Modulation of the airway allergic response : characterization of the cellular and molecular mechanisms

ABSTRACT Allergic asthma is a major complication of atopy. Its severity correlates with the presence of activated T lymphocytes and eosinophils in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Mechanisms that protect against asthma are poorly understood. Based on oral models of mucosal tolerance induction, models using the nasal route showed that uptake of important amounts of antigen can induce tolerance and reverse the allergic phenotype. 1L-10 producing regulatory T cells were proposed as key players in tolerance induction, but other players, e.g. dendritic cells (DC), B cells and epithelial cells may have to be taken into consideration. The objective of the present study is to characterize the effects of a therapeutic intranasal treatment (INT) in a murine model of asthma and to determine, in this model, the cellular and molecular mechanisms leading to protection against asthma. First, we established an asthma model by sensitizing the BALB/c mouse to ovalbumin (OVA) by two intraperitoneal injections of alum-adsorbed OVA and three inhalations of aerosolized OVA. Then OVA was applied to the nasal mucosa of OVA- sensitized mice. Mice were later re-exposed to OVA aerosols to assess the protection induced by OVA INT. OVA sensitization induced strong eosinophil recruitment, OVA-specific T cell proliferation and IgE production. Three intranasal treatments at 24-hour intervals with 1.5 mg OVA drastically reduced inflammatory cell recruitment into the BALF and inhibited OVA-specific IgE production upon allergen re-exposure. T cell proliferation in ex vivo bronchial lymph node (BLN) cells was inhibited, as well as TH2 cytokine production. Protection against OVA-induced bronchial inflammation was effective for an extended period of time and treated mice resisted a second re-exposure. Transfer of CD4+ cells from BLN and lungs of OVA-treated mice protected asthmatic recipient mice from subsequent aerosol challenge indicating an involvement of CD4+ T regulatory cells in this protection. RESUME L'asthme allergique est une manifestation clinique majeure de l'atopie. La sévérité de l'asthme est liée à la présence de lymphocytes T activés ainsi que d'éosinophiles dans le lavage broncho-alvéolaire (LBA). Les mécanismes permettant de se prémunir contre l'asthme sont mal connus. Basés sur des modèles muqueux d'induction de tolérance par la voie orale, des modèles utilisant la voie nasale ont montré que d'importantes quantités d'antigène peuvent induire une tolérance et ainsi reverser le phénotype allergique. Des cellules régulatrices produisant de l'IL-10 pourraient jouer un rôle clé dans l'induction de la tolérance mais d'autres acteurs tels que les cellules dendritiques, les cellules B et les cellules épithéliales doivent aussi être prises en compte. L'objectif de la présente étude est de caractériser les effets d'un traitement intranasal thérapeutique dans un modèle murin d'asthme et de déterminer dans ce modèle les mécanismes cellulaires et moléculaires conférant une protection contre l'asthme. En premier lieu, un modèle d'asthme allergique a été établi en sensibilisant des souris BALB/c à l'ovalbumine (OVA) par deux injections intraperitonéales d'OVA adsorbé sur de l'alum et trois séances d'OVA en aérosol. Dans un second temps, de