaliadas 1.500 amostras de sangue de parturientes atendidas no Centro Obstétrico do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do HCFMRP-USP, entre 1º de janeiro e 31 de outubro de 1996. Para determinar a real prevalência da infecção por HSV-2 foi padronizada a técnica de ELISA, verificando-se que esta não apresentava especificidade suficiente para discriminar os dois tipos virais (75%), delineando a necessidade de utilizar-se técnica de maior poder discriminatório. A técnica padronizada para esta finalidade foi o Western blot, capaz de detectar a proteína viral específica do HSV-2. Resultados: a soroprevalência para infecção herpética, pelos dois tipos virais (HSV-1 e HSV-2), foi de 94,5%, utilizando a técnica de ELISA. Com o emprego da técnica de Western blot, encontrou-se a soroprevalência de 31,9% pelo HSV-2 na população avaliada, quer sintomática ou assintomática. Conclusão: verifica-se elevada prevalência do estado de portadora da infecção pelos HSV, evidenciada pelo alto índice de positividade para os anticorpos contra estes vírus. O teste ELISA não mostrou especificidade suficiente para discriminar os anticorpos anti-HSV-2 dos anti-HSV-1.

Carga viral do papilomavirus humano na predição da gravidade de lesões cervicais em mulheres com atipias celulares na colpocitologia oncológica

OBJETIVO: avaliar o desempenho da carga viral do HPV por captura de híbridos II (CHII) na predição da gravidade das lesões cervicais. MÉTODOS: foram incluídas 309 mulheres admitidas por resultado anormal da colpocitologia oncológica (CO) entre agosto de 200 e novembro de 2002. Todas foram submetidas a avaliação histológica, sendo que a presença de neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) grau 2 ou mais (NIC 3, carcinoma invasor) foi considerada doença grave. A CHII foi realizada para tipos de HPV de alto risco oncogênico e a carga viral medida em unidades relativas de luz (URL). O desempenho da CHII foi avaliado por curva receiver operating characteristics (ROC). RESULTADOS: na avaliação histológica, 140 (45,3%) mulheres apresentavam cervicite ou NIC 1 e 199 (54,7%), NIC 2/3, adenocarcinoma in situ ou câncer invasor. O melhor ponto de corte da CHII para a detecção de doença grave foi 35 URL, com sensibilidade de 69% e especificidade de 70%. O valor preditivo positivo das alterações compatíveis com lesão de alto grau na CO associado a CHII de 35 URL (unidades relativas de luz) foi de 88,2% para a detecção de NIC 2 ou mais. Já 95,7% das mulheres com lesões de baixo grau na CO e CHII menor que 1 URL não apresentaram lesões histológicas graves. CONCLUSÃO: o melhor desempenho da CHII no diagnóstico de NIC 2 ou lesão mais grave foi encontrado com 35 URL. A associação da CO com a CHII em diferentes cargas virais mostrou valores preditivos positivos e negativos muito altos.

Produção de interleucina-10 na gestação reduz a taxa de replicação do HIV-1 em culturas de linfócitos maternos

OBJETIVO: avaliar a proliferação de células T e a produção de citocinas em gestantes infectadas pelo HIV-1 e seu impacto na replicação viral in vitro. MÉTODOS: sangue periférico de 12 gestantes infectadas pelo HIV-1 e de seus neonatos, bem como de 10 gestantes HIV-1 negativas, foi colhido e a quantidade de linfócitos TCD4+ e TCD8+ periféricos foi avaliada por citometria de fluxo. Para obter plasma ou células mononucleares periféricas (PBMC), as amostras foram centrifugadas na ausência ou presença de um gradiente de Ficoll-Hypaque, respectivamente. As PBMC foram mantidas em cultura por sete dias na presença de fito-hemaglutinina mais IL-2 recombinante e a resposta linfoproliferativa de células T foi analisada pelo método de exclusão em azul de Trypan. Em alguns experimentos, as culturas foram mantidas na presença adicional de anticorpo anti-IL-10. Os plasmas e sobrenadantes das culturas de PBMC ativadas foram submetidos à análise da produção de citocinas, pelo método ELISA indireto, e a carga viral, detectada pelo RT-PCR. RESULTADOS: independente da carga viral plasmática, a resposta linfoproliferativa em culturas de células obtidas de gestantes infectadas pelo HIV foi inferior às amostras normais [4,2±0,37 vs 2,4±0,56 (x 10(6)) células/mL; p<0.005]. Tanto em gestantes normais quanto em pacientes com cargas virais baixas, os níveis de IL-10 foram mais elevados que os das gestantes com elevada replicação viral (9.790±3.224 vs 1.256±350 pg/mL; p=0.002). Níveis elevados de TNF-alfa no soro (7.200±2.440 vs 510±476 pg/mL) e nas culturas de células (21.350±15.230 vs 1.256±350 pg/mL) correlacionaram-se à carga viral plasmática elevada e a infecção neonatal. O bloqueio da IL-10 endógena com anticorpos anti-IL-10 aumentou a replicação do HIV-1 em cultura de células. CONCLUSÃO: nossos resultados sugerem que a IL-10 exerce influência negativa na replicação viral, o que provavelmente contribui para reduzir o risco de infecção vertical.

