Characterization of the effects of IL-17F on CHO cell line generation

CHO is the most commonly used mammalian host for the generation of cell lines allowing for the production of high quality therapeutic proteins. The generation of such cell lines is a lengthy and resource-intensive process requiring extensive screening in order to isolate candidates with optimal characteristics, such as growth, stability and productivity. For this reason, the biotechnology industry invests much effort in attempts to optimize CHO expression systems in order to streamline and shorten the cell line selection process. Based on preliminary observations of a facilitated selection of CHO-GS cell lines expressing members of the IL-17 cytokine family, this study investigates the use of IL-17F as a novel enhancing factor for CHO cell line generation. Using two different CHO expression systems (exploiting GS and DHFR-based selection), we demonstrated that IL-17F expression caused a significant increase in the occurrence of colonies during the selection process. All colonies selected produced substantial amounts of IL-17F, suggesting that benefits were conferred, during selection, to those cells expressing the cytokine. Furthermore, transgene expression levels were significantly increased when the selection pressure was raised to a level that would not normally be permissive for colony selection (i.e. 100 |o.M MSX for the CHO-GS expression system or 1000 nM MTX for the CHO-DHFR system). Finally, IL-17F expression was also found to enhance the rate of appearance of clones during single cell subcloning in the absence of selection pressure. Overall, these benefits have the potential to allow a substantial reduction in the length of cell line generation while significantly increasing cell line productivity. Nevertheless, we found that the high IL-17F expression levels required to convey enhancing effects was a limitation when attempting to co-express IL-17F and a recombinant soluble protein of therapeutic interest from independent CMV promoters within the same expression vector. In order to understand and overcome this limitation, studies were designed to characterize the IL-17F enhancing effect at the molecular and cellular level. Regular supplementation of recombinant biologically-active IL-17F into the culture medium during cell line selection was not able to reproduce the enhancing effects of endogenous IL-17F expression. In addition, increased IL-17F expression correlated with increased CHO-GS selection transgene expression at the single cell level. This data suggested a possible effect of IL-17F on viral promoter activity or transgene mRNA stability. It also provided direct evidence that the cells expressing the highest amounts of IL-17F obtained the most benefit. Overall data obtained from these study implied that IL-17F may act through an intracellular mechanism, possibly exerted during secretion. We therefore initiated experiments designed to determine the specific compartment(s) within which IL-17F triggers its effect. This work has identified IL-17F as a potentially powerful tool to optimize the CHO cell line generation process. The characterization of this enhancing effect at the molecular level has given us several insights into overcoming the current limitations, thus paving the way for the development of a viable technology that can be exploited within the biotechnology industry. - La CHO est la cellule hôte de mammifere la plus couramment utilisée dans la création de lignée cellulaire produisant des protéines thérapeutiques de haute qualité. La génération de ces lignées cellulaires est un processus long et exigeant l'utilisation de techniques de sélection robustes afin d'isoler des candidats possédants les caractéristiques optimales de croissance, de productivité et de stabilité d'expression. Les industries biopharmaceutiques ont investi beaucoup d'efforts afin d'optimiser les systèmes d'expression CHO dans le but raccourcir la longueur du procédé de sélection de lignées cellulaires et aussi d'en augmenter l'efficacité. A partir d'observations préliminaires obtenues lors de la génération de lignées cellulaires CHO- GS exprimant une cytokine appartenant à la famille des IL-17, nous avons réalisé une étude portant sur l'utilisation de l'IL-17F humaine (IL-17F) comme nouveau facteur d'optimisation pour la génération de lignées cellulaires CHO. Nous avons démontré, en utilisant les deux systèmes de sélection et d'expression CHO couramment utilisés (le premier exploitant la GS et l'autre basée sur la DHFR), que l'expression de l'IL-17F permet une augmentation significative de la fréquence d'apparition de colonies durant le processus de sélection de lignées cellulaires. Les différentes colonies sélectionnées expriment des quantités substantielles d'IL-17F, suggérant un effet bénéfique lors de la sélection qui serait exclusivement conféré aux cellules exprimant la cytokine. En outre, le niveau d'expression du transgene se trouve significativement augmenté lorsque la pression de sélection est portée à un niveau habituellement trop élevé pour permettre la sélection de colonies (soit 100 |JM MSX pour le système d'expression CHO-GS ou 1000 nM MTX pour le système CHO- DHFR). Enfin, l'expression d'IL-17F permet également d'améliorer la vitesse d'apparition de clones pendant une étape de sous-clonage en l'absence de pression de sélection. L'ensemble de ces effets bénéfiques permettent une réduction substantielle de la durée de génération de lignées cellulaires tout en augmentant considérablement la productivité des lignées obtenues. Néanmoins, nous avons constaté que la nécessité d'exprimer des niveaux élevés d'IL-17F afin obtenir l'ensemble de ses effets bénéfiques devient une contrainte lors de l'utilisation d'un vecteur d'expression composé de deux promoteurs CMV indépendants pour la co-expression de la cytokine et d'une protéine soluble présentant un intérêt thérapeutique. Afin de mieux comprendre et de surmonter cette limitation, plusieurs études ont été effectuées dans le but de mieux caractériser l'effet de IL-17F au niveau subcellulaire. L'apport régulier en IL-17F recombinante et biologiquement active dans le milieu de culture lors de la sélection de lignées cellulaires ne permet pas de reproduire les effets bénéfiques observés par l'expression endogène d'IL-17F. En outre, nous avons constaté que, lors de l'utilisation du système CHO- GS, l'augmentation d'expression de 1TL-17F est corrélée à un accroissement de l'expression du marqueur de sélection au niveau cellulaire. Ces résultats suggèrent un possible effet d'IL- 17F sur l'activité des promoteurs viraux et ainsi fournissent une preuve directe que les cellules exprimant de haut niveau d'IL-17F sont celles qui en profitent le plus. L'ensemble de ces observations mettrait en avant que l'effet d'IL-17F se ferait selon un mécanisme intracellulaire. Nous avons donc étudié le(s) compartiment(s) spécifique(s) dans lequel IL-17F pourrait exercer son effet. Ce travail a permis de définir IL-17F comme un puissant outil pour l'optimisation des procédés de génération de lignées cellulaires CHO. La caractérisation de cette amélioration de l'effet au niveau moléculaire nous a donné plusieurs indications sur la manière de dépasser les limitations actuelles, ouvrant ainsi la voie au développement d'une technologie viable qui peut être exploitée pars l'industrie biotechnologique.

