L'effet de la bulbectomie olfactive sur l'activité de l'adénylate cyclase et la densité des protéines G dans le système limbique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle des récepteurs vasculaires de l'angiotensine II dans la régulation de l'expression des protéines de la matrice extracellulaire, des intégrines et de l'activité des métalloprotéinases de la matrice (MMPs)

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Identification des petits protéoglycanes riches en leucine comme nouveaux substrats de la MMP-13 dans le cartilage humain et caractérisation de leur site de clivage

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Clonage et caractérisation des protéines liant l'élément de réponse à l'insuline (IREBP) du gène de l'angiotensinogène chez le rat

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

HTDE1 : caractérisation, localisation et potentiel transformant d'un membre d'une nouvelle famille de protéines

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation de l'interaction des protéines associées aux microtubules, MAP2 et Tau avec les organelles membranaires et le rôle de ces protéines dans le maintien de la structure de ces organelles

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Modulation des réponses des cellules voisines simples et complexes par un contraste différentiel entre le centre et la périphérie des champs récepteurs dans l'aire 17 du chat

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Modulation de l'expression des protéines Gi et de la signalisation de l'adénylate cyclase par le monoxyde d'azote : implication dans la régulation de la pression sanguine

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle de la conformation des glycoprotéines de l’enveloppe du VIH-1 dans la réponse cytotoxique cellulaire dépendante des anticorps et impact des protéines virales Nef et Vpu

Alors que d’énormes efforts sont mis de l’avant pour mettre en place des stratégies thérapeutiques contre l’infection au VIH-1, il est nécessaire de mieux cerner les déterminants viraux qui aideront à l’efficacité de celles-ci. En ce sens, une volumineuse littérature scientifique suggère que les anticorps contre le VIH-1 possédant une capacité à induire une réponse effectrice dépendante de leur portion Fc puissent jouer un rôle important dans la prévention de l’infection et dans la progression de la maladie. Cependant, peu d’information est disponible concernant les déterminants reconnus par ces anticorps et comment le virus s’en protège. Le but des travaux présentés dans cette thèse est donc d’élucider les mécanismes viraux contrôlant la reconnaissance des cellules infectées par ces anticorps capables d’induire une réponse effectrice. De par les corrélats de protection identifiés au cours de l’essai vaccinal RV144, les travaux présentés ici se concentrent sur la réponse cytotoxique dépendante des anticorps (ADCC), puisqu’il s’agit d’une réponse effectrice suggérée pour avoir joué un rôle dans la protection observée dans le RV144, seul essai vaccinal anti-VIH à avoir démontré un certain degré de protection. De plus, plusieurs anticorps capables d’induire cette réponse contre le VIH sont connus pour reconnaître les glycoprotéines de surface du virus (Env) dans une conformation dite ouverte, c’est-à-dire la conformation adoptée lors de la liaison d’Env avec son récepteur CD4 (épitopes CD4i). Nous avons mis au point deux techniques in vitro permettant d’étudier ces changements de conformation ainsi que leur impact sur la réponse ADCC. Les techniques mises au point, un ÉLISA sur base cellulaire pour mesurer les changements de conformation d’Env ainsi que la mesure de la réponse ADCC par cytométrie en flux, nous ont permis de démontrer comment le virus empêche l’exposition des épitopes d’Env CD4i. L’activité simultanée des protéines accessoires virales Nef et Vpu sur le retrait du récepteur CD4 de la surface des cellules infectées et l’inhibition du facteur de restriction Tétherine / BST-2 par Vpu contrôlent à la fois les niveaux d’Env et de CD4 à la surface cellulaire et donc modulent l’interaction Env-CD4 et ultimement la susceptibilité à la réponse ADCC contre les épitopes CD4i reconnus par des anticorps hautement prévalents lors de l’infection au VIH. Également, nous démontrons comment de petits composés mimant la liaison de CD4 sur Env sont capables de forcer l’exposition des épitopes CD4i, même en présence des protéines Nef et Vpu, et donc d’augmenter la susceptibilité des cellules infectées à la réponse ADCC. Une autre découverte présentée ici est la démonstration que la portion soluble d’Env produite par les cellules infectées peut interagir avec le récepteur CD4 des cellules non-infectées avoisinantes et induire leur reconnaissance et élimination par la réponse ADCC contre Env. Somme toute, la modulation de la réponse ADCC par l’interaction Env–CD4 représente un important pilier de la relation hôte – pathogène du VIH-1 de la perspective des réponses Fc-dépendantes. Les travaux présentés dans cette thèse ont le potentiel d’être utilisés dans l’élaboration de nouvelles stratégies antivirales tout en élargissant les connaissances fondamentales de cette interaction hôte – pathogène.

Rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293

La possibilité de programmer une cellule dans le but de produire une protéine d’intérêt est apparue au début des années 1970 avec l’essor du génie génétique. Environ dix années plus tard, l’insuline issue de la plateforme de production microbienne Escherichia coli, fut la première protéine recombinante (r-protéine) humaine commercialisée. Les défis associés à la production de r-protéines plus complexes et glycosylées ont amené l’industrie biopharmaceutique à développer des systèmes d’expression en cellules de mammifères. Ces derniers permettent d’obtenir des protéines humaines correctement repliées et de ce fait, biologiquement actives. Afin de transférer le gène d’intérêt dans les cellules de mammifères, le polyéthylènimine (PEI) est certainement un des vecteurs synthétiques le plus utilisé en raison de son efficacité, mais aussi sa simplicité d’élaboration, son faible coût et sa stabilité en solution qui facilite son utilisation. Il est donc largement employé dans le contexte de la production de r-protéines à grande échelle et fait l’objet d’intenses recherches dans le domaine de la thérapie génique non virale. Le PEI est capable de condenser efficacement l’ADN plasmidique (vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt) pour former des complexes de petites tailles appelés polyplexes. Ces derniers doivent contourner plusieurs étapes limitantes afin de délivrer le gène d’intérêt au noyau de la cellule hôte. Dans les conditions optimales du transfert de gène par le PEI, les polyplexes arborent une charge positive nette interagissant de manière électrostatique avec les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) qui décorent la surface cellulaire. On observe deux familles d’HSPG exprimés en abondance à la surface des cellules de mammifères : les syndécanes (4 membres, SDC1-4) et les glypicanes (6 membres, GPC1-6). Si l’implication des HSPG dans l’attachement cellulaire des polyplexes est aujourd’hui largement acceptée, leur rôle individuel vis-à-vis de cet attachement et des étapes subséquentes du transfert de gène reste à confirmer. Après avoir optimisées les conditions de transfection des cellules de mammifères CHO et HEK293 dans le but de produire des r-protéines secrétées, nous avons entrepris des cinétiques de capture, d’internalisation des polyplexes et aussi d’expression du transgène afin de mieux comprendre le processus de transfert de gène. Nous avons pu observer des différences au niveau de ces paramètres de transfection dépendamment du système d’expression et des caractéristiques structurelles du PEI utilisé. Ces résultats présentés sous forme d’articles scientifiques constituent une base solide de l’enchaînement dans le temps des évènements essentiels à une transfection efficace des cellules CHO et HEK293 par le PEI. Chaque type cellulaire possède un profil d’expression des HSPG qui lui est propre, ces derniers étant plus ou moins permissifs au transfert de gène. En effet, une étude menée dans notre laboratoire montre que les SDC1 et SDC2 ont des rôles opposés vis-à-vis du transfert de gène. Alors que tous deux sont capables de lier les polyplexes, l’expression de SDC1 permet leur internalisation contrairement à l’expression de SDC2 qui l’inhibe. De plus, lorsque le SDC1 est exprimé à la surface des cellules HEK293, l’efficacité de transfection est augmentée de douze pourcents. En utilisant la capacité de SDC1 à induire l’internalisation des polyplexes, nous avons étudié le trafic intracellulaire des complexes SDC1 / polyplexes dans les cellules HEK293. De plus, nos observations suggèrent une nouvelle voie par laquelle les polyplexes pourraient atteindre efficacement le noyau cellulaire. Dans le contexte du transfert de gène, les HSPG sont essentiellement étudiés dans leur globalité. S’il est vrai que le rôle des syndécanes dans ce contexte est le sujet de quelques études, celui des glypicanes est inexploré. Grâce à une série de traitements chimiques et enzymatiques visant une approche « perte de fonction », l’importance de la sulfatation comme modification post-traductionnelle, l’effet des chaînes d’héparanes sulfates mais aussi des glypicanes sur l’attachement, l’internalisation des polyplexes, et l’expression du transgène ont été étudiés dans les cellules CHO et HEK293. L’ensemble de nos observations indique clairement que le rôle des HSPG dans le transfert de gène devrait être investigué individuellement plutôt que collectivement. En effet, le rôle spécifique de chaque membre des HSPG sur la capture des polyplexes et leur permissivité à l’expression génique demeure encore inconnu. En exprimant de manière transitoire chaque membre des syndécanes et glypicanes à la surface des cellules CHO, nous avons déterminé leur effet inhibiteur ou activateur sur la capture des polyplexes sans pouvoir conclure quant à l’effet de cette surexpression sur l’efficacité de transfection. Par contre, lorsqu’ils sont présents dans le milieu de culture, le domaine extracellulaire des HSPG réduit l’efficacité de transfection des cellules CHO sans induire la dissociation des polyplexes. Curieusement, lorsque chaque HSPG est exprimé de manière stable dans les cellules CHO, seulement une légère modulation de l’expression du transgène a pu être observée. Ces travaux ont contribué à la compréhension des mécanismes d'action du vecteur polycationique polyéthylènimine et à préciser le rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293.

