Detection of cytotoxic activity on Vero cells in clinical isolates of Serratia marcescens

Cytotoxin production was studied in 60 Serratia marcescens strains isolated from hospitalized patients. Association of cytotoxic activity with serotype, source of isolation and presence of plasmids was also evaluated. Thirteen of the 60 S. marcescens strains produced a cytotoxic effect on Vero cells. These strains were isolated from distinct clinical sources and classified into seven different serotypes (O1:H7; O4:NM; O10:NT; O19:NM; O6,14:H4; O6,14:NM and O6,14:H1). No relationship was observed between cytotoxic activity and clinical source or serotypes of the strains. Plasmids from five cytotoxin-producing S. marcescens strains were transferred to E. coli K12/711. The transconjugants did not exhibit cytotoxicity, indicating that the cytotoxic effect is not plasmid-mediated among these strains. Although a cytotoxic activity was demonstrated in filtrates of some S. marcescens strains, further studies should be performed to assess the role of this toxin in pathogenesis

Endothelium-dependent vasodilation in response to Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: an in vitro study on canine arteries

Early systemic arterial hypotension is a common clinical feature of Pseudomonas septicemia. To determine if Pseudomonas aeruginosa endotoxin induces the release of endothelium-derived nitric oxide (EDNO), an endogenous nitrovasodilator, segments of canine femoral, renal, hepatic, superior mesenteric, and left circumflex coronary arteries were suspended in organ chambers (physiological salt solution, 95% O2/5% CO2, pH 7.4, 37oC) to measure isometric force. In arterial segments contracted with 2 µM prostaglandin F2a, Pseudomonas endotoxin (lipopolysaccharide (LPS) serotype 10(Habs) from Pseudomonas aeruginosa (0.05 to 0.50 mg/ml)) induced concentration-dependent relaxation of segments with endothelium (P<0.05) but no significant change in tension of arteries without endothelium. Endothelium-dependent relaxation in response to Pseudomonas LPS occurred in the presence of 1 µM indomethacin, but could be blocked in the coronary artery with 10 µM NG-monomethyl-L-arginine (L-NMMA), a competitive inhibitor of nitric oxide synthesis from L-arginine. The inhibitory effect of L-NMMA on LPS-mediated vasorelaxation of the coronary artery could be reversed by exogenous 100 µM L-arginine but not by 100 µM D-arginine. These experiments indicate that Pseudomonas endotoxin induces synthesis of nitric oxide from L-arginine by the vascular endothelium. LPS-mediated production of EDNO by the endothelium, possibly through the action of constitutive nitric oxide synthase (NOSc), may decrease systemic vascular resistance and may be the mechanism of early hypotension characteristic of Pseudomonas septicemia.

Antimicrobial resistance patterns of Haemophilus influenzae isolated from patients with meningitis in São Paulo, Brazil

From 1989 to 1995, a total of 391 Haemophilus influenzae isolates were recovered from the cerebrospinal fluid (CSF) of hospitalized patients in São Paulo, Brazil. The majority of strains were isolated from infants aged less than 5 years. Strains belonging to biotype I (64.7%), biotype II (34.5%) and biotype IV (0.76%) were detected. Ninety-nine percent of these strains were serotype b. Minimal inhibitory concentration (MIC) was determined for ampicillin, chloramphenicol and ceftriaxone. The ß-lactamase assay was performed for all strains. The rate of ß-lactamase producer strains ranged from 10 to 21.4% during a period of 7 years, with an overall rate of 13.8%. Of the 391 strains analyzed, none was ß-lactamase negative ampicillin resistant (BLNAR). A total of 9.7% of strains showed resistance to both ampicillin and chloramphenicol; however, 4% of them were resistant to ampicillin only and 2% to chloramphenicol. All strains were susceptible to ceftriaxone and the MIC90 was 0.007 µg/ml, suggesting that ceftriaxone could be an option for the treatment of bacterial meningitis in pediatric patients who have not been screened for drug sensitivity.