Systems biology of plants : from intraspecific genome variation to computational morphodynamics

Recently, the introduction of second generation sequencing and further advance-ments in confocal microscopy have enabled system-level studies for the functional characterization of genes. The degree of complexity intrinsic to these approaches needs the development of bioinformatics methodologies and computational models for extracting meaningful biological knowledge from the enormous amount of experi¬mental data which is continuously generated. This PhD thesis presents several novel bioinformatics methods and computational models to address specific biological questions in Plant Biology by using the plant Arabidopsis thaliana as a model system. First, a spatio-temporal qualitative analysis of quantitative transcript and protein profiles is applied to show the role of the BREVIS RADIX (BRX) protein in the auxin- cytokinin crosstalk for root meristem growth. Core of this PhD work is the functional characterization of the interplay between the BRX protein and the plant hormone auxin in the root meristem by using a computational model based on experimental evidence. Hyphotesis generated by the modelled to the discovery of a differential endocytosis pattern in the root meristem that splits the auxin transcriptional response via the plasma membrane to nucleus partitioning of BRX. This positional information system creates an auxin transcriptional pattern that deviates from the canonical auxin response and is necessary to sustain the expression of a subset of BRX-dependent auxin-responsive genes to drive root meristem growth. In the second part of this PhD thesis, we characterized the genome-wide impact of large scale deletions on four divergent Arabidopsis natural strains, through the integration of Ultra-High Throughput Sequencing data with data from genomic hybridizations on tiling arrays. Analysis of the identified deletions revealed a considerable portion of protein coding genes affected and supported a history of genomic rearrangements shaped by evolution. In the last part of the thesis, we showed that VIP3 gene in Arabidopsis has an evo-lutionary conserved role in the 3' to 5' mRNA degradation machinery, by applying a novel approach for the analysis of mRNA-Seq data from random-primed mRNA. Altogether, this PhD research contains major advancements in the study of natural genomic variation in plants and in the application of computational morphodynamics models for the functional characterization of biological pathways essential for the plant. - Récemment, l'introduction du séquençage de seconde génération et les avancées dans la microscopie confocale ont permis des études à l'échelle des différents systèmes cellulaires pour la caractérisation fonctionnelle de gènes. Le degrés de complexité intrinsèque à ces approches ont requis le développement de méthodologies bioinformatiques et de modèles mathématiques afin d'extraire de la masse de données expérimentale générée, des information biologiques significatives. Ce doctorat présente à la fois des méthodes bioinformatiques originales et des modèles mathématiques pour répondre à certaines questions spécifiques de Biologie Végétale en utilisant la plante Arabidopsis thaliana comme modèle. Premièrement, une analyse qualitative spatio-temporelle de profiles quantitatifs de transcripts et de protéines est utilisée pour montrer le rôle de la protéine BREVIS RADIX (BRX) dans le dialogue entre l'auxine et les cytokinines, des phytohormones, dans la croissance du méristème racinaire. Le noyau de ce travail de thèse est la caractérisation fonctionnelle de l'interaction entre la protéine BRX et la phytohormone auxine dans le méristème de la racine en utilisant des modèles informatiques basés sur des preuves expérimentales. Les hypothèses produites par le modèle ont mené à la découverte d'un schéma différentiel d'endocytose dans le méristème racinaire qui divise la réponse transcriptionnelle à l'auxine par le partitionnement de BRX de la membrane