Sviluppo di biosensori: modifiche di superfici elettrodiche e sistemi di immobilizzazione enzimatica

An amperometric glucose biosensor was developed using an anionic clay matrix (LDH) as enzyme support. The enzyme glucose oxidase (GOx) was immobilized on a layered double hydroxide Ni/Al-NO3 LDH during the electrosynthesis, which was followed by crosslinking with glutaraldehyde (GA) vapours or with GA and bovine serum albumin (GABSA) to avoid the enzyme release. The electrochemical reaction was carried out potentiostatically, at -0.9V vs. SCE, using a rotating disc Pt electrode to assure homogeneity of the electrodeposition suspension, containing GOx, Ni(NO3)2 and Al(NO3)3 in 0.3 M KNO3. The mechanism responsible of the LDH electrodeposition involves the precipitation of the LDH due to the increase of pH at the surface of the electrode, following the cathodic reduction of nitrates. The Pt surface modified with the Ni/Al-NO3 LDH shows a much reduced noise, giving rise to a better signal to noise ratio for the currents relative to H2O2 oxidation, and a linear range for H2O2 determination wider than the one observed for bare Pt electrodes. We pointed out the performances of the biosensor in terms of sensitivity to glucose, calculated from the slope of the linear part of the calibration curve for enzimatically produced H2O2; the sensitivity was dependent on parameters related to the electrodeposition in addition to working conditions. In order to optimise the glucose biosensor performances, with a reduced number of experimental runs, we applied an experimental design. A first screening was performed considering the following variables: deposition time (30 - 120 s), enzyme concentration (0.5 - 3.0 mg/mL), Ni/Al molar ratio (3:1 or 2:1) of the electrodeposition solution at a total metals concentration of 0.03 M and pH of the working buffer solution (5.5-7.0). On the basis of the results from this screening, a full factorial design was carried out, taking into account only enzyme concentration and Ni/Al molar ratio of the electrosynthesis solution. A full factorial design was performed to study linear interactions between factors and their quadratic effects and the optimal setup was evaluated by the isoresponse curves. The significant factors were: enzyme concentration (linear and quadratic terms) and the interaction between enzyme concentration and Ni/Al molar ratio. Since the major obstacle for application of amperometric glucose biosensors is the interference signal resulting from other electro-oxidizable species present in the real matrices, such as ascorbate (AA), the use of different permselective membranes on Pt-LDHGOx modified electrode was discussed with the aim of improving biosensor selectivity and stability. Conventional membranes obtained using Nafion, glutaraldehyde (GA) vapours, GA-BSA were tested together with more innovative materials like palladium hexacyanoferrate (PdHCF) and titania hydrogels. Particular attention has been devoted to hydrogels, because they possess some attractive features, which are generally considered to favour biosensor materials biocompatibility and, consequently, the functional enzyme stability. The Pt-LDH-GOx-PdHCF hydrogel biosensor presented an anti-interferant ability so that to be applied for an accurate glucose analysis in blood. To further improve the biosensor selectivity, protective membranes containing horseradish peroxidase (HRP) were also investigated with the aim of oxidising the interferants before they reach the electrode surface. In such a case glucose determination was also accomplished in real matrices with high AA content. Furthermore, the application of a LDH containing nickel in the oxidised state was performed not only as a support for the enzyme, but also as anti-interferant sistem. The result is very promising and it could be the starting point for further applications in the field of amperometric biosensors; the study could be extended to other oxidase enzymes.