Immunogenicity of a 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine in Brazilian elderly

Serum antibodies specific for the capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae provide protection against invasive pneumococcal infection. In Brazil, this vaccine has been used for people over 65 years with clinical risk to develop pneumococcal infection since 1999. We evaluated the immune response of 102 elderly subjects (75.5% females and 24.5% males) with a mean age of 71 years, and 19 young healthy adults (63.2% females and 36.8% males) with a mean age of 27 years. The elderly study group consisted of outpatients who received follow-up care in the Geriatric Department of General Hospital, Faculty of Medicine, University of São Paulo. None had acute illness at the time of vaccination. Both groups were immunized with one intra-deltoid injection with 0.5 ml of a 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. The total IgG specific antibody concentrations to capsular polysaccharides 1, 3, 5, 6B, 8, and 14 were determined against pre- and 1-month post-vaccination sera. All samples were analyzed according to the second-generation pneumococcal polysaccharide ELISA protocol. We observed that the pneumococcal polysaccharide vaccine evoked consistent antibody increase for serotypes 1, 5, 6B, 8, and 14 (geometric mean concentration increase of 2.46 in the elderly and 2.84 in the young adults). Otherwise, we observed no increase in antibody concentration for serotype 3 in both groups.

Molecular epidemiology of type 1 and 2 dengue viruses in Brazil from 1988 to 2001

Dengue is a mosquito-borne viral infection that in recent decades has become a major international public health concern. Epidemic dengue fever reemerged in Brazil in 1981. Since 1990 more than one dengue virus serotype has been circulating in this tropical country and increasing rates of dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome have been detected every year. Some evidence supports the association between the introduction of a new serotype and/or genotype in a region and the appearance of dengue hemorrhagic fever. In order to study the evolutionary relationships and possible detection of the introduction of new dengue virus genotypes in Brazil in the last years, we analyzed partial nucleotide sequences of 52 Brazilian samples of both dengue type 1 and dengue type 2 isolated from 1988 to 2001 from highly endemic regions. A 240-nucleotide-long sequence from the envelope/nonstructural protein 1 gene junction was used for phylogenetic analysis. After comparing the nucleotide sequences originally obtained in this study to those previously studied by others, and analyzing the phylogenetic trees, we conclude that, after the initial introduction of the currently circulating dengue-1 and dengue-2 genotypes in Brazil, there has been no evidence of introduction of new genotypes since 1988. The increasing number of dengue hemorrhagic fever cases seen in Brazil in the last years is probably associated with secondary infections or with the introduction of new serotypes but not with the introduction of new genotypes.

Attenuation and immunogenicity of recombinant yellow fever 17D-dengue type 2 virus for rhesus monkeys

A chimeric yellow fever (YF)-dengue serotype 2 (dengue 2) virus was constructed by replacing the premembrane and envelope genes of the YF 17D virus with those from dengue 2 virus strains of Southeast Asian genotype. The virus grew to high titers in Vero cells and, after passage 2, was used for immunogenicity and attenuation studies in rhesus monkeys. Subcutaneous immunization of naive rhesus monkeys with the 17D-D2 chimeric virus induced a neutralizing antibody response associated with the protection of 6 of 7 monkeys against viremia by wild-type dengue 2 virus. Neutralizing antibody titers to dengue 2 were significantly lower in YF-immune animals than in YF-naive monkeys and protection against challenge with wild-type dengue 2 virus was observed in only 2 of 11 YF-immune monkeys. An anamnestic response to dengue 2, indicated by a sharp increase of neutralizing antibody titers, was observed in the majority of the monkeys after challenge with wild-type virus. Virus attenuation was demonstrated using the standard monkey neurovirulence test. The 17D-D2 chimera caused significantly fewer histological lesions than the YF 17DD virus. The attenuated phenotype could also be inferred from the limited viremias compared to the YF 17DD vaccine. Overall, these results provide further support for the use of chimeric viruses for the development of a new live tetravalent dengue vaccine.

