Células de anêmonas Bunodosoma cangicum expostas ao cobre: citotoxidade, defesa e dano de DNA

Anêmonas-do-mar são pólipos solitários, bentônicos, de pouca mobilidade, que habitam regiões entre-marés. Devido a estas características, são organismos que podem ser atingidos diretamente pela poluição aquática, no entanto, são pouco utilizados como modelo ecotoxicológico. O cobre é um metal essencial, que em altas concentrações pode ser tóxico, sendo bastante comum em ecossistemas marinhos. Um dos mecanismos de toxicidade do cobre envolve a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), podendo levar as células ao estresse oxidativo, que tem como característica danos celulares, inclusive no DNA. Muitos organismos possuem um mecanismo que bombeia os xenobióticos para fora da célula – multixenobiotic resistance (MXR) – que visa prevenir as células dos danos tóxicos causados pelo contaminante. Com isso, o presente trabalho estudou a capacidade de defesa e dano ao DNA à toxicidade causada pelo cobre em células de anêmonas Bunodosoma cangicum. Para isto, células de anêmonas, mantidas em cultura primária através de explante do disco podal, foram expostas ao cobre a duas concentrações (7,8 µg.L-1 Cu e 15,6 µg.L-1 Cu), além do grupo controle, por 6 e 24 h. Antes e após as exposições as células tiveram sua viabilidade avaliada através do método de exclusão por azul de tripan (0,08%) para analisar a citotoxicidade. Parâmetros como a indução do mecanismo MXR através do método de acúmulo de rodamina-B, espécies reativas de oxigênio e ensaio cometa, também foram avaliados. Os resultados obtidos mostram que o cobre é citotóxico, sendo constatada uma queda na viabilidade e no número de células, principalmente após 24 h de exposição, sendo que na concentração de cobre de 15,6 µg.L-1 , foi possível observar uma diminuição de 40% na viabilidade e uma redução em 36% no número de células (p < 0,05, n = 6). Em relação ao fenótipo MXR, foi observada uma ativação do mecanismo apenas naquelas células expostas ao cobre 7,8 µg.L-1 (53%) no tempo de 24 h (p < 0,05, n = 5). Na análise da geração de ERO foi observado um aumento de 11,5% naquelas células expostas por 6 h na concentração mais alta de cobre 15,6 µg.L-1 . Nas células que foram expostas por 24 h, o aumento de espécies reativas pode ser percebido já na concentração de 7,8 µg.L-1 , elevando-se para cerca de 20% quando exposto a 15,6 µg.L-1 (p < 0,05, n = 4-5). Quanto ao dano de DNA, foram vistas quebras na molécula desde 7,8 µg.L-1 Cu em 6 h, com danos ainda mais salientes naquelas células expostas por 24 h, na concentração de 7,8 µg.L -1 Cu (p < 0,05, n = 3-4), e para 15,6 µg.L-1 Cu a viabilidade celular (número de células) não permitiu a análise. Com base nestes dados, pode-se dizer que o cobre, mesmo em baixas concentrações causa estresse em células de B. cangicum, sendo citotóxico. Este metal causa estresse oxidativo com dano à molécula de DNA mesmo com a ativação do mecanismo de defesa.

Exploring the potential of novel biomixtures and Lentinula edodes fungus for the degradation of selected pesticides. Evaluation for use in biobed systems