Valutazione del rapporto urinario proteine totali/creatinina e albumina/creatinina in cani affetti da iperadrenocorticismo e da diabete mellito

INTRODUCTION – In human medicine, diabetes mellitus (DM), hypertension, proteinuria and nephropathy are often associated although it is still not clear whether hypertension is the consequence or the cause of nephropathy and albuminuria. Microalbuminuria, in humans, is an early and sensitive marker which permits timely and effective therapy in the early phase of renal damage. Conversely, in dogs, these relationships were not fully investigated, even though hypertension has been associated with many diseases (Bodey and Michell, 1996). In a previous study, 20% of diabetic dogs were found proteinuric based on a U:P/C > 1 and 46% were hypertensive; this latter finding is similar to the prevalence of hypertension in diabetic people (40-80%) (Struble et al., 1998). In the same canine study, hypertension was also positively correlated with the duration of the disease, as is the case in human beings. Hypertension was also found to be a common complication of hypercortisolism (HC) in dogs, with a prevalence which varies from 50 (Goy-Thollot et al., 2002) to 80% (Danese and Aron, 1994).The aim of our study was to evaluate the urinary albumin to creatinine ratio (U:A/C) in dogs affected by Diabetes Mellitus and HC in order to ascertain if, as in human beings, it could represent an early and more sensitive marker of renal damage than U:P/C. Furthermore, the relationship between proteinuria and hypertension in DM and HC was also investigated. MATERIALS AND METHODS – Twenty dogs with DM, 14 with HC and 21 healthy dogs (control group) were included in the prospective case-control study. Inclusion criteria were hyperglycaemia, glicosuria and serum fructosamine above the reference range for DM dogs and a positive ACTH stimulation test and/or low-dose dexamethasone test and consistent findings of HC on abdominal ultrasonography in HC dogs. Dogs were excluded if affected by urinary tract infections and if the serum creatinine or urea values were above the reference range. At the moment of inclusion, an appropriate therapy had already been instituted less than 1 month earlier in 12 diabetic dogs. The control dogs were considered healthy based on clinical exam and clinicopathological findings. All dogs underwent urine sample collection by cystocentesis and systemic blood pressure measurement by means of either an oscillometric device (BP-88 Next, Colin Corporation, Japan) or by Doppler ultrasonic traducer (Minidop ES-100VX, Hadeco, Japan). The choice of method depended on the dog’s body weight: Doppler ultrasonography was employed in dogs < 20 kg of body weight and the oscillometric method in the other subjects. Dogs were considered hypertensive whenever systemic blood pressure was found ≥ 160 mmHg. The urine was assayed for U:P/C and U:A/C (Gentilini et al., 2005). The data between groups were compared using the Mann-Whitney U test. The reference ranges for U:P/C and U:A/C had already been established by our laboratory as 0.6 and 0.05, respectively. U:P/C and U:A/C findings were correlated to systemic blood pressure and Spearman R correlation coefficients were calculated. In all cases, p < 0.05 was considered statistically significant. RESULTS – The mean ± sd urinary albumin concentration in the three groups was 1.79 mg/dl ± 2.18; 20.02 mg/dl ± 43.25; 52.02 mg/dl ± 98.27, in healthy, diabetic and hypercortisolemic dogs, respectively. The urine albumin concentration differed significantly between healthy and diabetic dogs (p = 0.008) and between healthy and HC dogs (p = 0.011). U:A/C values ranged from 0.00 to 0.34 (mean ± sd 0.02 ± 0.07), 0.00 to 6.72 (mean ± sd 0.62 ± 1.52) and 0.00 to 5.52 (mean ± sd 1.27 ± 1.70) in the control, DM and HC groups, respectively; U:P/C values ranged from 0.1 to 0.6 (mean ± sd 0.17 ± 0.15) 0.1 to 6.6 (mean ± sd 0.93 ± 1.15) and 0.2 to 7.1 (mean ± sd 1.90 ± 2.11) in the control, DM and HC groups, respectively. In diabetic dogs, U:A/C was above the reference range in 11 out of 20 dogs (55%). Among these, 5/20 (25%) showed an increase only in the U:A/C ratio while, in 6/20 (30%), both the U:P/C and the U:A/C were abnormal. Among the latter, 4 dogs had already undergone therapy. In subjects affected with HC, U:P/C and U:A/C were both increased in 10/14 (71%) while in 2/14 (14%) only U:A/C was above the reference range. Overall, by comparing U:P/C and U:A/C in the various groups, a significant increase in protein excretion in disease-affected animals compared to healthy dogs was found. Blood pressure (BP) in diabetic subjects ranged from 88 to 203 mmHg (mean ± sd 143 ± 33 mmHg) and 7/20 (35%) dogs were found to be hypertensive. In HC dogs, BP ranged from 116 to 200 mmHg (mean ± sd 167 ± 26 mmHg) and 9/14 (64%) dogs were hypertensive. Blood pressure and proteinuria were not significantly correlated. Furthermore, in the DM group, U:P/C and U:A/C were both increased in 3 hypertensive dogs and 2 normotensive dogs while the only increase of U:A/C was observed in 2 hypertensive and 3 normotensive dogs. In the HC group, the U:P/C and the U:A/C were both increased in 6 hypertensive and 2 normotensive dogs; the U:A/C was the sole increased parameter in 1 hypertensive dog and in 1 dog with normal pressure. DISCUSSION AND CONCLUSION- The findings of this study suggest that, in dogs affected by DM and HC, an increase in U:P/C, U:A/C and systemic hypertension is frequently present. Remarkably, some dogs affected by both DM and HC showed an U:A/C but not U:P/C above the reference range. In diabetic dogs, albuminuria was observed in 25% of the subjects, suggesting the possibility that this parameter could be employed for detecting renal damage at an early phase when common semiquantiative tests and even U:P/C fall inside the reference range. In HC dogs, a higher number of subjects with overt proteinuria was found while only 14% presented an increase only in the U:A/C. This fact, associated with a greater number of hypertensive dogs having HC rather than DM, could suggest a greater influence on renal function by the mechanisms involved in hypertension secondary to hypercortisolemia. Furthermore, it is possible that, in HC dogs, the diagnosis was more delayed than in DM dogs. However, the lack of a statistically significant correlation between hypertension and increased protein excretion as well as the apparently random distribution of proteinuric subjects in normotensive and hypertensive cases, imply that other factors besides hypertension are involved in causing proteinuria. Longitudinal studies are needed to further investigate the relationship between hypertension and proteinuria.