Antibody response to pneumococcal capsular polysaccharide vaccine in Down syndrome patients

The majority of children with Down syndrome (DS) tend to have frequent bacterial infections including recurrent respiratory infections. Our objective was to evaluate the production of antibodies to pneumococcal polysaccharide antigens after active immunization in DS subjects. IgG antibodies to pneumococcal serotypes (1, 3, 6B, 9V, and 14) were measured before and 6 weeks after immunization with a 23-valent pneumococcal vaccine (Pneumo23®, Pasteur-Merrieux) in 6- to 13-year-old DS children (N = 17) and in aged-matched normal controls (N = 30). An adequate response was defined as a 4-fold increase over baseline or a post-immunization level of specific pneumococcal serotype antibody > or = 1.3 µg/mL. After immunization, all DS children had an increase in post-immunization levels against all serotypes analyzed. A 4-fold or more increase was observed in all DS children concerning serotypes 1 and 14, in 90% of subjects for serotypes 3 and 9V, and in 65% for serotype 6B. Regarding this increase, 8 of the 17 DS children had an adequate response to all serotypes analyzed, 8/17 patients to 4 serotypes and 1/17 to 3 serotypes. However, when we compared post-immunization levels between DS children and controls, we observed lower levels in the former group (P < 0.05) for all serotypes except serotype 3. We conclude that pneumococcal polysaccharide immunization could be beneficial for these DS children.

Random amplification of polymorphic DNA reveals clonal relationships among enteropathogenic Escherichia coli isolated from non-human primates and humans

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains are important agents of infantile diarrhea all over the world, gaining even greater importance in developing countries. EPEC have also been isolated from various animal species, but most isolates belong to serotypes that differ from those recovered from humans. However, it has been demonstrated that several isolates from non-human primates belong to the serogroups and/or serotypes related to those implicated in human disease. The objective of this study was to evaluate the genetic differences between thirteen strains isolated from non-human primates and the same number of strains isolated from human infections. Human isolates belonged to the same serogroup/serotype as the monkey strains and the evaluation was done by analysis of random amplified polymorphic DNA. Dendrogram analysis showed that there was no clustering between human and monkey strains. Human and non-human isolates of the EPEC serotypes O127:H40 and O128:H2 shared 90 and 87% of their bands, respectively, indicating strong genomic similarity between the strains, leading to the speculation that they may have arisen from the same pathogenic clone. To our knowledge, this study is the first one comparing genomic similarity between human and non-human primate strains and the results provide further evidence that monkey EPEC strains correlate with human EPEC, as suggested in a previous investigation.

Dengue virus-induced regulation of the host cell translational machinery

Dengue virus (DV)-induced changes in the host cell protein synthesis machinery are not well understood. We investigated the transcriptional changes related to initiation of protein synthesis. The human hepatoma cell line, HepG2, was infected with DV serotype 2 for 1 h at a multiplicity of infection of one. RNA was extracted after 6, 24 and 48 h. Microarray results showed that 36.5% of the translation factors related to initiation of protein synthesis had significant differential expression (Z-score ≥ ±2.0). Confirmation was obtained by quantitative real-time reverse transcription-PCR. Of the genes involved in the activation of mRNA for cap-dependent translation (eIF4 factors), eIF4A, eIF4G1 and eIF4B were up-regulated while the negative regulator of translation eIF4E-BP3 was down-regulated. This activation was transient since at 24 h post-infection levels were not significantly different from control cells. However, at 48 h post-infection, eIF4A, eIF4E, eIF4G1, eIF4G3, eIF4B, and eIF4E-BP3 were down-regulated, suggesting that cap-dependent translation could be inhibited during the progression of infection. To test this hypothesis, phosphorylation of p70S6K and 4E-BP1, which induce cap-dependent protein synthesis, was assayed. Both proteins remained phosphorylated when assayed at 6 h after infection, while infection induced dephosphorylation of p70S6K and 4E-BP1 at 24 and 48 h of infection, respectively. Taken together, these results provide biological evidence suggesting that in HepG2 cells DV sustains activation of the cap-dependent machinery at early stages of infection, but progression of infection switches protein synthesis to a cap-independent process.