An approach to reduce the contamination of water sourceswith pesticides is the use of biopurificaction systems. The active core of these systems is the biomixture. The composition of biomixtures depends on the availability of local agro-industrial wastes and design should be adapted to every region. In Portugal, cork processing is generally regarded as environmentally friendly and would be interesting to find applications for its industry residues. In this work the potential use of different substrates in biomixtures, as cork (CBX); cork and straw, coat pine and LECA (Light Expanded Clay Aggregates), was tested on the degradation of terbuthylazine, difenoconazole, diflufenican and pendimethalin pesticides. Bioaugmentation strategies using the white-rot fungus Lentinula edodes inoculated into the CBX, was also assessed. The results obtained from this study clearly demonstrated the relevance of using natural biosorbents as cork residues to increase the capacity of pesticide dissipation in biomixtures for establishing biobeds. Furthermore, higher degradation of all the pesticides was achieved by use of bioaugmented biomixtures. Indeed, the biomixtures inoculated with L. edodes EL1were able to mineralize the selected xenobiotics, revelling that these white-rot fungi might be a suitable fungus for being used as inoculum sources in on-farm sustainable biopurification system, in order to increase its degradation efficiency. After 120 days, maximum degradation of terbuthylazine, difenoconazole, diflufenican and pendimethalin, of bioaugmented CBX, was 89.9%, 75.0%, 65.0% and 99.4%, respectively. The dominant metabolic route of terbuthylazine in biomixtures inoculated with L. edodes EL1 proceeded mainly via hydroxylation, towards production of terbuthylazine-hydroxy-2 metabolite. Finally, sorption process to cork by pesticides proved to be a reversible process,working cork as a mitigating factor reducing the toxicity to microorganisms in the biomixture, especially in the early stages.

Processamento e classificação de imagens biológicas: aplicação à histologia

A Histologia, o estudo de tecidos, é uma das áreas fundamentais da Biologia que permitiu enormes avanços científicos. Sendo uma tarefa exigente, meticulosa e demorada, será importante aproveitar a existência de ferramentas e algoritmos computacionais no seu auxílio, tornando o processo mais rápido e possibilitando a descoberta de informação que poderá não estar visível à partida. Esta dissertação tem como principal objectivo averiguar se um animal foi ou não sujeito à ingestão de um xenobiótico. Com esse objectivo em vista, utilizaram-se técnicas de processamento e segmentação de imagem aplicadas a imagens de tecido renal de ratos saudáveis e ratos que ingeriram o xenobiótico. Destas imagens extraíram-se inúmeras características do corpúsculo renal que após serem analisadas através de vários algoritmos de classificação mostraram ser possível saber se o animal ingeriu ou não o xenobiótico, com um reduzido grau de incerteza. ABSTRACT: Histology, the study of tissues, is one of the key areas of Biology that has allowed huge advances in Science. Being a demanding, meticulous and time consuming task, it is important to use the existence of computational tools and algorithms in its aid, making the process faster and enabling the discovery of information that may not be initially visible. The main goal of this thesis is to ascertain if an animal was subjected or not to the ingestion of a xenobiotic. With this in mind, were used image processing and segmentation techniques applied on images of kidney tissue from healthy rats and rats that ingested the xenobiotic. From these images were extracted several features of renal glomeruli that after being analyzed by various classification algorithms had shown to be possible to know, with an acceptable degree of certainty, if the animal ingested or not the xenobiotic.

Prediction of a low-risk concentration of diflubenzuron to aquatic organisms and evaluation of clay and gravel in reducing the toxicity.