plasmique au noyau de la cellule. Cette information positionnelle crée une réponse transcriptionnelle à l'auxine qui dévie de la réponse canonique à l'auxine et est nécessaire pour soutenir l'expression d'un sous ensemble de gènes répondant à l'auxine et dépendant de BRX pour conduire la croissance du méristème. Dans la seconde partie de cette thèse de doctorat, nous avons caractérisé l'impact sur l'ensemble du génome des délétions à grande échelle sur quatre souches divergentes naturelles d'Arabidopsis, à travers l'intégration du séquençage à ultra-haut-débit avec l'hybridation génomique sur puces ADN. L'analyse des délétions identifiées a révélé qu'une proportion considérable de gènes codant était affectée, supportant l'idée d'un historique de réarrangement génomique modelé durant l'évolution. Dans la dernière partie de cette thèse, nous avons montré que le gène VÏP3 dans Arabidopsis a conservé un rôle évolutif dans la machinerie de dégradation des ARNm dans le sens 3' à 5', en appliquant une nouvelle approche pour l'analyse des données de séquençage d'ARNm issue de transcripts amplifiés aléatoirement. Dans son ensemble, cette recherche de doctorat contient des avancées majeures dans l'étude des variations génomiques naturelles des plantes et dans l'application de modèles morphodynamiques informatiques pour la caractérisation de réseaux biologiques essentiels à la plante. - Le développement des plantes est écrit dans leurs codes génétiques. Pour comprendre comment les plantes sont capables de s'adapter aux changements environnementaux, il est essentiel d'étudier comment leurs gènes gouvernent leur formation. Plus nous essayons de comprendre le fonctionnement d'une plante, plus nous réalisons la complexité des mécanismes biologiques, à tel point que l'utilisation d'outils et de modèles mathématiques devient indispensable. Dans ce travail, avec l'utilisation de la plante modèle Arabidopsis thalicinci nous avons résolu des problèmes biologiques spécifiques à travers le développement et l'application de méthodes informatiques concrètes. Dans un premier temps, nous avons investigué comment le gène BREVIS RADIX (BRX) régule le développement de la racine en contrôlant la réponse à deux hormones : l'auxine et la cytokinine. Nous avons employé une analyse statistique sur des mesures quantitatives de transcripts et de produits de gènes afin de démontrer que BRX joue un rôle antagonisant dans le dialogue entre ces deux hormones. Lorsque ce-dialogue moléculaire est perturbé, la racine primaire voit sa longueur dramatiquement réduite. Pour comprendre comment BRX répond à l'auxine, nous avons développé un modèle informatique basé sur des résultats expérimentaux. Les simulations successives ont mené à la découverte d'un signal positionnel qui contrôle la réponse de la racine à l'auxine par la régulation du mouvement intracellulaire de BRX. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons analysé le génome entier de quatre souches naturelles d'Arabidopsis et nous avons trouvé qu'une grande partie de leurs gènes étaient manquant par rapport à la souche de référence. Ce résultat indique que l'historique des modifications génomiques conduites par l'évolution détermine une disponibilité différentielle des gènes fonctionnels dans ces plantes. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons analysé les données du transcriptome de la plante où le gène VIP3 était non fonctionnel. Ceci nous a permis de découvrir le rôle double de VIP3 dans la régulation de l'initiation de la transcription et dans la dégradation des transcripts. Ce rôle double n'avait jusqu'alors été démontrée que chez l'homme. Ce travail de doctorat supporte le développement et l'application de méthodologies informatiques comme outils inestimables pour résoudre la complexité des problèmes biologiques dans la recherche végétale. L'intégration de la biologie végétale et l'informatique est devenue de plus en plus importante pour l'avancée de nos connaissances sur le fonctionnement et le développement des plantes.