Étude des gènes d'Actinobacillus pleuropneumoniae exprimés en conditions d'infection

Actinobacillus pleuropneumoniae est l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine. La bactérie se transmet par voies aériennes et contacts directs. Plusieurs facteurs de virulence ont été identifiés, nommément les polysaccharides capsulaires, les lipopolysaccharide, les exotoxines ApxI à IV et de nombreux mécanismes d’acquisition du fer. Aucun vaccin efficace contre tous les sérotypes de la bactérie n’a encore été élaboré. Afin de mieux comprendre de quelle façon A. pleuropneumoniae régule la transcription de ses nombreux facteurs de virulence et de découvrir de nouvelles cibles potentielles pour l’élaboration de vaccins efficaces, le profil transcriptomique de la bactérie a été étudié dans des conditions simulant l’infection ainsi qu’à la suite d’une infection naturelle aiguë chez l’animal. Des biopuces de première et de seconde génération (AppChip1 et AppChip2) comportant respectivement 2025 cadres de lecture ouverts (ORF) de la version préliminaire du génome d’A. pleuropneumoniae sérotype 5b souche L20 et 2033 ORF de la version finale annotée du même génome ont été utilisées. Dans un premier temps, des expériences réalisées dans des conditions de concentration restreinte en fer ont permis d’identifier 210 gènes différentiellement exprimés, dont 92 étaient surexprimés. Plusieurs nouveaux mécanismes d’acquisition du fer ont pu être identifiés, incluant un système homologue au système YfeABCD de Yersinia pestis, impliqué dans l’acquisition du fer chélaté, ainsi que des gènes homologues aux composantes du système HmbR de Neisseria meningitidis impliqué dans l’acquisition du fer à partir de l’hémoglobine. Dans des conditions de culture permettant la formation de biofilms, les gènes tadC et tadD d’un opéron tad (« tight adherence locus ») putatif, les gènes pgaBC impliqués dans la synthèse d’un polysaccharide de la matrice du biofilm ainsi que deux gènes présentant de fortes homologies avec un gène codant pour l’adhésine auto-transporteur Hsf retrouvée chez Haemophilus influenzae ont montré une surexpression significative. Plusieurs de ces gènes ont également été retrouvés lors d’expériences réalisées avec des cellules épithéliales d’origine pulmonaire en culture, qui ont permis d’identifier 170 gènes différentiellement exprimés après la croissance planctonique au-dessus des cellules, et 131 autres suite à l’adhésion à ces cellules. Parmis les gènes surexprimés, les gènes tadB et rcpA de l’opéron tad putatif, les gènes pgaBC ainsi que le gène codant pour l’homologue d’Hsf ont été retrouvés. En présence de liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), 156 gènes ont montré un profil d’expression modifié, et le gène apxIVA, identifié comme étant surexprimé, a pu être détecté pour la première fois dans des conditions de croissance in vitro. Finalement, des expériences visant à déterminer les gènes utilisés directement chez l’animal en phase aiguë de la pleuropneumonie porcine ont permis d’identifier 150 gènes qui étaient différentiellement exprimés. En plus d’identifier des gènes d’un possible opéron codant pour un fimbriae de type IV, 3 des 72 gènes surexprimés sont conservés chez tous les sérotypes d’A. pleuropneumoniae et codent pour des protéines ou lipoprotéines de surface. Nos expériences ont permis d’identifier plusieurs nouveaux facteurs de virulence potentiels chez A. pleuropneumoniae ainsi que plusieurs nouvelles cibles potentielles pour l’élaboration de vaccins efficaces contre tous les sérotypes.