Développement d'une méthode de prédiction de l'orientation et de l'insertion des protéines dans une membrane modèle

Les protéines membranaires intégrales jouent un rôle indispensable dans la survie des cellules et 20 à 30% des cadres de lectures ouverts codent pour cette classe de protéines. La majorité des protéines membranaires se trouvant sur la Protein Data Bank n’ont pas une orientation et une insertion connue. L’orientation, l’insertion et la conformation que les protéines membranaires ont lorsqu’elles interagissent avec une bicouche lipidique sont importantes pour la compréhension de leur fonction, mais ce sont des caractéristiques difficiles à obtenir par des méthodes expérimentales. Des méthodes computationnelles peuvent réduire le temps et le coût de l’identification des caractéristiques des protéines membranaires. Dans le cadre de ce projet de maîtrise, nous proposons une nouvelle méthode computationnelle qui prédit l’orientation et l’insertion d’une protéine dans une membrane. La méthode est basée sur les potentiels de force moyenne de l’insertion membranaire des chaînes latérales des acides aminés dans une membrane modèle composèe de dioléoylphosphatidylcholine.

Fonctions et régulations des protéines Crumbs dans la morphogenèse des tissus épithéliaux

Les tissus épithéliaux recouvrent les surfaces et les cavités du corps et fonctionnent comme des barrières sélectives capables d’échanges entre les différents compartiments de l’organisme. La fonctionnalité de ces tissus repose notamment sur la mise en place et le maintien d’une asymétrie structurale des cellules épithéliales, aussi appelée « polarité épithéliale ». La modulation des mécanismes orchestrant l’asymétrie membranaire est centrale dans la formation et le maintien de l’architecture des tissus épithéliaux. Ainsi, des défauts de polarité épithéliale provoquent des anomalies morphologiques et fonctionnelles des tissus épithéliaux, qui peuvent contribuer au cancer chez l’Homme. C’est pourquoi, la compréhension des processus liés à la polarité épithéliale constitue des objectifs cruciaux dans la biologie des épithéliums et dans la santé humaine, pour assurer le développement de nouvelles thérapies liées au rétablissement des fonctions soutenues par une asymétrie membranaire. Les mécanismes de polarité épithéliale et leurs fonctions signalétiques dans la morphogenèse des tissus épithéliaux jouent un rôle central dans ma thèse et font l’objet de mon introduction. Mon projet de doctorat a consisté à caractériser la fonction et la régulation de Crumbs, un acteur clé dans la mise en place du domaine apical, dans le contrôle de la morphologie cellulaire et dans la morphogenèse des tissus épithéliaux. C’est pourquoi, l’étude de la régulation de la fonction de Crb au sein de la cellule épithéliale revêt un rôle capital dans la compréhension de la biologie des épithéliums. Dans ce cadre, nous avons d’abord permis d’approfondir les modalités d’une éventuelle fonction du domaine extracellulaire de CRB3A. De plus, nous montrons que la GTPase Rac1 permet de contrôler Crumbs dans un contexte tridimensionnel. Ainsi, nous proposons un modèle fonctionnel de Crumbs, soutenu par des approches in vitro et in vivo, dans le contrôle de la morphologie cellulaire et la morphogenèse des tissus tridimensionnels.