On the writer identification in old handwritten music scores

Report for the scientific sojourn at the University of Bern, Swiss, from Mars until June 2008. Writer identification consists in determining the writer of a piece of handwriting from a set of writers. Even though an important amount of compositions contains handwritten text in the music scores, the aim of the work is to use only music notation to determine the author. It’s been developed two approaches for writer identification in old handwritten music scores. The methods proposed extract features from every music line, and also features from a texture image of music symbols. First of all, the music sheet is first preprocessed for obtaining a binarized music score without the staff lines. The classification is performed using a k-NN classifier based on Euclidean distance. The proposed method has been tested on a database of old music scores from the 17th to 19th centuries, achieving encouraging identification rates.

Cultures jeunes et religions en Europe

Après la révolution religieuse des années 60, une nouvelle religiosité est-elle née ? Cette question est au coeur du livre. Il met, en effet, en scène les jeunes des années 80, les filles et les fils de la génération d'après-guerre, celle de Mai 68. Les parents ont pris leurs distances avec les différentes formes institutionnelles de l'autorité, y compris celle des Églises. Ils avaient été laissés libres de s'initier à une voie « spirituelle » : liberté de conscience et autonomie individuelle, deux valeurs clés attachées à la génération d'après-guerre, avaient orienté leur démarche religieuse. Les années 80 constituent de plus un contexte spécifique. Derrière le rideau de l'abondance, les contours de la précarité se dessinent. L'effondrement du mur de Berlin a entraîné celui des certitudes et des points de repère. L'apparition du sida a mis en cause le mythe dominant d'une jeunesse presque éternelle ouvrant sur une société sans âge et sans conflits de génération. Ces événements ont infléchi les quêtes de sens contemporaines. Fruit de la collaboration de vingt-deux sociologues venant de différents pays de l'Union européenne et de la Suisse, l'ouvrage, plutôt que de mettre côte à côte des observations empruntées aux pays concernés, propose des analyses transversales. Il permet ainsi de se faire une idée du changement religieux qui touche l'Europe dans son ensemble et de dégager quelques enjeux communs suscités par l'incertitude ambiante. Partant de l'analyse de la condition des jeunes dans les années 80, l'ouvrage aborde tour à tour la question de leur identité religieuse, celle de leurs systèmes de croyance, puis s'attarde sur les institutions qui ont contribué à leur socialisation religieuse. L'expérience constitue une caractéristique de la vie religieuse contemporaine, alors que la pluralité de l'offre reflète le changement socioculturel. Un chapitre est ainsi consacré à la présentation de quelques trajectoires typiques illustrant la gestion de l'incertitude dans laquelle est plongée la génération en cause. Enfin est abordée la question posée par une jeunesse qui apparaît aujourd'hui dépourvue d'encadrement institutionnel dans le champ religieux comme dans d'autres domaines : cette situation ne traduit-elle pas la crise de reproduction des institutions elles-mêmes ?

Sound Texture Modelling

In the PhD thesis “Sound Texture Modeling” we deal with statistical modelling or textural sounds like water, wind, rain, etc. For synthesis and classification. Our initial model is based on a wavelet tree signal decomposition and the modeling of the resulting sequence by means of a parametric probabilistic model, that can be situated within the family of models trainable via expectation maximization (hidden Markov tree model ). Our model is able to capture key characteristics of the source textures (water, rain, fire, applause, crowd chatter ), and faithfully reproduces some of the sound classes. In terms of a more general taxonomy of natural events proposed by Graver, we worked on models for natural event classification and segmentation. While the event labels comprise physical interactions between materials that do not have textural propierties in their enterity, those segmentation models can help in identifying textural portions of an audio recording useful for analysis and resynthesis. Following our work on concatenative synthesis of musical instruments, we have developed a pattern-based synthesis system, that allows to sonically explore a database of units by means of their representation in a perceptual feature space. Concatenative syntyhesis with “molecules” built from sparse atomic representations also allows capture low-level correlations in perceptual audio features, while facilitating the manipulation of textural sounds based on their physical and perceptual properties. We have approached the problem of sound texture modelling for synthesis from different directions, namely a low-level signal-theoretic point of view through a wavelet transform, and a more high-level point of view driven by perceptual audio features in the concatenative synthesis setting. The developed framework provides unified approach to the high-quality resynthesis of natural texture sounds. Our research is embedded within the Metaverse 1 European project (2008-2011), where our models are contributting as low level building blocks within a semi-automated soundscape generation system.