l'OVA a été administrée sur la muqueuse nasale des souris sensibilisées à l'OVA. Les souris furent ensuite challengées par des aérosols d'OVA afin d'évaluer la protection conférée par le traitement intranasal à l'OVA. La sensibilisation à l'OVA a induit un fort recrutement d'éosinophiles, une réponse proliférative des cellules T à l'OVA ainsi qu'une production d'lgE spécifiques. Trois traitements intranasaux à 24 heures d'intervalle avec 1.5 mg d'OVA ont permis de réduire drastiquement le recrutement des cellules inflammatoires dans le LBA ainsi que d'inhiber la production d'lgE spécifiques à l'OVA produits lors d'une ré-exposition à l'OVA. La prolifération en réponse à l'OVA de cellules extraites ex vivo de ganglions bronchiques a, elle aussi, été inhibée de même que la production de cytokines TH2. La protection contre l'inflammation provoquée par l'aérosol est efficace pour une longue période et les souris traitées résistent à une seconde ré- exposition. Le transfert de cellules CD4+ issues de ganglions bronchiques et de poumons de souris traitées à l'OVA protège les souris asthmatiques receveuses contre les effets inflammatoires d'un aérosol, indiquant que des cellules T CD4+ régulatrices pourraient être impliquées dans cette protection. RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC L'asthme est une affection des voies respiratoires qui se caractérise par une contraction de la musculature des voies aériennes, une production de mucus et d'anticorps de l'allergie (IgE). On parle d'asthme allergique lorsque les facteurs déclenchant l'asthme sont des allergènes inhalés tels que acariens, pollens ou poils d'animaux. Le système immunitaire des patients asthmatiques a un défaut de programmation qui le rend réactif à des substances qui sont normalement inoffensives. Le traitement actuel de l'asthme repose sur le soulagement des symptômes grâce à des produits à base de stéroïdes. Les techniques permettant de reprogrammer le système immunitaire (immunothérapie) ne sont pas efficaces pour tous les antigènes et prennent beaucoup de temps. En conséquence, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant une telle reprogrammation afin d'en améliorer le rendement et l'efficacité. Dans ce but, des modèles d'immunothérapie ont été mis au point chez la souris. Ils permettent une plus grande liberté d'investigation. Dans cette étude, un modèle d'asthme allergique dans la souris a été établi par une sensibilisation à un antigène particulier : l'ovalbumine (OVA). Ce modèle présente les caractéristiques principales de l'asthme humain : recrutement de cellules inflammatoires dans les poumons, augmentation de la production d'anticorps et de la résistance des bronches aux flux respiratoires. Cette souris asthmatique a ensuite été traitée par application nasale d'OVA. Comparées aux souris non traitées, les souris traitées à l'OVA ont moins de cellules inflammatoires dans leurs poumons et produisent moins d'anticorps IgE. D'autres marqueurs inflammatoires sont aussi fortement diminués. Des cellules de poumons ou de ganglions bronchiques prélevées sur des souris traitées injectées dans des souris asthmatiques améliorent les symptômes de l'asthme. Ces cellules pourraient donc avoir un rôle régulateur dans l'asthme. Les caractériser et les étudier afin d'être capable de les générer est crucial pour les futures thérapies de l'asthme.

