Evaluación de la expresión de enzimas hidrolíticas de pared celular en cloroplastos de tabaco

La alta capacidad del genoma del cloroplasto para integrar y expresar transgenes en altos niveles, hace de la tecnología transplastómica una buena opción para producir proteínas de interés. Este reporte presenta la expresión estable de una pectinasa (gen PelA), una β-glucosidasa (gen Bgl1), dos celulasas (genes CelA y CelB) y la primer expresión estable de una manganeso peroxidasa (gen MnP-2) en el genoma de cloroplastos de tabaco. Se construyeron seis vectores: pES4, pES5, pES6, pHM4, pHM5 y pHM6 derivados de pPRV111A conteniendo los genes sintéticos PelA, MnP- 2, Bgl1, CelA-CelB, CelA y CelB, respectivamente. Los genes se flanquearon por un promotor sintético del gen rrn16S y una secuencia sintética 3’UTR del gen rbcL. La integración en la región intergénica rrn16S y 3'rps12 se confirmó por análisis de Southern blot. El procesamiento estable de los transcritos se confirmó por un análisis de Northern blot. Se realizó un análisis enzimático para detectar la expresión y funcionalidad de las enzimas recombinantes, las plantas maduras mostraron mayor actividad comparado con plantas de tipo silvestre. Las plantas transplastómicas exhibieron 58.5% más actividad de pectinasa a pH neutro y a 60°C, mientras que manganeso peroxidasa mostró alta actividad a pH 6 y 65°C; en el caso de las celulasas, todas las enzimas mostraron mayor actividad a pH 5 (β-glucosidasa: 30.45 xviii U/mg, CelA-CelB 58 U/mg, CelA 49.10 U/mg y CelB 48.72 U/mg) a 40°C para β- glucosidasa y 65°C para celulasas. Las plantas transplastómicas mostraron un desarrollo similar a las plantas de tipo silvestre; sin embargo, la línea pHM4 mostró fenotipos variegados en hojas. Los análisis mostraron que los genes de enzimas hidrolíticas PelA, MnP-2, Bgl1, CelA-CelB, CelA y CelB pueden integrarse y expresarse en el genoma de cloroplastos con alta actividad; de este modo, debido a que una planta madura en promedio cuenta con ~ 470 g de biomasa, es posible producir 66,676.25 unidades de pectinasa, 21,715.46 unidades de manganeso peroxidasa, 338,081.0 unidades de celulasas A-B, 231,456.7 unidades de celulasa A, 206,669.8 unidades de celulasa B y 139,395.0 unidades de β-glucosidasa por planta. Este estudio sustenta información sobre métodos y estrategias de expresión de enzimas hidrolíticas con potencial aplicación biotecnológica utilizando plantas transplastómicas.

Atividade de enzimas ligadas ao ciclo do nitrogênio em solo submetido a frequentes aplicações de lodo de esgoto.

RESUMO: Grande proporção do nitrogênio no solo está na forma de material proteináceo, cuja quebra é regulada pela atividade de proteases extracelulares. Outra enzima envolvida no ciclo do nitrogênio, a urease, é responsável pela hidrólise da uréia a amônia e CO2. Neste trabalho, avaliou-se o efeito da suplementação do solo com diferentes doses e tipos de lodo (ETE de Barueri e ETE de Franca) na atividade das enzimas protease e urease. As aplicações de lodo ao solo iniciaram-se em 1999 a taxas que variaram na dose recomendada, tomando-se como base os requerimentos da planta em N, até uma taxa 8 vezes maior. Nos anos de 2004 e 2005 os lodos não foram aplicados. Em 2006 e 2007 somente foi aplicado o lodo de Franca. Os resultados deste trabalho referem-se às coletas de solo feitas no ano agrícola 2007/2008. A atividade da protease aumentou com o aumento da dose de lodo de Franca. Por outro lado, houve decréscimo da atividade da protease com o aumento da dose do lodo de Barueri. Na maior dose deste lodo a atividade foi semelhante à obtida no tratamento com fertilização mineral. A menor atividade daquela enzima foi obtida no tratamento testemunha. A atividade da urease foi maior nos tratamentos com o lodo de Franca independentemente da dose aplicada. A atividade das duas enzimas envolvidas no ciclo do nitrogênio foram sensíveis indicadores da qualidade de solo tratado com lodo de esgoto.

Bagaço de cana-de-açúcar hidrolisado para uso como substrato na caracterização de enzimas lignocelulolíticas.