Evaluation of tumor vascularisation in two rat sarcoma models for studying isolated lung perfusion : Injection route determines the origin of tumour vessels

Résumé Introduction: La perfusion isolée cytostatique du poumon est une technique attractive qui permet l'administration des doses élevées d'un agent cytostatique tout en épargnant dans la mesure du possible la circulation systémique. Cependant, la perfusion de l'artère pulmonaire risque d'épargner le territoire pulmonaire vascularisé par l'intermédiaire des artères bronchiques, ce qui pourrait diminuer l'efficacité de ce traitement au cas où la lésion ciblée est vascularisée par les artères bronchiques. Ce travail est destiné au développement d'un modèle tumoral au niveau des poumons de rongeur (rat) porteur d'un sarcome pulmonaire afin de déterminer si la voie d'injection des cellules tumorales (intraveineuse, versus intratumorale) influencera la vascularisation des tumeurs (provenant du système artères pulmonaires ou artères bronchiques). Méthod: Des tumeurs de sarcomes pulmonaires ont été générées par injection d'une suspension cellulaire de sarcome, soit par injection intraveineuse, soit directement dans le parenchyme pulmonaire par thoracotomie. Ensuite, une perfusion isolée du poumon porteur de la tumeur à l'aide de l'encre a été effectuée, soit par l'artère pulmonaire, soit par le système des artères bronchiques. La distribution de l'encre dans les vaisseaux tumoraux ainsi que dans les vaisseaux non tumoraux du poumon adjacent a été investiguée à l'aide d'une analyse histologique des poumons perfusés. Résultat: L'administration intraveineuse et intratumorale de la suspension de cellules tumorales résulte en des tumeurs similaires sur le plan histologique. Néanmoins, l'injection intra-parenchymateuse démontre des tumeurs plus homogènes et avec un développement plus prédictible, était associée à une survie plus longue qu'après injection intraveineuse. Les analyses histologiques après perfusion isolée à l'aide de l'encre démontre que les tumeurs résultant de l'injection intraveineuse ont développé une vascularisation se basant sur le système d'artères pulmonaires tandis que les tumeurs émergeant après injection intraparenchymateuse ont développé une vascularisation provenant du système des artères bronchiques. Conclusion: Ce travail démontre pour la première fois l'importance du mode de génération de tumeurs pulmonaires en ce qui concerne leur future vascularisation, ce qui pourrait avoir un impact sur leur traitement par perfusion isolée du poumon. Abstract Isolated cytostatic lung perfusion (ILP) is an attractive technique allowing delivery of a high-dose of cytostatic agents to the lungs while limiting systemic toxicity. In developing a rat model of ILP, we have analysed the effect of the route of tumour cell injection on the source of tumour vessels. Pulmonary sarcomas were estab¬lished by injecting a sarcoma cell suspension either by the intravenous (i.v.) route or directly into the lung paren¬chyma. Ink perfusion through either pulmonary artery (PA) or bronchial arteries (BA) was performed and the characteristics of the tumour deposits defined. i.v. and direct injection methods induced pulmonary sarcoma nodules, with similar histological features. The intraparenchymal injection of tumour cells resulted in more reli¬able and reproducible tumour growth and was associat¬ed with a longer survival of the animals. i.v. injected tumours developed a PA-derived vascular tree whereas directly injected tumours developed a BA-derived vasculature.

An experimental study on the shallow-level migmatization of ferrogabbros from the Fuerteventura Basal Complex, Canary Islands

Spectacular shallow-level migmatization of ferrogabbroic rocks occurs in a metamorphic contact aureole of a gabbroic pluton of the Tierra Mala massif (TM) on Fuerteventura (Canary Islands). In order to improve our knowledge of the low pressure melting behavior of gabbroic rocks and to constrain the conditions of migmatization of the TM gabbros, we performed partial melting experiments on a natural ferrogabbro, which is assumed as protolith of the migmatites. The experiments were performed in an internally heated pressure vessel (IHPV) at 200 MPa, 930-1150 degreesC at relatively oxidizing conditions. Distinct amounts of water were added to the charge. From 930 to 1000 degreesC, the observed experimental phases are plagioclase (An(60-70)), clinopyroxene, amphibole (titanian magnesiohastingsites), two Fe-Ti oxides, and a basaltic, K-poor melt. Above 1000 degreesC, amphibole is no longer stable. The first melts are very rich in non-native plagioclase (>70 wt.%). This indicates that at the beginning of partial melting plagioclase is the major phase which is consumed to produce melt. In the experiments, plagioclase is stable up to high temperatures (1060 degreesC) showing increasing An content with temperature. This is not compatible with the natural migmatites, in which An-rich plagioclase is absent in the melanosomes, while amphibole is stable. Our results show that the partial melting of the natural rocks cannot be regarded as an ``in-situ'' process that occurred in a closed system. Considerable amounts of alkalis probably transported by water-rich fluids, derived from the mafic pluton underplating the TM gabbro, were necessary to drive the melting reaction out of the stability range of plagioclase. A partial melting experiment with a migmatite gabbro showing typical ``in-situ'' textures as starting material supports this assumption. Crystallization experiments performed at 1000 degreesC on a glass of the fitised ferrogabbro with different water contents added to the charge show that generally high water activities could be achieved (crystallization of amphibole), independently of the bulk water content, even in a system with very low initial bulk water content (0.3 wt.%). Increasing water contents produce plagioclase richer in An, reduces the modal proportion of plagioclase in the crystallizing assemblage and extends the melt fraction. High melt fractions of >30 wt.% could only be observed in systems with high bulk water contents (> - 2 wt.%). This indicates that the migmatites were generated under water-rich conditions (probably water-saturated), since those migmatites, which are characterized as ``in-situ'' formations, show generally high amounts of leucosomes (>30 wt.%). (C) 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.