Diabete ed ischemia critica degli arti inferiori. Studio del danno della parete arteriosa e del ruolo dell'endotelio circolante nella riparazione tessutale e nella neoangiogenesi

Objectives In diabetic and non diabetic patients with peripheral artery obstructive disease (PAOD), we sought to establish whether the vascular wall damage, the mature circulating endothelium and the "in situ" neoangiogenesis are related with each other. Design In the peripheral blood of diabetic patients suffering critical ischaemia associated with peripheral artery disease, low levels and poor function of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were observed. Moreover, circulating endothelial cells (CECs) have been described in different conditions of vascular injury. In this type of disorders, which are all characterized by endothelial damage, neoangiogenesis plays a key role. Materials In the study we recruited 22 diabetic and 16 non diabetic patients, all of them suffering PAOD and critical ischaemia; healthy subjects and multiorgan donors have also been considered like controls. Methods Histopathologic characterization was performed on arterial tissue samples under a light microscope. Flow cytofluorimetric analysis was used to quantify CECs in peripheral blood samples. "In situ" expression of the Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and Metalloproteinase 9 (MMP-9) transcripts was quantified in a Real Time-PCR analysis. Circulating VEGF concentration was determined by an ELISA assay. Results Arterial wall from diabetic patients, compared with non diabetic subjects, revealed a higher incidence of serious lesions (60% vs 47%) and a lower number of capillaries (65% vs 87%). Mean number of CECs/ml was significantly increased in all patients, compared to healthy controls (p=0.001). Compared to healthy subjects, VEGF transcripts expression resulted significantly higher in diabetic patients and in all patients (p<0.05) and a similar result was obtained in the MMP-9 transcripts expression. Serum VEGF concentration was significantly increased in PAOD patients correlated with controls (p=0.0431). Conclusions Our study demonstrates that in all patients considered, probably, regressive phenomenons prevail on reparative ones, causing an inesorable and progressive degeneration of the vascular wall, worse by diabetes. The vascular damage can be monitored by determining CECs number and its severity and development are emphasized by the MMP-9 transcripts expression. The "in situ" VEGF increased expression seems to be the evidence of a parietal cells bid to induce local angiogenesis. This reparing mechanism could induce the EPCs mobilitation by means the release of VEGF from the arterial wall. The mechanism, however, is ineffective like demonstrated by the EPCs reduced number and activities observed in patients suffering PAOD and critical ischaemia.