O bagaço de cana-de-açúcar (BCA), possui em sua composição principalmente celulose e hemicelulose que podem ser hidrolisadas para produção de etanol de segunda geração. O objetivo deste trabalho foi verificar se o BCA hidrolisado quimicamente poderia ser utilizado como substrato para a caracterização de enzimas lignocelulolíticas.

Estabilidade de comunidades microbianas do solo e de suas funções sob sistemas agrícolas convencional e conservacionista.

2016

Comparação da produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas por linhagens mutantes e parental do Aspergillus niger 3T5B8.

Diversos trabalhos têm procurado aumentar a eficiência da hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica. Nesse contexto, o melhoramento de cepas produtoras de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas pode resultar em misturas enzimáticas mais eficientes. A linhagem parental de Aspergillus niger 3T5B8, referenciada como produtora de poligalacturonase, foi utilizada para o melhoramento genético visando aumentar a produção de celulases e hemicelulases. A produção das enzimas CMCase, xilanase, beta-glicosidase e poligalacturonase por fermentação submersa usando duas linhagens mutantes P49 e P83 foi avaliada e comparada com a linhagem parental. Os resultados mostraram um destaque para a cepa P83 com um aumento na produção de 56% de CMCase, 76% de beta-glicosidase, 23% de xilanase e 216% na poligalacturonase.

Isolamento e seleção de microrganismos termófilos potencialmente úteis para produção de enzimas hidrolíticas.

2016

Alterações das enzimas urease e arginase em solo do cerrado sob sistema de Integração Lavoura Pecuária e Floresta.

2016

Assessment of phytostabilization of Pb/Zn mine soils with organic amendments and a native metallicolous ecotype of Festuca Rubra l.: implications for amendment selection and recovery of soil health

La contaminación del suelo es una de las principales amenazas para los ecosistemas y la salud humana. Actualmente, desde un punto de vista tanto económico como ambiental, la fitoestabilización es la mejor tecnología para remediar suelos contaminados con elevadas concentraciones de metales como son los suelos mineros. La fitoestabilización asistida consiste en el empleo de plantas y enmiendas orgánicas y/o inorgánicas con el fin de reducir la movilidad y la biodisponibilidad de los contaminantes y recuperar la salud de suelo. En este trabajo se han realizado ensayos en microcosmos y en campo centrándonos en la salud del suelo minero contaminado con Pb y Zn durante un proceso de fitoestabilización empleando enmiendas orgánicas (purines vacunos, gallinaza, estiércol de oveja y lodos de papelera mezclados con gallinaza) y/o la especie metalífera Festuca rubra con el objetivo de (i) estudiar las interacciones suelo-enmienda responsables de los cambios inducidos por el proceso de quimioestabilización en las propiedades físicoquímicas y biológicas del suelo, (ii) evaluar la efectividad del proceso de fitoestabilización sobre suelos vegetados y de la revegetación sobre suelos desnudos (iii) valorar la idoneidad de distintos indicadores químicos y biológicos (parámetros microbianos y de la vegetación) para monitorizar la efectividad de la fitoestabilización asistida en términos de reducción de la biodisponibilidad de metales en el suelo, mejora de la vegetación y de la recuperación de la salud del suelo. La aplicación de enmiendas al suelo minero supone una entrada de materia orgánica y nutrientes que conduce a una disminución de la biodisponibilidad de metales, facilitando la colonización de las plantas y el crecimiento de la vegetación nativa, además de estimular la actividad microbiana del suelo. El pH del suelo es un factor crítico que condiciona la movilidad de los metales y la toxicidad del suelo. Las poblaciones microbianas de las enmiendas no modificaron la diversidad funcional de las comunidades microbianas nativas de la mina. Los purines vacunos y los lodos de papelera mezclados con gallinaza son los tratamientos más efectivos en el proceso de fitoestabilización asistida bajo condiciones de campo. La gallinaza fue el tratamiento que más estimuló el crecimiento de la vegetación nativa y la colonización en los suelos desnudos. El bioensayo de elongación radical de lechuga es un test sensible, sencillo y barato para evaluar la biodisponibilidad de metal y la ecotoxicidad del suelo. Los tocoferoles son biomarcadores de exposición a metales con potencial para su implementación en bioensayos de toxicidad. Este trabajo permite concluir que la población metalífera de F. rubra, combinada con enmiendas orgánicas, es una excelente candidata para los proyectos de fitoestabilización asistida. Además, la monitorización simultánea de los parámetros fisicoquímicos y microbiológicos del suelo y de su ecotoxicidad permite una evaluación adecuada de la salud del suelo, así como la selección de enmiendas apropiadas para el desarrollo de un proceso fitoestabilizador.