Survival responses in stressed organs

Apoptosis or programmed cell death is a regulated form of cell suicide executed by cysteine proteases, or "caspases", to maintain proper tissue homeostasis in multicellular organisms. Dysregulation of apoptosis leads to pathological complications including cancer, autoimmunity, neurodegenerative, and heart diseases. Beside their known function as the key executioners of apoptotic cell death, caspases were reported to mediate non-apoptotic functions. In this report we study the survival signals conveyed through caspase-3-mediated cleavage of Ras GTPase-activating proteins (RasGAP). Ubiquitously expressed, RasGAP senses caspase activity and controls the cell death/survival switch. RasGAP is cleaved once at low caspase activity and the generated N-terminal fragment (fragment N) induces a survival response by activating Ras/PI3K/Akt pathway. However, high caspase activity associated with increased stress leads to fragment Ν cleavage into fragments that do not mediate any detectable survival signals. In this thesis project we studied the role of fragment Ν in protecting stressed organs as well as in maintenance of their functionality. In response to stress in different organs, we found that mice lacking caspase-3 or unable to cleave RasGAP (Knock-In mice), and therefore unable to generate fragment N, were deficient in Akt activation and experienced increased apoptosis compared to wild-type mice. Augmented tissue damage and organ dysfunction in those mice highlight the importance of fragment Ν in activating Akt-mediated prosurvival pathway and in protection of organs during episodes of stress. In parallel we investigated the role of fragment Ν in regulating the activation of transcription factor NF-kB, a master regulator of inflammation. Sustained NF-kB activation may be detrimental by directly causing apoptosis or leading to a persistent damaging inflammation response. We found that fragment Ν is a potent inhibitor of NF-kB by favoring its nuclear export. Therefore, fragment Ν regulates NF-kB activity and contributes to a controlled response as well as maintenance of homeostasis in stressed cells. Importantly, these findings introduce new insights of how activated caspase-3 acts as a stress intensity sensor that controls cell fate by either initiating a fragment N- dependent cell resistance program or a cell suicide response. This identifies the pivotal role of fragment Ν in protection against patho-physiological damage, and encourages the development of therapies which aim to increase cell resistance to vigorous treatment. - L'apoptose, ou mort cellulaire programmée, est une forme contrôlée de suicide cellulaire exécuté par des protéines appelées caspases, dans le but de maintenir l'homéostasie des tissus sains dans les organismes multicellulaires. Un mauvais contrôle de l'apoptose peut mener à des pathologies comme le cancer, la neurodégénération et les maladies cardiaques et auto-immunes. En dehors de leur rôle connu d'exécutrices de l'apoptose, les caspases ont aussi été identifiées dans d'autres contextes non-apoptotiques. Dans ce projet, nous avons étudié les signaux de survie émis par le résultat du clivage de RasGAP par la caspase-3. Exprimée de façon ubiquitaire, RasGAP est sensible à l'activité de caspase-3 et contrôle la décision de la cellule à entreprendre la mort ou la survie cellulaire. A un taux d'activité faible, la caspase-3 clive RasGAP, ce qui mène à la génération d'un fragment N-terminal, appelé Fragment N, qui induit des signaux de survie via l'activation de la cascade Ras/PI3K/Akt. Cependant, lorsque l'activité de la caspase-3 augmente, le fragment N est clivé, ce qui a pour effet d'éliminer ces signaux de survie. Dans ce travail, nous avons étudié le rôle du Fragment N dans la protection des organes en état de stress et dans le maintien de leur fonctionnalité. En réponse à certains stress, nous avons découvert que les organes de souris n'exprimant pas la caspase-3 ou alors incapables de cliver RasGAP (souris Kl), et de ce fait n'ayant pas la possibilité de générer le Fragment N, perdaient leur faculté d'activer la protéine Akt et démontraient un taux d'apoptose plus élevé que des organes de souris sauvages. Le fait que les organes et tissus de ces souris manifestaient de graves dommages et dysfonctions met en évidence l'importance du Fragment N dans l'activation des signaux de survie via la protéine Akt et dans la neutralisation de l'apoptose induite par la caspase-3. En parallèle, nous avons investigué le rôle du Fragment N dans la régulation de l'activation de NF-kB, un facteur de transcription clé dans l'inflammation. Une activation soutenue de NF-kB peut être délétère par activation directe de l'apoptose ou peut mener à une réponse inflammatoire persistante. Nous avons découvert que le Fragment N, en favorisant l'export de NF-kB depuis le noyau, était capable de l'inhiber très efficacement. Le Fragment N régule donc l'activité de NF-kB et contribue au maintien de l'homéostasie dans des cellules stressées. Ces découvertes aident, de façon importante, à la compréhension de comment l'activation de la caspase-3 agit comme senseur de stress et décide du sort de la cellule soit en initiant une protection par le biais du fragment N, ou en induisant un suicide cellulaire. Cette étude définit le Fragment Ν comme ayant un rôle de pivot dans la protection contre des dommages patho-physiologiques, et ouvre des perspectives de développement de thérapies qui cibleraient à augmenter la résistance à divers traitements.

