Minimum detection limit of an in-house nested-PCR assay for herpes simplex virus and varicella zoster virus

Introduction Herpes simplex virus (HSV) and varicella zoster virus (VZV) are responsible for a variety of human diseases, including central nervous system diseases. The use of polymerase chain reaction (PCR) techniques on cerebrospinal fluid samples has allowed the detection of viral DNA with high sensitivity and specificity. Methods Serial dilutions of quantified commercial controls of each virus were subjected to an in-house nested-PCR technique. Results The minimum detection limits for HSV and VZV were 5 and 10 copies/µL, respectively. Conclusions The detection limit of nested-PCR for HSV and VZV in this study was similar to the limits found in previous studies.

An optimized one-tube, semi-nested PCR assay for Paracoccidioides brasiliensis detection

Introduction Herein, we report a one-tube, semi-nested-polymerase chain reaction (OTsn-PCR) assay for the detection of Paracoccidioides brasiliensis. Methods We developed the OTsn-PCR assay for the detection of P. brasiliensis in clinical specimens and compared it with other PCR methods. Results The OTsn-PCR assay was positive for all clinical samples, and the detection limit was better or equivalent to the other nested or semi-nested PCR methods for P. brasiliensis detection. Conclusions The OTsn-PCR assay described in this paper has a detection limit similar to other reactions for the molecular detection of P. brasiliensis, but this approach is faster and less prone to contamination than other conventional nested or semi-nested PCR assays.

Cutaneous and visceral leishmaniasis co-infection in dogs from Rio de Janeiro, Brazil: evaluation by specific PCR and RFLP-PCR assays

Introduction During a diagnostic evaluation of canine visceral leishmaniasis (VL), two of seventeen dogs were found to be co-infected by Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) chagasi. Methods Specific polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism-PCR (RFLP-PCR) assays were performed. Results PCR assays for Leishmania subgenus identification followed by RFLP-PCR analysis in biopsies from cutaneous lesions and the spleen confirmed the presence of Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) chagasi in those fragments. Conclusions This report reinforces the importance of using serological and molecular techniques in the epidemiological surveillance of canine populations in endemic areas in which both diseases are known to co-exist. In such cases, a reassessment of the control measures is required.

High similarity of Trypanosoma cruzikDNA genetic profiles detected by LSSP-PCR within family groups in an endemic area of Chagas disease in Brazil

IntroductionDetermining the genetic similarities among Trypanosoma cruzi populations isolated from different hosts and vectors is very important to clarify the epidemiology of Chagas disease.MethodsAn epidemiological study was conducted in a Brazilian endemic area for Chagas disease, including 76 chronic chagasic individuals (96.1% with an indeterminate form; 46.1% with positive hemoculture).ResultsT. cruzi I (TcI) was isolated from one child and TcII was found in the remaining (97.1%) subjects. Low-stringency single-specific-primer-polymerase chain reaction (LSSP-PCR) showed high heterogeneity among TcII populations (46% of shared bands); however, high similarities (80-100%) among pairs of mothers/children, siblings, or cousins were detected.ConclusionsLSSP-PCR showed potential for identifying similar parasite populations among individuals with close kinship in epidemiological studies of Chagas disease.

Single-tube nested PCR assay with in-house DNA extraction for Mycobacterium tuberculosis detection in blood and urine

Abstract: INTRODUCTION : Molecular analyses are auxiliary tools for detecting Koch's bacilli in clinical specimens from patients with suspected tuberculosis (TB). However, there are still no efficient diagnostic tests that combine high sensitivity and specificity and yield rapid results in the detection of TB. This study evaluated single-tube nested polymerase chain reaction (STNPCR) as a molecular diagnostic test with low risk of cross contamination for detecting Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. METHODS: Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid (DNA) was detected in blood and urine samples by STNPCR followed by agarose gel electrophoresis. In this system, reaction tubes were not opened between the two stages of PCR (simple and nested). RESULTS: STNPCR demonstrated good accuracy in clinical samples with no cross contamination between microtubes. Sensitivity in blood and urine, analyzed in parallel, was 35%-62% for pulmonary and 41%-72% for extrapulmonary TB. The specificity of STNPCR was 100% in most analyses, depending on the type of clinical sample (blood or urine) and clinical form of disease (pulmonary or extrapulmonary). CONCLUSIONS: STNPCR was effective in detecting TB, especially the extrapulmonary form for which sensitivity was higher, and had the advantage of less invasive sample collection from patients for whom a spontaneous sputum sample was unavailable. With low risk of cross contamination, the STNPCR can be used as an adjunct to conventional methods for diagnosing TB.