Studies on the exaggerated inflammatory response caused by streptococcus suis at systemic and central nervous system levels

Streptococcus suis de type 2 est un microorganisme pathogène d’importance chez le porc. Il est la cause de différentes pathologies ayant comme caractéristique commune la méningite. C’est également un agent émergeant de zoonose : des cas cliniques humains ont récemment été rapportés en Asie. Cependant, la pathogénèse de S. suis n’est pas encore complètement élucidée. Jusqu’à présent, la réponse pro-inflammatoire initiée par S. suis n’a été étudiée qu’in vitro. L’étude du choc septique et de la méningite requiert toujours des modèles expérimentaux appropriés. Au cours de cette étude, nous avons développé un modèle in vivo d’infection chez la souris qui utilise la voie d’inoculation intra-péritonéale. Ce modèle a servi à l’étude de la réponse pro-inflammatoire associée à ce pathogène, tant au niveau systémique qu’au niveau du système nerveux central (SNC). Il nous a également permis de déterminer si la sensibilité aux infections à S. suis pouvait être influencée par des prédispositions génétiques de l’hôte. Le modèle d’infection par S. suis a été mis au point sur des souris de lignée CD1. Les résultats ont démontré une bactériémie élevée pendant les trois jours suivant l’infection. Celle-ci était accompagnée d’une libération rapide et importante de différentes cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12p40/p70, IFN-ɣ) et de chémokines (KC, MCP-1 and RANTES), qui ont entraîné un choc septique et la mort de 20 % des animaux. Ensuite, pour confirmer le rôle de l’inflammation sur la mortalité et pour déterminer si les caractéristiques génétiques de l’hôte pouvaient influencer la réponse inflammatoire et l’issue de la maladie, le modèle d’infection a été étendu à deux lignées murines consanguines différentes considérées comme résistante : la lignée C57BL/6 (B6), et sensible : la lignée A/J. Les résultats ont démontré une importante différence de sensibilité entre les souris A/J et les souris B6, avec un taux de mortalité atteignant 100 % à 20 h post-infection (p.i.) pour la première lignée et de seulement 16 % à 36 h p.i. pour la seconde. La quantité de bactéries dans le sang et dans les organes internes était similaire pour les deux lignées. Donc, tout comme dans la lignée CD1, la bactériémie ne semblait pas être liée à la mort des souris. La différence entre les taux de mortalité a été attribuée à un choc septique non contrôlé chez les souris A/J infectées par S. suis. Les souris A/J présentaient des taux exceptionnellement élevés de TNF-α, IL-12p40/p70, IL-1β and IFN- γ, significativement supérieurs à ceux retrouvés dans la lignée B6. Par contre, les niveaux de chémokines étaient similaires entre les lignées, ce qui suggère que leur influence est limitée dans le développement du choc septique dû à S. suis. Les souris B6 avaient une production plus élevée d’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, ce qui suppose que la cascade cytokinaire pro-inflammatoire était mieux contrôlée, entraînant un meilleur taux de survie. Le rôle bénéfique potentiel de l’IL-10 chez les souris infectées par S. suis a été confirmé par deux approches : d’une part en bloquant chez les souris B6 le récepteur cellulaire à l’IL-10 (IL-10R) par un anticorps monoclonal anti-IL-10R de souris et d’autre part en complémentant les souris A/J avec de l’IL-10 de souris recombinante. Les souris B6 ayant reçu le anticorps monoclonal anti-IL-10R avant d’être infectées par S. suis ont développé des signes cliniques aigus similaires à ceux observés chez les souris A/J, avec une mortalité rapide et élevée et des taux de TNF-α plus élevés que les souris infectées non traitées. Chez les souris A/J infectées par S. suis, le traitement avec l’IL-10 de souris recombinante a significativement retardé l’apparition du choc septique. Ces résultats montrent que la survie au choc septique dû à S. suis implique un contrôle très précis des mécanismes pro- et