Modificació d'un sistema de generació de grafisme per televisió amb la incorporació d'objectes generats amb OpenGL

Els objectius inicials d'aquest projecte eren la incorporació d'OpenGL a l'eina ja existent de generació de grafisme per televisió. Com que l'aplicador ja dissenyat es basava en un reduït tipus d'objectes sobre els quals es podien aplicar diferents paràmetres i agrupar-los de diferents maneres, calia trobar un nou tipus d'objecte que tingués alguna particularitat que el fes prou atractiu per a incorporar-lo a l'aplicació. El resultat va ser un objecte polièdric per a poder-hi mapar diferents textures i un text aplicant-hi una ombra en tres dimensions segons la posició del dibuix.

Analysis of the regulation of Nodal function by SPC-mediated cleavage during early mammalian development

RÉSUMÉ Après implantation dans l'utérus, le foetus de mammifère est composé de trois populations différentes de cellules: l'epiblast, l'ectoderme extraembryonnaire et l'endoderme viscéral. Pendant la gastrulation, les cellules de l'epiblast donnent naissance aux trois lignées germinales: l'ectoderme, le mésoderme et l'endodermes. Les lignées germinales produisent par la suite les différents tissus et organes du corps embryonnaire et adulte. Les cellules de l'ectoderme extraembryonnaire donnent par la suite le composant foetal du placenta qui est essentiel à la survie de l'embryon dans l'utérus. L'épiblast et l'ectoderme extraembryonnaire sont entourés par l'endoderme viscéral et forment une structure connue sous le nom de bouton embryonnaire. L'endoderme viscéral joue un rôle important dans l'embryogenèse car il comporte une sous-population de cellules appelées l'endoderme viscéral antérieur dont les signaux influencent l'épiblast adjacent et déterminent le futur axe antéro-postérieur de l'embryon. La protéine de signalisation Nodal de la famille des TGFß est essentielle dans l'épiblast pour spécifier le mésendoderme, l'endoderme viscéral antérieur, ainsi que pour maintenir les cellules souche de l'ectoderme extraembryonnaire. Ainsi, dans les embryons mutants pour Nodal, aucun axe antéro-postérieur n'est établi, les lignées germinales ne sont pas spécifiés et le placenta ne se développe pas. Au niveau moléculaire, comme pour les protéines de la famille des TGFß, Nodal est initialement synthétisée sous forme de précurseur avant d'être clivée de façon endoproteolytique par des protéanes sécrétées, les proprotéines convertases du type subtilisin (SPC), qui suppriment la partie inhibitrice N-terminale du pro peptide. Dans ce contexte, le projet de ma thèse a été d'analyser l'influence des SPC sur la fonction de Nodal en employant une combinaison d'approches génétiques et biochimiques. Premièrement, nous avons constaté que le clivage du précurseur par les protéases active Nodal, mais en même temps augmente son turn-over et diminue la portée de son action. Deuxièmement, dans l'embryon, il apparaît que Nodal est activé par l'action combinée de Furin et de PACE4, deux protéases sécrétées qui sont spécifiquement exprimées dans les cellules de l'ectoderme extraembryonnaire, donc adjacentes au domaine d'expression de Nodal. De manière similaire aux mutants de Nodal, les embryons mutants pour les deux protéases ne forment pas d'endoderme viscéral antérieur et ne gastrulent pas. Cependant, certains gènes cible de Nodal restent exprimés, suggérant que toutes les activités de Nodal ne sont pas dépendent du clivage par les SPCs. En effet, la génération et l'analyse de mutants portant un allèle knock-in qui code pour une forme mutante de Nodal résistante aux SPC, ont montré que ces mutants ont les caractères phénotypique des mutants de Nodal seulement de façon partielle. La formation de mésoderme est partiellement induite, et de façon remarquable, la forme de Nodal résistante aux SPC est capable d'agir à une distance de sa source, maintenant l'expression de ses propres protéases et d'autres gènes essentiels pour la spécification de l'ectoderme extraembryonnaire. Ensemble, ces résultats prouvent que par leur action directe les protéases extraembryonnaire modulent la signalisation de Nodal pendant le développement mammifère précoce. SUMMARY : Early after implantation in the