Prétraitement d'un isolat de protéines de lin par haute pression hydrostatique : impacts sur la structure protéique, l'hydrolyse enzymatique et les capacités antioxydantes des hydrolysats finaux

Les graines de lin sont des oléagineux largement cultivés au Canada. Cependant, les résidus générés suite au processus d’extraction de l’huile contiennent une importante quantité de protéines et peuvent être valorisées dans l’alimentation humaine en raison, principalement, de certaines fractions peptidiques possédant des propriétés bioactives. Dans le cadre de ce travail, l’influence des hautes pressions hydrostatiques (HPH) sur un isolat de protéines de lin a été étudiée concernant les modifications de la structure protéique, l’hydrolyse enzymatique ainsi que l’activité antioxydante des hydrolysats. Ainsi, des solutions protéiques de lin (1% m/v) ont été soumises à un traitement de HPH à 600 MPa pendant 5 et 20 minutes, à 20°C et comparés à des échantillons non-pressurisés. Deux traitements subséquents d’hydrolyse ont été effectués suite au traitement ou non de pressurisation : une première hydrolyse trypsique suivie d’une deuxième par la pronase. Dans un premier temps, la caractérisation de l’isolat protéique de lin pressurisé et non pressurisé a été réalisée par spectrofluorimétrie et par une analyse de la taille des particules afin d’étudier l’effet de la pressurisation sur les HPH la matrice protéique végétale. Par la suite, les hydrolysats protéiques ont été caractérisés par HPLC-MS et leur capacité antioxydante a été déterminée par ORAC. Les résultats ont démontré que le niveau de pressurisation et la durée du traitement ont un impact sur la structure protéique en induisant la dissociation des protéines, et la formation d’agrégats. Ceux-ci seraient occasionnés par la décompression ou créés durant l’entreposage des isolats. Suite à l’hydrolyse enzymatique des solutions protéiques pressurisées ou non par la trypsine seule et par la trypsine-pronase, les analyses chromatographiques ont révélé que la concentration de certains peptides a été modifiée lorsque la trypsine seule était utilisée après un traitement à HPH. Enfin, les HPH ont amélioré la capacité antioxydante des hydrolysats obtenus lors de l’hydrolyse trypsine-pronase comparativement au contrôle non-pressurisé.

Mise en évidence de dysfonctions liées au développement de l'endométriose péritonérale Contributions angio-inflammatoires des cytokines et prostaglandines

L’endométriose est une maladie gynécologique, touchant les femmes en âge de procréer. Cette pathologie est caractérisée par la présence de tissu endométrial ectopique, c’est-à-dire en dehors de la cavité utérine. Des dysfonctions du système immunitaire sont de plus en plus souvent suspectées comme étant un des éléments responsables de la pathogenèse de cette maladie. L’objectif général de ce projet a donc été d’étudier les mécanismes cellulaires de molécules pro-inflammatoires aux propriétés variées et à l’expression anormalement élevée dans cette pathologie, que sont MIF et les prostaglandines PGE2 et PGF2α, dans les anomalies inflammatoires et invasives en cause dans cette pathologie. La première partie de nos travaux a porté sur l’étude d’un modèle murin de l’endométriose déficient du gène MIF. Le nombre et le volume des lésions collectées à partir des souris déficientes pour le gène MIF sont significativement inférieurs à ceux mesurés dans des souris sauvages utilisées comme contrôle. L’analyse par PCR des cellules isolées des lésions de souris déficientes du gène MIF a révélé une expression réprimée des protéines d’adhésion, d’inflammation et d’angiogenèse. Ces données démontrent pour la première fois que le MIF agit directement sur la croissance et la progression de lésions d’endométriose in vivo. Une partie de nos travaux a porté sur les molécules nécessaires au métabolisme de PGE2 et PGF2α dans l’endomètre eutopique des femmes normales et l’endomètre eutopique et ectopique des femmes atteintes d’endométriose. Selon nos données, l’expression de certains de ces facteurs est perturbée durant cette maladie, ce qui peut avoir des effets délétères sur la physiologie de la procréation. La stimulation des cellules ectopiques par PGF2α entraîne une libération accrue de VEGF et CXCL-8, ceci via l’induction de COX-2 et des deux variants d’épissage du récepteur FP. De plus, la PKC joue un rôle dans ce phénomène, dépendamment et indépendamment de la PLC. Par son effet inducteur sur la libération de VEGF et CXCL-8, PGF2α pourrait favoriser l’aspect inflammatoire et le développement ectopique des lésions d’endométriose, notamment par des phénomènes d’angiogenèse et de prolifération cellulaire accrus. L’effet de PGF2α sur la libération de VEGF et CXCL-8 par les cellules endométriales ectopiques pourrait également expliquer les quantités élevées de ces cytokines dans le liquide péritonéal des femmes atteintes d’endométriose, un phénomène suspecté dans l’infertilité et les douleurs associées à cette maladie. Nos derniers résultats obtenus à partir du liquide péritonéal montrent un profil cytokinique en faveur de l’angiogenèse et la prolifération des lésions d’endométriose, avec une forte augmentation des facteurs suivants : EGF, FGF-2, IL-1α, MIP-1β, TGFα, PDGF-AA, PDGF-BB, MCP-3, sCD40L, Gro Pan, IL-17α, MDC et Rantes, confortant nos observations préalables redéfinissant la maladie comme étant d’origine angio-inflammatoire. L’endométriose et ses symptômes sont des phénomènes complexes ayant probablement plus qu’une seule origine. Parmi les nombreux facteurs à l’expression altérée dans l’endométriose, notre étude montre que MIF, PGE2 et PGF2α, ainsi qu’une pléthore de facteurs pro-angiogéniques pourraient être de ceux jouant un rôle dans l’infertilité et les douleurs reliées à cette maladie.