Resumo: Predição da concentração de baixo risco de diflubenzuron para organismos aquáticos e avaliação da argila e brita na redução da toxicidade. O diflubenzuron é um inseticida que além de ser usado agricultura, tem sido amplamente empregado na piscicultura, apesar do seu uso ser proibido nesta atividade. Este composto não consta na lista da legislação brasileira que estabelece limites máximos permissíveis em corpos de água para a proteção das comunidades aquáticas. No presente trabalho, a partir da toxicidade do diflubenzuron em organismos não-alvo, foi calculada a concentração de risco para somente 5% das espécies (HC5). O valor deste parâmetro foi estimado em aproximadamente 7 x 10-6 mg L-1 . Este baixo valor é devido à extremamente alta toxicidade do diflubenzuron para dafnídeos e à grande variação de sensibilidade entre as espécies testadas. Dois matérias de relativamente baixo custo se mostraram eficientes na remoção da toxicidade do diflubenzuron de soluções contendo este composto. Dentre esses materiais, a argila expandida promoveu a redução em aproximadamente 50% da toxicidade de uma solução contendo diflubenzuron. Os resultados podem contribuir para políticas públicas no Brasil relacionadas ao estabelecimento de limites máximos permissíveis de xenobióticos no compartimento aquático. Também, para a pesquisa de matérias inertes e de baixo custo com potencial de remoção de xenobióticos presentes em efluentes da aquicultura ou da agricultura. Abstract: Diflubenzuron is an insecticide that, besides being used in the agriculture, has been widely used in fish farming. However, its use is prohibited in this activity. Diflubenzuron is not in the list of Brazilian legislation establishing maximum permissible limits in water bodies for the protection of aquatic communities. In this paper, according toxicity data of diflubenzuron in non-target organisms, it was calculated an hazardous concentration for only 5% of the species (HC5) of the aquatic community. This parameter value was estimated to be about 7 x 10 -6 mg L -1 . The low value is due to the extreme high toxicity of diflubenzuron to daphnids and to the large variation in sensitivity among the species tested. Two relatively low cost and inert materials were efficient in removing the diflubenzuron from solutions containing this compound. Among these materials, expanded clay shown to promote reduction of approximately 50% of the toxicity of a solution containing diflubenzuron. The results may contribute to the establishment of public policies in Brazil associated to the definition of maximum permissible limits of xenobiotics in the aquatic compartment. This study is also relevant to the search of low cost and inert materials for xenobiotics removal from aquaculture or agricultural effluents.

Non conventional species as monitor of environmental pollution

This thesis collects several ecotoxicological studies focused on the quali- quantitative analysis of several classes of chemical compounds. Our studies have been conducted on different aquatic species occupying different food chain trophic levels and characterized by differences in biology, ethology, and nutrition, but all considered excellent bioindicators. This choice allowed us to have a broad overview of the contamination of aquatic environments. Detrimental effects of several chemical compounds on the species investigated have been discussed, considering the economic and public health implications linked to the pollution of the environment and the exposure to old and emerging xenobiotics. Our studies underline the importance of a multidisciplinary and integrated approach that includes the application of the one health concept to ensure the protection of public health and respect for natural environments. Studies collected in this thesis also aim to overcome some critical limitations of the branch of ecotoxicology, such as the lack of standardization in laboratory methods. Our data also underline the importance of expanding research to a greater number of various biological matrices than those indicated by the literature as target tissues for specific pollutants. This condition enables more detailed information on the kinetics of xenobiotics in animal organisms. Our studies also allow us to expand the knowledge related to the mechanisms of synergy and antagonism of mixtures of pollutants that can simultaneously accumulate in wildlife.

Innovative microbiome-based system for the improvement of productivity, safety and sustainability of mussels farming

Northwestern Adriatic Sea Mediterranean mussels are exposed to fluctuating environmental parameters and to natural and anthropogenic stressors. Today is well known that mussels can be defined as holobiont, even if remains a lot to elucidate about how an organism and its microbial component response to environmental stress. This PhD dissertation aims to investigate microbiome possible adaptive patters exploiting the organism physiology response to stress, using the NGS sequencing method. The experimental approach consisted of two phases to first determine (i) the microbiome at a tissue scale level, (ii) the microbiome and physiological response to natural and anthropogenic stress environment and the chemical assessment of the microecosystem the Northwestern Adriatic Sea Mediterranean Mussel lives in. Results revealed firstly a robust microbiome well differentiated from seawater microecosystem, with compositional variations at the organ level. Thanks to those findings, digestive gland, the organ in which digestive and detoxification processes allow animal to tolerate and accumulate xenobiotics of natural and anthropogenic origin, was the selected tissue for the second phase of the project. The second phase of the project evaluated the putative physiological variations and the compositional changes in microbiome of digestive gland. I then manage to assess microbiome region trends across the north Adriatic, with each sampling site well differentiated from the others. Finally, a chemical method able to a powerful tool for the analytical detection of the major pollutants in mussels were validated. These first results may provide baseline information for future studies approaches of seasonal and region trends of microbiota profiles and physiological responses in terms of metabolism.