Studio e caratterizzazione di biosensori sviluppati su dispositivi inorganici ed organici

L’attività di dottorato qui descritta ha riguardato inizialmente lo sviluppo di biosensori elettrochimici semplificati per la rilevazione di DNA e successivamente lo studio di dispositivi organici ad effetto di campo per la stimolazione e il rilevamento dell’attività bioelettrica di cellule neuronali. Il lavoro di ricerca riguardante il prima parte è stato focalizzato sulla fabbricazione e sulla caratterizzazione di un biosensore a due elettrodi per la rilevazione di DNA solubile , facilmente producibile a livello industriale. Tale sensore infatti, è in grado di leggere livelli diversi di correnti faradiche sulle superfici in oro degli elettrodi, a discrezione di un eventuale ibridizzazione del DNA da analizzare su di esse. I risultati ottenuti riguardo a questo biosensore sono :la paragonabilità dello stesso con i sensori standard a tre elettrodi basati sulla medesima metodica, la possibilità di effettuare due misure in parallelo di uno stesso campione o di 2 diversi campioni su di uno stesso di dispositivo e la buona applicabilità della chimica superficiale a base di tale biosensore a superfici create con tecnologie industriali. Successivamente a tali studi, mi sono focalizzato sull’utilizzo di dispositivi organici ad effetto campo (in particolare OTFT) per lo sviluppo di un biosensore capace di stimolare e registrare l’attività bioelettrica di cellule neuronali. Inizialmente sono state identificate le caratteristiche del materiale organico utilizzato e successivamente del dispositivo fabbricato pre e post esposizione all’ambiente fisiologico. Poi, sono stati effettuati esperimenti per osservare la capacità di stimolare e di leggere i segnali elettrogenici da parte dell’OTFT. I risultati ottenuti da tali studi sono che: il materiale organico ed il dispositivo mantengo le loro caratteristiche morfologiche e funzionali dopo l’esposizione per giorni all’ambiente fisiologico. Inoltre l’OFET in grado di stimolare il cambiamento delle tensioni di membrana cellulari e contemporaneamente di registrare tali variazioni e le eventuali risposte cellulari provocate da esse.

Diabete ed ischemia critica degli arti inferiori. Valutazione degli indicatori sierologici di danno di parete: determinazione quantitativa delle cellule endoteliali circolanti mature