Fatores que influenciam a transmissão vertical do vírus da imunodeficiência humana tipo 1

Um dos mais expressivos avanços visando controlar a dispersão da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) ocorreu no contexto da transmissão vertical (TV), reduzindo-a de cifras que chegavam a 40% para menos de 3%. O progresso tecnológico, aliado ao melhor conhecimento fisiopatológico dessa infecção, permitiu elencar as situações e os fatores que elevam as taxas de transmissão perinatal desse vírus, indicando quais as intervenções mais adequadas para o seu controle. Estas situações de maior risco para a TV do HIV-1 podem ser agrupadas em fatores maternos, anexiais, obstétricos, fetais, virais e pós-natais. Dos fatores maternos destaca-se a carga viral, o principal indicador do risco desta forma de transmissão. No entanto, a despeito da relevância da carga viral, ela não é a única variável desta equação, devendo ser lembrado o uso de drogas ilícitas, parceria sexual múltipla com sexo desprotegido, desnutrição, tabagismo, doença materna avançada e falta de adesão ou de acesso aos anti-retrovirais. Dos fatores anexiais apontam-se a corioamniorrexe prolongada, a perda da integridade placentária e a expressão dos receptores secundários no tecido placentário. Entre os fatores obstétricos deve ser lembrado que intervenções invasivas sobre o feto ou câmara amniótica, cardiotocografia interna, tipo de parto e contato do feto/recém-nascido com sangue materno também são importantes elementos a serem controlados. Dos fatores fetais são citados a expressão de receptores secundários para o HIV-1, a suscetibilidade genética, a função reduzida dos linfócitos T-citotóxicos e a prematuridade. Sobre os fatores virais aventa-se que a presença de mutações e cepas indutoras de sincício sejam fatores de risco para a TV. Finalmente, há os fatores pós-natais, representados pela carga viral elevada no leite, baixa concentração de anticorpos neste fluído, mastite clínica e lesões mamilares, que podem ser resumidos no contexto da amamentação natural.

Obtenção de gametas seguros por meio de associação de técnicas de processamento seminal para casais sorodiscordantes para HIV

RESUMO OBJETIVO: o objetivo deste estudo foi avaliar os parâmetros laboratoriais e clínicos de pacientes submetidos à reprodução humana assistida, associando técnicas de processamento seminal para eliminação de partículas virais da amostra de sêmen em casais nos quais o homem é infectado pelo vírus da imunodeficiência humana adquirida (HIV). MÉTODOS: foram avaliados 11 ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) realizados em casais nos quais os homens eram infectados pelo HIV (Grupo HIV), e 35 ciclos de ICSI nos quais se utilizaram espermatozóides doados (Grupo Controle). As amostras de sêmen dos doadores foram submetidas à análise seminal completa, processamento seminal (lavagem) e criopreservação. Os homens do Grupo HIV receberam antibioticoterapia prévia e realizou-se análise seminal, lavagem e gradiente descontínuo de densidade antes da criopreservação. As amostras foram avaliadas para carga viral e a ICSI foi realizada quando não houve detecção do HIV. RESULTADOS: quanto aos resultados da análise seminal, os grupos se mostraram comparáveis em relação à concentração e motilidade progressiva dos espermatozóides. Entretanto, a porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais foi maior no Grupo Controle (14,3%) comparado ao HIV (5,8%; p=0,002). Na avaliação dos parâmetros embrionários, as taxas de fertilização normal (Controle: 74,7% e HIV: 71,7; p=0,838) e de bons embriões (Controle: 42,4% e HIV: 65,1%; p=0,312) foram semelhantes. Por outro lado, o Grupo Controle apresentou melhores resultados clínicos que o HIV (gestação continuada: 52,9 e 12,5%; p=0,054; implantação: 42,6 e 10,4%; p=0,059, respectivamente), apesar de as diferenças não serem estatisticamente significantes. Após o nascimento, não houve soroconversão das mães e das crianças nascidas. CONCLUSÕES: a associação de técnicas de processamento seminal para eliminação do HIV de amostras seminais não interferiu nos parâmetros laboratoriais de ciclos de reprodução humana assistida. Por outro lado, demonstrou excelentes resultados na obtenção de gametas seguros para casais sorodiscordantes.