Detection of canine visceral leishmaniasis by conjunctival swab PCR

Abstract: INTRODUCTION: Conjunctival swab PCR was evaluated as a tool to diagnose visceral leishmaniasis in dogs. METHODS: Conjunctival swab PCR was compared to indirect immunofluorescence antibody test and blood PCR. RESULTS: Indirect immunofluorescence was significantly correlated with conjunctival swab PCR (p < 0.05), but not with blood PCR (p > 0.05). In addition, conjunctival swab PCR was significantly associated with presence of clinical symptoms (p < 0.05), whereas blood PCR was associated with absence of clinical symptoms (p < 0.05). CONCLUSIONS: Results indicate that conjunctival swab PCR is useful in epidemiological surveys of canine visceral leishmaniasis.

Determinação e comparação de genótipo de Candida albicans pelo Método de PCR com base nos polimorfismos da região 255rDNA e das sequências ALT/RPS

As leveduras da espécie Candida albicans são comensais do ser humano, podendo em certos casos, como a toma prolongada de antibióticos de largo espectro, a diminuição da imunidade, ou a quimioterapia, causar infecções severas. Estas infecções classificam-se em superficiais ou sistémicas, consoante a zona anatómica ou os órgãos afectados. As infecções hospitalares por fungos, nomeadamente as causadas por C. albicans, têm vindo a aumentar nos últimos anos, assim como a mortalidade e a morbilidade associadas, e ainda os custos relacionados com os cuidados de saúde. Torna-se por isso importante a implementação de terapêutica de uma forma rápida, eficaz e correcta. Assim, é imperativo que os laboratórios de microbiologia clínica possuam métodos de diagnóstico rápidos, simples e económicos em relação a uma correcta identificação ao nível de espécie e em relação ao estudo da sensibilidade aos antifúngicos. Contudo, esta identificação ao nível de espécie não permite averiguar a origem das infecções, facto importante para a compreensão da evolução das infecções nosocomiais. Para tal, é necessário realizar um estudo ao nível de estirpe através de métodos moleculares que permitam fazer a distinção acurada entre isolados de C. albicans. Os métodos moleculares têm vindo a desenvolver um papel importante no diagnóstico de infecções: são rápidos, sensíveis, precisos e possuem a vantagem de se poder trabalhar pequenas quantidades de amostra. Têm no entanto a desvantagem de ser métodos caros, por vezes demasiado elaborados para serem instituídos num laboratório de microbiologia clínica com grande volume de amostras diárias. O principal objectivo deste trabalho consistiu na diferenciação de estirpes de C. albicans através de uma metodologia molecular inovadora, nunca antes efectuada no ocidente, simples e rápida, por meio de simples amplificações por PCR. Para tal, foram seleccionados 60 isolados clínicos de leveduras obtidas a partir de amostras clínicas de três localidades: Covilhã (Centro Hospitalar Cova de Beira, E.P.E) Lisboa (Instituto Português de Oncologia e Hospital de Santa Maria, E.P.E) e Viseu (Hospital de São Teotónio). O trabalho baseou-se na genotipagem de isolados clínicos de C. albicans por amplificação por PCR com primers dirigidos às sequências 25S rDNA e às regiões ALT das sequências RPS. Foi possível a sua diferenciação e distinção em estirpes, fazendo deste método um bom recurso para estudos epidemiológicos. Realizou-se ainda um estudo de sensibilidade in vitro das estirpes de C. albicans ao antifúngicos Fluconazol e Voriconazol pelo método de difusão em disco, segundo os procedimentos padronizados e publicados pelo CLSI. Através deste estudo foi verificada elevada susceptibilidade aos antifúngicos estudados. Com este trabalho conclui-se que a diferenciação ao nível de estirpe é muito importante para compreender padrões de surtos de infecções e ainda para averiguar a origem, endógena ou exógena, destas infecções nosocomiais. Como tal, este estudo epidemiológico torna-se essencial para definir um controlo mais rigoroso das infecções.