Utilisation de tissus de cancer de vessie archivés en paraffine pour l'analyse de l'expression de gènes immunorégulateurs

Introduction : Le cancer de la vessie est la 4ème cause de cancer en Europe, chez l'homme. Dans 70% des¦cas, le diagnostic initial de cancer transitionnel de la vessie est non-musculo invasif mais jusqu'à 45%¦progresseront en tumeur musculo-invasive selon des facteurs de risques qui ont été scorés par¦l'Organisation européenne de recherche sur le traitement du cancer (EORTC). Après résection¦endoscopique transuréthrale vésicale (RTUV) de la tumeur, une instillation intravésicale (ives) d'agents¦chimiothérapeutiques ou d'immunomodulateurs tel que le Bacille Calmette Guérin (BCG) permet de¦réduire les récurrences/progressions. Cependant l'utilisation du BCG est limitée aux patients avec un risque¦de progression haut et intermédiaire au vu des effets secondaires occasionnés. Le système immunitaire¦joue un rôle certain dans l'évolution d'un processus néoplasique. Toutefois, les cancers adoptent différents¦mécanismes pour supprimer la réponse antitumorale. La variation de l'environnement immunologique¦tumoral pourrait avoir une valeur pronostique pour l'évolution naturelle de la maladie. Le but de notre¦étude est d'utiliser des coupes paraffines archivées de RTUV afin de définir l'environnement immunitaire¦des carcinomes urothéliaux non musculo-invasifs, en particulier les caractéristiques immunosuppressives,¦comme prédictif d'un comportement de progression néoplasique.¦Méthodologie : L'exploration d'une base de données de patients suivis pour le cancer de la vessie au¦CHUV afin de faire un choix des coupes de RTUV à examiner a été réalisée. Une approche transversale a été¦abordée en regroupant des patients de stades tumoraux différents ou en évaluant des foyers tumoraux¦multiples au sein de la vessie d'un même patient à un moment donné (i.e lors d'une même RTUV). Une¦approche longitudinale a également été adoptée avec comme objectif de comparer, chez le même patient,¦des tumeurs de stades, de grades et de score de risque de progression de l'EORTC différents au cours du¦temps. L'ARN des tissus de RTUV fixés au formol et enrobés en paraffine a été extrait et purifié. Un kit¦d'amplification en temps réel par réaction en chaîne par polymérase (RCP) pour 84 gènes impliqués dans¦l'anergie des cellules T et la tolérance immunitaire a été utilisé.¦Résultat : Nous avons réuni les informations cliniques de 157 sujets atteints de tumeur vésicale non¦musculo-invasive. 35% des sujets ont reçu une chimiothérapie ives et 40 % ont reçu du BCG ives. Les troisquarts¦de ces derniers ont reçu un cycle de BCG complet (6 semaines). Néanmoins, 38 % d'entre eux vont¦tout de même subir une progression de leur cancer. Les scores de progression de l'EORTC ont pu être¦calculés pour 94 sujets (39% haut risque, 42 % risque intermédiaire et 19% bas risque). 76% des patients à¦haut risque a été traité avec du BCG ives. Parmi les patients avec un risque intermédiaire de progression,¦seuls 15 % ont effectivement progressé incluant 2 patients avec des échantillons de RTUV disponibles pour¦analyse. L'analyse par RCP s'est focalisée sur une approche longitudinale incluant 6 patients suivis sur une¦longue période avec de multiples RTUV. 29 échantillons ont été sélectionnés, leur ARN purifiés, mais seuls¦16 ARN se sont révélés en quantité et qualité suffisante pour être analysé par RCP. L'analyse par RCP¦quantitative en temps réel a montré des problèmes dans la quantification de l'ADN génomique, ainsi que¦des gènes domestiques. Ceci a grandement handicapé nos analyses et n'a pas permis la mise en évidence¦convaincante de gènes immuno-modulateurs associés à la progression du cancer de la vessie.¦Discussion : Notre analyse du suivi des patients au CHUV montre que les chirurgiens façonnent leur prise¦en charge durant l'intervention selon des critères adaptés à la situation et tendent ainsi à une stratification¦des risques permettant un traitement adapté, de la même manière que le permet le score de l'EORTC, en¦tous cas en ce qui concerne les patients à haut risque de progression. Les nombreux facteurs impliqués¦dans le cancer de la vessie montrent néanmoins qu'il y aurait des avantages à rationaliser la prise en charge. L'archivage de tissus fixé au formol et enrobé en paraffine a l'avantage de représenter une source¦de matériel considérable et de grande valeur pour la recherche. Néanmoins, malgré l'évolution des¦techniques et la publicité des fabricants, il s'est avéré difficile d'exploiter ce matériel délicat pour en¦obtenir des résultats convaincants.

Analyse en actographe et dans sa cage, de la réponse comportementale du mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus L.) à un jeûne de 24

1. The "general activity" of Apodemus Sylvaticus L. has been recorded and analysed using two techniques: a) in an actograph, several components of the "general activity" have been recorded and quantified over 24 hours, including wheel running, locomotion in various areas of the enclosure, nest occupancy, drinking, eating and hoarding; b) in a breeding cage, ten times smaller than the actograph and where the possibilities of locomotion are considerably reduced, the wheel running only has been recorded. In these two situations, we have compared the effects of a food deprivation for 24 hours. 2. In the actograph, starvation increases the general locomotion in the enclosure without detectable changes in wheel running. On the other hand, in the breeding cage, wheel running is somewhat increased. 3. Refeeding results in decreased wheel running under both experimental conditions, and restores general locomotion in the actograph to the predeprivation level. 4. These results are discussed in view of the current literature. The apparent disagreement between our results and those of other workers is attributed to the fact that the latter used experimental conditions where the measured response was predetermined by the lack of choice in expressed responses which were offered to the animal. Consequently, we suggest that the interpretation of such experiments can be improved by allowing a choice of possible behavioural response and that each of them should be recorded separately.