APRIN(PDS5B) et PALB2, deux protéines impliquées dans la réparation de l’ADN par recombinaison homologue et l’apparition de cancers

Au Canada, en 2015, il était estimé que 78 000 personnes allaient mourir d’un cancer, représentant 30 % de tous les décès et faisant de celui-ci la première cause de mortalité. De plus, 196 900 nouveaux cas de cancers seraient découverts au cours de cette même année (Canadian Cancer Society’s Advisory Committee on Cancer Statistics. Canadian Cancer Statistics 2015. Toronto, ON : Canadian Cancer Society; 2015). L’intégrité du génome est chaque jour menacée par des conditions environnementales qui endommagent l’ADN (ultraviolets, produits chimiques divers, etc.). Parmi les différents types de lésions, l’un des plus délétères et pouvant mener au cancer est la cassure double-brin (CDB). Celle-ci peut être réparée suivant deux mécanismes majeurs : la jonction des extrémités non homologues (Non-Homologous End-Joining ou NHEJ) ou la Recombinaison Homologue (RH). Cette dernière, prépondérante pendant les phases S/G2, consiste en la réparation d’une CDB grâce à l’utilisation d’une chromatide soeur comme modèle, permettant une réparation fidèle du dommage. La RH est sous la dépendance de diverses protéines, dont RAD51, PALB2 et BRCA2. Ces deux dernières sont connues pour être mutées dans les cancers du sein et des ovaires. Ainsi, la compréhension de l’implication de chaque acteur dans la RH est un objectif fondamental dans la lutte contre le cancer et constitue l’objectif général de cette thèse. En 2012, une étude a montré qu’une nouvelle protéine, APRIN (Androgen-induced PRoliferation INhibitor), appartenant au complexe cohésine, interagissait avec BRCA2 et jouait un rôle dans la RH. Les rôles précis d’APRIN dans ce mécanisme restaient toutefois à être définis. Le projet principal de cette thèse repose sur la caractérisation fonctionnelle d’APRIN dans la réparation par RH. Nous révélons qu’APRIN aurait un rôle spécifique et indépendant de celui de la cohésine dans la RH, et pourrait agir à diverses étapes cruciales de ce mécanisme. De plus, nos données montrent que le niveau d’expression d’APRIN pourrait être un marqueur de prédiction dans le cancer ovarien. Étant donné qu’APRIN interagit aussi avec PALB2, autre partenaire essentiel de BRCA2, nous avons également étudié et caractérisé les fonctions de divers mutants de PALB2. Nous faisons ainsi la découverte inattendue d’un nouveau phénotype induit par une troncation de cette protéine associée à certains cancers agressifs. Ainsi, cette thèse apporte des informations supplémentaires et indispensables à la compréhension de la réparation de l’ADN par RH et de la survenue de certains cancers.