Implementação e validação do método de deteção de alergénios em alimentos por PCR em tempo real no Laboratório SGS

As alergias alimentares são um grande problema de saúde pública a nível mundial, que ocorre em todas as faixas etárias, tendo maior incidência em crianças. Mediada pelo sistema imunitário, a alergia alimentar é uma reação adversa que ocorre devido à presença de alergénios alimentares, que são identificados erroneamente como sendo um perigo ao organismo. Como é uma patologia que não possui cura, a prevenção é a melhor forma de evitar que ocorram reações alérgicas em indivíduos sensíveis, sendo a rotulagem um componente indispensável para a identificação dos alergénios presentes nos alimentos. Dentro dos métodos utilizados para a deteção de alergénios está a Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (PCR em tempo real), que é capaz de identificar o gene que codifica a proteína alergénica. Este método possui elevada sensibilidade e especificidade, sendo atualmente utilizado na área alimentar para a deteção de organismos genéticamente modificados e alergénios. Devido a uma grande procura de clientes e consumidores, para identificação de alergénios em alimentos, o objetivo do presente trabalho foi implementar e validar, a partir de análises de sensibilidade, precisão e robustez, o método de PCR em tempo real. Dessa forma, foi testada a deteção qualitativa de oito alergénios em alimentos, sendo estes o aipo, amendoim, avelã, caju, noz, pistáchio, sésamo e soja, no Laboratório da SGS - Société Générale de Surveillance. Destes alergénios, foi possível a validação de sete, demonstrando que o método de PCR em tempo real, para os presentes alergénios, possui elevada precisão e sensibilidade nos resultados obtidos.

Seleção de áreas de interesse ecológico através de sensoriamento remoto e de otimização matemática: um estudo de caso no município de Cocalinho, MT

A criação de unidades de conservação tem sido a principal estratégia para preservar a biodiversidade. O recente emprego de técnicas como o sensoriamento remoto e a otimização matemática, aliados a dados biológicos, ajudam a definir as áreas prioritárias para conservação, indicando a representação máxima da biodiversidade com base em medidas de complementaridade. O presente trabalho objetivou selecionar áreas de interesse ecológico, com base na heterogeneidade de hábitats, através da integração de imagens de satélite com dados biológicos, em Cocalinho, MT. As 66 parcelas quadradas estabelecidas foram comparadas com base na heterogeneidade e na representatividade mínima (ha) dos ambientes em cada parcela, através do programa SITES. O parque de cerrado é a fitofisionomia predominante em Cocalinho (38,44%). A região central do município concentrou o maior agrupamento de parcelas, indicando a maior heterogeneidade de hábitats do local. Oficialmente, 6% da área total do município estão protegidos em duas unidades de conservação na categoria de Refúgios de Vida Silvestre. Esses refúgios foram demarcados em locais com cobertura vegetal homogênea e sem considerar a composição faunística e florística. O modelo usado neste estudo pode ser uma boa abordagem a ser empregada no processo de indicação de novas unidades de conservação no bioma Cerrado ou em outros biomas do Brasil.

RAPD em Pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke): adaptação do método para coleta de amostras in situ, ajuste das condições de PCR e apresentação de um processo para selecionar bandas reprodutíveis

O Pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke) é uma espécie importante economicamente para a Região Amazônica, porque sua madeira é fonte de linalol, insumo utilizado pelas perfumarias. Esta espécie foi explorada durante décadas e, ainda assim, o conhecimento acerca da diversidade genética intra-específica é muito restrito. Foram objetivos deste trabalho: 1) validar um protocolo para coleta de folhas de pau-rosa que permitisse preservar a integridade do DNA até a estocagem em "freezer"; 2) selecionar um protocolo para extração de DNA em quantidade e qualidade adequadas para geração de bandas RAPD e 3) desenvolver um critério para avaliar o grau de reprodutibilidade que pudesse auxiliar a seleção de bandas RAPD úteis para análises de diversidade genética. Imediatamente após a coleta, as folhas foram acondicionadas em tubos de polietileno com sílica gel e aí permaneceram por até 10 dias. Foram testados três protocolos para a extração de ácidos nucléicos destas folhas, condições ideais para as PCR e a reprodutibilidade dos padrões RAPD. Critérios para a eliminação das bandas que mais contribuíram para o afastamento dos resultados do ideal da reprodutibilidade total foram desenvolvidos e a significância estatística das diferenças geradas pela aplicação dos critérios ao conjunto de dados foi testada. DNA com qualidade e em quantidade suficiente para a geração de padrões RAPD, nas condições ideais definidas para as PCRs, foi obtido. A eliminação de bandas com reprodutibilidade menor que 70% não diferiu do controle. A eliminação de bandas com reprodutibilidade menor que 90% diferiu dos demais tratamentos em todos os arranjos testados (P < 5%).