OBIETTIVO : Quantificare le CECs/ml nei pazienti affetti da ischemia critica (IC) degli arti inferiori, eventuali correlazioni tra i fattori di rischio, lo stadio clinico con l’ aumento delle CECs. Valutare i cambiamenti strutturali (calcificazione ed infiltratto infiammatorio) e l’ angiogenesi (numero di capillari /sezione) della parete arteriosa. MATERIALI E METODI: Da Maggio 2006 ad Aprile 2008 in modo prospettico abbiamo arruolato paziente affetti da IC da sottoporre ad intervento chirurgico. In un data base abbiamo raccolto : caratteristiche demografiche, fattori di rischio, stadiazione dell'IC secondo Leriche-Fontaine (L-F), il tipo di intervento chirurgico. Per ogni paziente abbiamo effettuato un prelievo ematico di 2 ml per la quantificazione immunomagnetica delle CECs e prelievo di parete arteriosa. RISULTATI: In modo consecutivo abbiamo arruolato 33 pazienti (75.8% maschi) con età media di 71 aa (range 34-91aa), affetti da arteriopatia ostruttiva cronica periferica al IV stadio di L-F nel 84.8%, da cardiopatia ischemica cronica nel 60.6%, da ipertensione arteriosa nel 72.7% e da diabete mellito di II tipo nel 66.6%. Il valore medio di CECs/ml è risultato significativamente più elevato (p= 0.001) nei soggetti affetti da IC (CECs/ml =531.24 range 107- 3330) rispetto ai casi controllo (CECs/ml = 125.8 range 19-346 ). Le CECs/ml nei pazienti diabetici sono maggiori rispetto alle CECs/ml nei pazienti non diabetici ( 726.7 /ml vs 325.5/ml ), p< 0.05 I pazienti diabetici hanno presentato maggior incidenza di lesioni arteriose complesse rispetto ai non diabetici (66% vs 47%) e minor densità capillare (65% vs 87%). Conclusioni : Le CECs sono un marker sierologico attendibile di danno vascolare parietale, la loro quantità è maggiore nei pazienti diabetici e ipertesi. La minor capacità angiogenetica della parete arteriosa in presenza di maggior calcificazioni ed infiltrato infiammatorio nei diabetici, dimostra un danno istopatologico di parete maggiore .

Realizzazione di un applicativo di gestione della glicemia con interfaccia in wpf e sincronizzazione con webservice

Realizzazione di un applicativo in wpf: Glicemico. Attraverso questo applicativo le infermiere inseriranno le misurazioni di glicemia nel sangue del paziente e potranno inviare un messaggio al medico nel momento in cui si ha urgenza di una prescrizione da quest'ultimo. La prescrizione sarà visibile in questo applicativo.

Dispositivi per l'assistenza "home care" dei pazienti diabetici

L’ obiettivo della tesi proposta è volto ad illustrare come la malattia diabetica può essere gestita a livello domiciliare attraverso dispositivi di monitoraggio della glicemia sempre più innovativi. La malattia diabetica è un disturbo metabolico che ha come manifestazione principale un aumento del livello di zucchero nel sangue (glicemia) dovuto ad una ridotta produzione di insulina, l’ormone secreto dal pancreas per utilizzare gli zuccheri e gli altri componenti del cibo e trasformarli in energia. È una delle patologie croniche a più ampia diffusione nel mondo, in particolare nei Paesi industrializzati, e costituisce una delle più rilevanti e costose malattie sociali della nostra epoca, soprattutto per il suo carattere di cronicità, per la tendenza a determinare complicanze nel lungo periodo e per il progressivo spostamento dell’insorgenza verso età giovanili. Le tecnologie applicate alla terapia del diabete hanno consentito negli ultimi vent’anni di raggiungere traguardi molto importanti, soprattutto per quanto riguarda l’ottimizzazione del controllo assiduo dei valori glicemici cercando di mantenerli il più costante possibile e ad un livello simile a quello fisiologico. La comunicazione medico-paziente è stata rivoluzionata dalla telemedicina che, offrendo la possibilità di una comunicazione agevole, permette di ottimizzare l’utilizzo dei dati raccolti attraverso l’automonitoraggio glicemico e di facilitare gli interventi educativi. I glucometri, che misurano la glicemia ‘capillare’, insieme ai microinfusori, sistemi di erogazione dell’insulina sia in maniera continua (fabbisogno basale), che ‘a domanda’ (boli prandiali), hanno sostanzialmente modificato l’approccio e la gestione del diabete da parte del medico, ma soprattutto hanno favorito al paziente diabetico un progressivo superamento delle limitazioni alle normali attività della vita imposte dalla malattia. Con il monitoraggio continuo della glicemia 24 ore su 24 infatti, si ha avuto il vantaggio di avere a disposizione un elevato numero di misurazioni puntiformi nell’arco della giornata attraverso sensori glicemici, che applicati sulla pelle sono in grado di ‘rilevare’ il valore di glucosio a livello interstiziale, per diversi giorni consecutivi e per mezzo di un trasmettitore wireless, inviano le informazioni al ricevitore che visualizza le letture ottenute dal sensore. In anni recenti, il concetto di SAP (Sensor-Augmented Insulin Pump) Therapy, è stato introdotto a seguito di studi che hanno valutato l’efficacia dell’utilizzo della pompa ad infusione continua di insulina (CSII, continuous subcutaneous insulin infusion) associato ai sistemi di monitoraggio in continuo della glicemia (CGM, continuous glucose monitoring) per un significativo miglioramento del controllo glicemico e degli episodi sia di ipoglicemia sia di iperglicemia prolungata. Oggi, grazie ad una nuova funzione è possibile interrompere automaticamente l’erogazione di insulina da parte del microinfusore quando la glicemia, rilevata dal sensore, scende troppo velocemente e raggiunge un limite di allarme. Integrare lettura della glicemia, infusione e sospensione automatica dell’erogazione di insulina in caso di ipoglicemia ha ovviamente aperto la porta al pancreas artificiale.