anti-inflammatoires et que la réponse anti-inflammatoire doit être activée simultanément ou très rapidement après le début de la réponse pro-inflammatoire. Grâce à ces expériences, nous avons donc fait un premier pas dans l’identification de gènes associés à la résistance envers S. suis chez l’hôte. Une des réussites les plus importantes du modèle d’infection de la souris décrit dans ce projet est le fait que les souris CD1 ayant survécu à la septicémie présentaient dès 4 jours p.i. des signes cliniques neurologiques clairs et un syndrome vestibulaire relativement similaires à ceux observés lors de méningite à S. suis chez le porc et chez l’homme. L’analyse par hybridation in situ combinée à de l’immunohistochimie des cerveaux des souris CD1 infectées a montré que la réponse inflammatoire du SNC débutait avec une augmentation significative de la transcription du Toll-like receptor (TLR)2 et du CD14 dans les microvaisseaux cérébraux et dans les plexus choroïdes, ce qui suggère que S. suis pourrait se servir de ces structures comme portes d’entrée vers le cerveau. Aussi, le NF-κB (suivi par le système rapporteur de l’activation transcriptionnelle de IκBα), le TNF-α, l’IL-1β et le MCP-1 ont été activés, principalement dans des cellules identifiées comme de la microglie et dans une moindre mesure comme des astrocytes. Cette activation a également été observée dans différentes structures du cerveau, principalement le cortex cérébral, le corps calleux, l’hippocampe, les plexus choroïdes, le thalamus, l’hypothalamus et les méninges. Partout, cette réaction pro-inflammatoire était accompagnée de zones extensives d’inflammation et de nécrose, de démyélinisation sévère et de la présence d’antigènes de S. suis dans la microglie. Nous avons mené ensuite des études in vitro pour mieux comprendre l’interaction entre S. suis et la microglie. Pour cela, nous avons infecté des cellules microgliales de souris avec la souche sauvage virulente (WT) de S. suis, ainsi qu’avec deux mutants isogéniques, un pour la capsule (CPS) et un autre pour la production d’hémolysine (suilysine). Nos résultats ont montré que la capsule était un important mécanisme de résistance à la phagocytose pour S. suis et qu’elle modulait la réponse inflammatoire, en dissimulant les composants pro-inflammatoires de la paroi bactérienne. Par contre, l’absence d’hémolysine, qui est un facteur cytotoxique potentiel, n’a pas eu d’impact majeur sur l’interaction de S. suis avec la microglie. Ces études sur les cellules microgliales ont permis de confirmer les résultats obtenus précédemment in vivo. La souche WT a induit une régulation à la hausse du TLR2 ainsi que la production de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires, dont le TNF-α et le MCP-1. S. suis a induit la translocation du NF-kB. Cet effet était plus rapide dans les cellules stimulées par le mutant déficient en CPS, ce qui suggère que les composants de la paroi cellulaire représentent de puissants inducteurs du NF-kB. De plus, la souche S. suis WT a stimulé l’expression de la phosphotyrosine, de la PKC et de différentes cascades liées à l’enzyme mitogen-activated protein kinase (MAPK). Cependant, les cellules microgliales infectées par le mutant déficient en CPS ont montré des profils de phosphorylation plus forts et plus soutenus que celles infectées par le WT. Finalement, la capsule a aussi modulé l’expression de l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) induite par S. suis et par la production subséquente d’oxyde nitrique par la microglie. Ceci pourrait être lié in vivo à la neurotoxicité et à la vasodilatation. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant l’induction de l’inflammation par S. suis, ce qui devrait permettre, d’établir éventuellement des stratégies plus efficaces de lutte contre la septicémie et la méningite. Enfin, nous pensons que ce modèle expérimental d’infection chez la souris pourra être utilisé dans l’étude de la pathogénèse d’autres bactéries ayant le SNC pour cible.