Aspectos florísticos e fitossociológicos de um trecho de Floresta Estacional Perenifólia na Fazenda Trairão, Bacia do rio das Pacas, Querência-MT

A borda sul da região amazônica apresenta um tipo peculiar de floresta, denominada de Floresta Estacional Perenifólia, que atualmente vem sofrendo severos impactos ambientais devido à expansão da fronteira agrícola no Norte do Estado de Mato Grosso. Diante da falta de estudos neste tipo florestal, objetivou-se identificar a composição florística e a estrutura fitossociológica do componente arbóreo de um trecho florestal na Fazenda Trairão em Querência-MT. A amostragem da vegetação consistiu na distribuição de 200 pontos-quadrantes, sendo considerados os quatro indivíduos mais próximos de cada ponto que tivessem DAP (diâmetro à altura do peito) igual ou superior a 10 cm. A densidade total foi de 728 ind./ha, distribuídos em 49 espécies, 39 gêneros e 24 famílias. A família que apresentou maior riqueza foi Fabaceae (cinco espécies), seguida por Burseraceae e Euphorbiaceae, cada uma com quatro espécies, consideradas também as mais ricas em trechos de Floresta Amazônica. As espécies de maior Valor de Importância (VI) foram Ocotea leucoxylon (Sw.) Laness., Xylopia amazonica R.E. Fr., Myrcia multiflora (Lam.) DC., Chaetocarpus echinocarpus (Baill.) Ducke e Protium pilosissimum Engl., mas não tiveram a mesma representatividade em outros trechos de Floresta Estacional Perenifólia, evidenciando diferenças estruturais desta unidade fitogeográfica. A comunidade avaliada possui porte fino, pois a maioria dos indivíduos concentra-se nas classes de diâmetro entre 10 e 14,9 cm e altura entre 10,6 e 16,5 m. O índice de Shannon (3,17) é considerado baixo por se tratar de floresta amazônica, na qual a diversidade é superior a 4,0.

Composição, diversidade e similaridade florística de uma floresta tropical semidecídua submontana em Marcelândia - MT

O objetivo deste estudo foi avaliar a composição, diversidade e similaridade florística de uma área de floresta estacional semidecidual localizada no município de Marcelândia-MT, em área de tensão ecológica, na região de contato floresta ombrófila/floresta estacional. Foram amostrados 4008 indivíduos, pertencentes a 33 famílias e 92 espécies, em 74 parcelas de 10 m x 250 m. As famílias que apresentaram maior valor percentual de árvores foram: Lauraceae (15,99%), Melastomataceae (12,97%), Sapotaceae (12,50%), Fabaceae - Mimosoideae (9,91%), Burseraceae (9,13%) e Moraceae (7,29%). Os valores obtidos para os índices de diversidade Shannon-Weaver, de concentração de Simpson e de equitabilidade de Pielou indicaram que a área apresenta diversidade relativamente alta e baixa concentração de espécies com alta uniformidade nas proporções indivíduos/espécies dentro da comunidade vegetal. Os padrões de similaridade florística evidenciaram baixa similaridade entre as áreas avaliadas evidenciando existência de padrões fitogeográficos baseados na distribuição das espécies.