Smart texile: biosensori elettronici indossabili

In questo lavoro verra presentata la realizzazione e la caratterizzazione di transistor organici basati su un polimero conduttore, il poli(3,4-etilenediossitiofene) polistirene sulfonato, o PEDOT:PSS. Tali transistor rientrano nella categoria degli OECT o transistor elettrochimici organici e hanno la capacita di poter rilevare ed analizzare sostanze chimiche di diverso genere presenti in soluzione. I dispositivi implementati in questa tesi sono stati ottenuti tramite la deposizione del materiale organico conduttivo su substrato tessile al fine di creare un device completamente integrabile in un capo di abbigliamento o in un qualsiasi utilizzo in campo tessile. In particolare questi transistor sono stati studiati per la rilevazione di sostanze quali acido ascorbico, dopamina e adrenalina. Gli ultimi due analiti sono di importanza particolare poiche facenti parte della famiglia dei neurotrasmettitori. Inoltre in questa tesi sono stati creati fili di cotone conduttivi, sempre tramite l'utilizzo di PEDOT:PSS. Tali fili infatti sono risultati ottimi candidati per il trasporto di un segnale elettrico e per questo sono stati implementati nella costruzione di un OECT. La realizzazione dei fili conduttivi potra permettere un ulteriore avanzamento nella completa integrabilita dell'elettronica con il settore tessile. Una peculiarita aggiuntiva di questo lavoro e stata quella di utilizzare il sudore artificiale come elettrolita, oltre al normale PBS che costituisce ormai uno standard in questo tipo di ricerche. L'utilizzo del sudore artificiale rientra nell'ottica futura di un utilizzo di questi sensori come rilevatori di sostanze chimiche emesse dal corpo umano sfruttabili diversi ambiti, ovvero dall'attivita sportiva alla prevenzione, in ambito medico, di diverse malattie.

Self-management di malattie croniche in sistemi di mobile Health: sviluppo di un modello agent-based per casi di diabete

L'obiettivo della tesi è proporre e motivare l'adozione di un modello computazionale Agent-Based nell'ambito del Self-Management di malattie croniche in un sistema di mobile Health. Viene quindi affrontata in maniera approfondita la tematica del mobile Health, settore in grande espansione che vede l'introduzione massiccia dei dispositivi mobili (smartphone, tablet, PDA) in ambito sanitario, e quella del Self-Managment di malattie croniche, un processo di cura caratterizzato dalla partecipazione autonoma del paziente stesso, fornendo una panoramica dei vari approcci computazionali sviluppati. Successivamente vengono presentate le peculiarità dei modelli computazionali risultati dalle ricerche in letteratura strumenti innovati nell'ambito. Nel caso di studio viene adottata la tecnica di modellazione Agent-Based per sviluppare un modello a supporto di malati cronici affetti da diabete mellito di tipo 1. Con la successiva implementazione sulla piattaforma di simulazione MASON, vengono eseguiti diversi esperimenti per dimostrare la fattibilità dell’approccio adottato nell'ambito del Self-Management di malattie croniche.