Sélection de mutations affectant la formation de biofilm chez Actinobacillus pleuropneumoniae

Actinobacillus pleuropneumoniae (App) est l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, une infection pulmonaire contagieuse chez les porcs. Parmi les nombreux mécanismes de virulence retrouvés chez les bactéries, la formation de biofilms joue souvent un rôle important dans la pathogenèse. Il a été récemment démontré qu’App avait la capacité de former des biofilms in vitro. Dans notre laboratoire, la formation de biofilms par App a été évaluée en microplaques dans différents milieux de culture. Nous avons démontré que la souche de référence de sérotype 1 est capable de former des biofilms. Le but de ce travail est d’identifier des gènes impliqués dans la biosynthèse et dans la régulation de l’expression des biofilms chez App. L’objectif de cette étude était de générer une banque de mutants d’App 4074NalR à l’aide du transposon mini-Tn10. Cette banque de 1200 mutants a été criblée à l’aide du modèle in vitro de formation de biofilms en microplaques et en tubes : 24 mutants démontrant une formation de biofilms modifiée par rapport à la souche mère App 4074NalR ont été sélectionnés et identifiés, nous permettant ainsi de localiser le site d’insertion du transposon. Une analyse a permis d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans la biosynthèse et dans la régulation de l’expression des biofilms chez App. Notre criblage a permis d’identifier 16 gènes connus impliqués dans la formation de biofilms chez App (hns) ou chez d’autres pathogènes (potD2, ptsI, tig and rpmF) mais également de nouveaux gènes impliqués dans la formation de biofilm (APL_0049, APL_0637 and APL_1572). Une caractérisation plus poussée de ces gènes nous permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la formation de biofilm chez App.

Nouvelle approche pour modifier le tropisme des vecteurs adénoviraux à l’aide de ligands bispécifiques

L’adénovirus a été étudié dans l’optique de développer de nouveaux traitements pour différentes maladies. Les vecteurs adénoviraux (AdV) sont des outils intéressants du fait qu’ils peuvent être produits en grandes quantités (1X1012 particules par millilitre) et de par leur capacité à infecter des cellules quiescentes ou en division rapide. Les AdVs ont subi bon nombre de modifications pour leur permettre de traiter des cellules tumorales ou pour transporter des séquences génétiques exogènes essentielles pour le traitement de maladies monogéniques. Toutefois, les faibles niveaux d’expression du récepteur primaire de l’adénovirus, le CAR (récepteur à l’adénovirus et au virus coxsackie), réduit grandement l’efficacité de transduction dans plusieurs tumeurs. De plus, certains tissus normaux comme les muscles n’expriment que très peu de CAR, rendant l’utilisation des AdVs moins significative. Pour pallier à cette limitation, plusieurs modifications ont été générées sur les capsides virales. L’objectif de ces modifications était d’augmenter l’affinité des AdVs pour des récepteurs cellulaires spécifiques surexprimés dans les tumeurs et qui seraient exempts dans les tissus sains avoisinant. On peut mentionner dans les approches étudiées: l’utilisation de ligands bispécifiques, l’incorporation de peptides dans différentes régions de la fibre ou la substitution par une fibre de sérotypes différents. Notre hypothèse était que les domaines d’interaction complémentaire (K-Coil et ECoil) permettraient aux ligands de s’associer aux particules virales et d’altérer le tropisme de l’AdV. Pour ce faire, nous avons inclus un domaine d’interaction synthétique, le K-Coil,dans différentes régions de la fibre virale en plus de générer des mutations spécifiques pour abolir le tropisme naturel. Pour permettre la liaison avec les récepteurs d’intérêt dont l’EGF-R, l’IGF-IR et le CEA6, nous avons fusionné le domaine d’interaction complémentaire, le E-Coil, soit dans les ligands des récepteurs ciblés dont l’EGF et l’IGF-I, soit sur un anticorps à un seul domaine reconnaissant la protéine membranaire CEA6, l’AFAI. Suite à la construction des différents ligands de même que des différentes fibres virales modifiées, nous avons determiné tout d’abord que les différents ligands de même que les virus modifiés pouvaient être produits et que les différentes composantes pouvaient interagir ensemble. Les productions virales ont été optimisées par l’utilisation d’un nouveau protocole utilisant l’iodixanol. Ensuite, nous avons démontré que l’association des ligands avec le virus arborant une fibre modifiée pouvait entraîner une augmentation de transduction de 2 à 21 fois dans différentes lignées cellulaires. À cause de la difficulté des adénovirus à infecter les fibres musculaires occasionnée par l’absence du CAR, nous avons cherché à savoir si le changement de tropisme pourrait accroître l’infectivité des AdVs. Nous avons démontré que l’association avec le ligand bispécifique IGF-E5 permettait d’accroître la transduction autant dans les myoblastes que dans les myotubes de souris. Nous avons finalement réussi à démontrer que notre système pouvait induire une augmentation de 1,6 fois de la transduction suite à l’infection des muscles de souriceaux MDX. Ces résultats nous amènent à la conclusion que le système est fonctionnel et qu’il pourrait être évalué dans des AdVs encodant pour différents gènes thérapeutiques.