Propriedades físico-químicas e microbiológicas do solo de um Parque em Tangará da Serra, MT, uma área de transição entre Amazônia e Cerrado

O Parque Natural Municipal Ilto Ferreira Coutinho, localizado em Tangará da Serra-MT, possui uma vegetação de transição entre Cerrado e Floresta Amazônica e apresenta três diferentes áreas denominadas: área de lazer, área alterada e reserva natural, conforme o seu estado de degradação e de utilização. Os objetivos deste trabalho foram: estudar algumas propriedades físico-químicas e microbiológicas (bactérias e fungos) do solo; analisar a influência dos períodos seco e chuvoso nestas propriedades do solo e estimar os índices de diversidade, uniformidade e riqueza bacteriana do solo das áreas estudadas. As amostras de solo foram coletadas nos meses de agosto de 2005 e março de 2006 e as análises físico-químicas foram realizadas em um laboratório especializado. As análises de pH, umidade e contagem total de fungos e bactérias foram realizadas no Laboratório de Microbiologia da UNEMAT. A diversidade bacteriana foi calculada através do índice de Shannon-Wiener e a riqueza e uniformidade pelo índice de Pielou. Houveram diferenças nos valores da comunidade microbiana (fungos e actinomicetos), de pH, de matéria orgânica, de carbono orgânico e de umidade, entre as áreas e os períodos estudados. No período chuvoso, observamos a inibição do crescimento de actinomicetos provavelmente causado pela alta umidade. Os índices de diversidade, uniformidade e riqueza foram baixos, possivelmente devido à constante ação antrópica no parque.

Síndromes de dispersão de diásporos das espécies de trechos de vegetação ciliar do rio das Pacas, Querência - MT

As adaptações das plantas, conforme seus agentes dispersores, correlacionam-se com as características morfológicas de cada espécie e família e com a região em que esta predomina, sendo que as sementes evoluíram de acordo com os dispersores. A dispersão de sementes mais freqüente em florestas tropicais é a zoocoria, daí a importância na conservação de corredores ecológicos, que possibilitam a disseminação de espécies de um fragmento para outro. Diante do fato, este trabalho teve por objetivo listar as principais síndromes de dispersão de sementes de espécies ocorrentes em trechos de Floresta Estacional Perenifólia Ribeirinha do rio das Pacas, Querência - MT, a fim de identificar o principal tipo de dispersão. As informações sobre as síndromes de dispersão foram coletadas em campo, juntamente com a amostragem da vegetação, a qual foi dividida em estratos de acordo com a altura dos indivíduos amostrados. Foram identificadas 69 espécies, pertencentes a 51 gêneros e 31 famílias botânicas. As famílias com maior riqueza foram Annonaceae e Fabaceae, a qual apresentou a maior diversificação de síndromes. A zoocoria foi a síndrome de maior expressividade, com 86% do total de espécies, seguida da anemocoria (10%), autocoria (3%) e barocoria (1%). O estrato inferior (sub-bosque) e intermediário (dossel) possui maior porcentagem de espécies zoocóricas do que no estrato superior (emergente), onde a anemocoria foi mais importante. Estes resultados evidenciam a forte relação entre a vegetação e a fauna na manutenção das populações de plantas no ambiente ciliar, bem como a importância de se manter corredores ecológicos entre os fragmentos florestais.

Quintais urbanos de Mirassol D'Oeste-MT, Brasil: uma abordagem etnobotânica

Quintais são espaços de fácil acesso e cômodos para os moradores cultivarem uma diversidade de espécies que desempenham funções de estética, lazer, alimentação e medicinal, dentre outras. O objetivo deste trabalho foi o de descrever a composição florística e a respectiva utilização em quintais urbanos de Mirassol D'Oeste, MT, (15º 45'30"S e 058º16'36"W), com a coleta de dados envolvendo: entrevistas estruturadas e semi-estruturadas aplicadas a 29 moradores; coleta simultânea do material botânico das espécies indicadas, incorporação destas no Laboratório de Botânica da UNEMAT, Cáceres e análise da freqüência absoluta e relativa das espécies mais citadas e encontradas nos quintais. Foram registradas 397 denominações locais de plantas (etnoespécies), 275 taxa reunidos em 79 famílias destacando-se com maior número de espécies: Solanaceae (23), Asteraceae (17), Lamiaceae (14), Rosaceae (12) e Verbenaceae (9). Os atributos alimentar e ornamental representam, individualmente, 35% das espécies e o medicinal, 29%. Algumas plantas detêm até quatro potencialidades. Do universo vegetal conhecido e utilizado localmente as espécies nativas correspondem a 8%, resultado considerado baixo comparando-se aos obtidos em populações mato-grossenses radicadas no Cerrado e Pantanal. Essa população manifesta por meio de suas práticas uma tradição agrícola em interface às características de uma sociedade urbano - industrial coabitando em espaços comuns, o quintal.