Impact of fertlizers and pesticides on soil and water quality

[ES]En la presente tesis se ha estudiado el impacto de diferentes fertilizantes y pesticidas utilizados en la Zona Vulnerable de Vitoria-Gasteiz en la calidad del suelo y las aguas de dicha zona. Se ha podido constatar que hoy en día siguen lixiviándose cantidades significativas de nitratos y pesticidas (e.g., etofumesato y difenoconazol) a las aguas de la Zona Vulnerable, durante el cultivo de remolacha azucarera (Beta vulgaris L.), muy característico de la zona de estudio. Se comprobó que el alto contenido en nitratos de las aguas subterráneas en la Zona Vulnerable es mitigado, al menos en parte, por la acción de la actividad microbiana desnitrificante que alberga la zona riparia del humedal de Salburua. Dicho proceso, sin embargo, supone la emisión a la atmósfera de importantes cantidades de gases de efecto invernadero (CO2 y N2O), y puede verse afectado negativamente por la presencia de pesticidas (e.g., deltametrina) en el medio.Por otra parte, hemos observado que diversos pesticidas (deltametrina, etofumesato, difenoconazol) aplicados en concentraciones similares a las dosis de aplicación en campo inducen cambios, de carácter limitado y transitorio, en las comunidades microbianas edáficas, siendo más significativos en el caso del fungicida difenoconazol. El efecto de los pesticidas fue más acusado a medida que aumentaba su concentración en el medio. Finalmente, encontramos que la aplicación de abonos orgánicos (avicompost), en lugar de los fertilizantes sintéticos tradicionales (NPK), además de mejorar la degradación de los pesticidas y disminuir el impacto de éstos sobre la calidad del suelo, podría ayudar a reducir las pérdidas de nitratos por lixiviación.

Efecto de la radiación visible sobre la supervivencia de Vibrio harveyi en el medio marino

Vibrio harveyi es un microorganismo marino perteneciente a la familia Vibrionaceae, patógeno de numerosos animales marinos; tanto invertebrados como vertebrados, pudiendo producir pérdidas económicas en países que se benefician de la acuicultura. Se trata de un microorganismo que vive en un medio natural con escasa cantidad de nutrientes, por ello es un microorganismo oligotrofo. Además el medio marino es un medio con una gran cantidad de sales, con lo cual V. harveyi es una bacteria halófila. 3 V. harveyi es capaz de entrar en lo que se conoce como estado Viable No Cultivable (VNC), en dicho estado es capaz de sobrevivir a situaciones de estrés manteniendo niveles bajos de actividad y perdiendo la cultivabilidad. La radiación luminosa visible, a pesar de tener efectos beneficiosos en los seres vivos, puede provocar efectos negativos en las poblaciones microbianas marinas. En este trabajo se determinó la entrada en estado VNC en sus condiciones de temperatura ambiente (20ºC) tanto en un control en oscuridad así como bajo estrés lumínico. Los resultados mostraron como las células mantenidas en oscuridad no entraron en estado VNC, aunque sí se produjo una pérdida de cultivabilidad relacionada con lesiones celulares provocadas por los nutrientes de determinados medios de cultivo. En cambio, las células que fueron expuestas a la luz visible indicaron una pérdida de cultivabilidad a lo largo de los días de exposición, manteniéndose al finalizar el trabajo experimental el 93% de la población en estado VNC. Por lo tanto, la luz visible provoca un efecto negativo en la población de V. harveyi que es capaz de mantenerse en un estado VNC para sobrevivir a las condiciones adversas.

New Oncogenic Drivers in Hepatocellular Carcinoma: Role of the RNA Binding Protein Hu antigen R

156 p. : graf.

Arquitectura subcelular del sistema endocannabinoide en el núcleo ventromedial del hipotálamo de ratón

356 p. : il., graf. Nota: Contiene versión resumida en inglés p.237-256 con el título “Subcellular architecture of the endocannabinoid system in the mouse ventromedial nucleus of the hypothalamus”

Identificación y caracterización de centros de unión para purinas de membrana plasmática de células aisladas de glándulas gástricas

149 p. : il.

Estudio de la actividad aminopeptidásica en espermatozoides astenozoospérmicos : comparación clínica

249 p.: il., col.

Aplicaciones enzimáticas en procesos de conservación y restauración de obras de arte. Consolidación de celulosa

690 p.