Détection et caractérisation génétique de Listeria monocytogenes dans une usine d’abattage/découpe de porcs au Québec

Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) est un pathogène majeur en santé publique comme les épisodes de 2008 dans les fromages et les charcuteries l’ont démontré. Au Canada, il n’y a pas de surveillance règlementaire de ce microorganisme dans les étapes précédant la transformation de produits prêts-à-manger. Ainsi, la présence et la circulation de ce microorganisme dans ces environnements est peu documentée. Pour décrire ces phénomènes, nous avons effectué un échantillonnage dans une usine d’abattage et de découpe de porcs au Québec, principalement dans les parcs d’attente, et dans l’environnement de l’abattage et de découpe : les échantillonages ont été effectués après lavage et désinfection sur une période de 2 ans. Un nombre de 874 échantillons a été récoltés. Le protocole de détection utilisé était inspiré de la méthode MFHPB-30 de Santé Canada. Les sérotypes ont été obtenus par PCR et les isolats caractérisés par un génotypage RFLP-PFGE en utilisant les enzymes de restriction Apa1 et Asc1. Nous avons détecté la présence de Listeria monocytogemes dans toutes ces étapes de la production. De ces échantillons positifs, 4 sérotypes (principalement 1/2b) ont émergé. Les patrons PFGE ont démontré la présence d’une variété de génotypes dans les zones d’attente et d’abattage de l’usine et la présence d’un type majeur dans l’environnement de la zone de découpe (le type 1 représentant 96.1% des souches à cette étape). De plus, nous avons démontré des liens entre les souches retrouvés au début de la production, en attente, et les souches retrouvées dans la zone de découpe. Ces résultats suggèrent que Listeria monocytogenes entre dans l’usine avec les animaux, contamine les étapes suivantes de la production et que certaines souches peuvent être sélectionnées et leur croissance favorisé dans l’environnement, devenant majoritaires, persistantes et préoccupantes en regars de la santé publique.

Rôle du TLR2 dans l’hépatite fulminante induite par le virus de l’hépatite murine

Ce travail examine les mécanismes de l’immunité innée impliqués dans l’hépatite aiguë virale du modèle murin d’infection par le virus de l’hépatite virale murine de type 3 (MHV-3). Afin de déterminer le rôle du TLR2 dans l’aggravation de l’hépatite, des infections avec le virus MHV-3 ont été réalisées in vivo chez des souris C57BL/6 et des souris déficientes pour le gène tlr2 et in vitro dans des macrophages et des hépatocytes infectés avec le virus MHV-3 et le virus moins virulent MHV-A59. Les niveaux de transcription et de traduction des senseurs microbiens, des interférons (IFN) de type I, des cytokines et/ou des chimiokines ont été évalués par qRT-PCR et ELISA. Les cellules ont été traitées avec des petits ARNs interférants (siRNAs) pour le TLR2 et le CEACAM1a ou mises en présence d’inhibiteurs des voies d’endocytose. Les résultats révèlent le rôle stimulateur du TLR2 pour la réplication virale, la production de cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNF-α et des chimiokines CXCL1, CXCL10 et CCL2. Un nouveau mécanisme d’échappement aux senseurs viraux dépendant du TLR2 a également été mis en évidence dans les macrophages et les hépatocytes lors de l’infection de ces cellules avec le virus MHV-3, et non pas avec le virus moins virulent MHV-A59. Ces différents travaux révèlent un nouveau rôle du TLR2 lors d’infections virales dans l'aggravation de la réponse inflammatoire tout en protégeant le virus des autres senseurs de la réponse immune innée.