uterus, the mammalian conceptus is composed of three different cell populations: the epiblast, the extraembryonic ectoderm and the visceral endoderm. During gastrulation, epiblast cells give rise to the three embryonic germ layers: the ectoderm, the mesoderm and the endoderm. These germ layers then generate the different tissues and organs of the embryonic and adult bodies. In parallel, extraembryonic ectoderm cells give rise to the fetal component of the placenta, which is essential for the survival of the embryo in the uterus. Both the epiblast and extraembryonic ectoderm are surrounded by the visceral endoderm to form a structure known as the egg cylinder. The visceral endoderm plays an important role as it harbours a subpopulation of cells called the anterior visceral endoderm, from which signals influence the adjacent epiblast and determine the future antero-posterior embryonic axis. The TGFß-related signalling protein Nodal is required within the epiblast to specify the mesoderm, the endoderm,the anterior visceral endoderm and is also essential to maintain stem cells in the extraembryonic ectoderm. Thus, in Nodal null conceptuses, no antero-posterior axis is established, the germ layers are not specified and the placenta does not develop. At the molecular level, Nodal, like related proteins of the TGFß family, is initially synthesized as a precursor and undergoes endoproteolytic cleavage by secreted proteases of the subtilisin-like proprotein convertases (SPC) to remove an inhibitory N-terminal pro peptide. In the embryo, Nodal is activated by the combined action of Furin and PACE4, two secreted SPCs that are specifically expressed in cells of the extraembryonic ectoderm, thus adjacent to the Nodal expression domain. Similar to Nodal null .embryos, mutant embryos lacking both these proteases fail to specify the anterior visceral endoderm and to undergo gastrulation. However, these mutants still express a subset of Nodal target genes, suggesting that part of Nodal activity is independent on cleavage by SPCs. Indeed, by generating and analyzing mutants with a knock-in allele that encodes an SPC-resistant mutant form of Nodal, I could show that they retain a subset of Nodal activities. Mesoderm formation is partially induced, but most remarkably, SPC-resistant Nodal form is able to act at a distance from its source, maintaining the expression of its proteases and of other genes essential for maintenance of the extraembryonic ectoderm.

Les expériences de vulnérabilité collective : de la fragilisation de principes normatifs à leur réaffirmation, de la problématisation de frontières intergroupes à la reconnaissance de droits universels

Plan du travail La première partie de cette thèse est consacrée à la tentative d'identifier les racines et lés contours d'une théorie de la vulnérabilité collective. Des approches théoriques et empiriques différentes sont exposées, et parfois revisitées, dans le but de proposer une perspective intégrative des sollicitations psychologiques particulières et des comportements sociaux caractéristiques d'un contexte de vulnérabilité collective. Dans le premier chapitre, les liens conceptuels entre les trois notions fondamentales de normes, de communautés et d'histoire sont explicités, afin de clarifier l'approche non-réductionniste des dynamiques collectives qui oriente le travail. Une attention particulière est accordée aux processus par lesquels des comportements sociaux orientés par des normes pertinentes au sein d'une communauté permettent de clarifier et de transformer des identités sociales (Reicher, 1982), voire de générer de nouveaux faits institutionnels (Searle, 1995). Il s'agit aussi de mettre en évidence l'apport potentiel d'une théorie qui se construit autour de l'articulation entre l'individu et son contexte social, à un débat épistémologique et méta-théorique entre psychologues sociaux, présent dès l'origine de la discipline (voire notamment Doise, 1982 ; Greenwood, 2004 ; Reicher, 2004 ; Tajfel, 1972). Les deux chapitres suivants proposent une logique explicative de la manière dont les membres d'une communauté, traversant une expérience de vulnérabilité collective, construisent une ligne d'action pour réagir aux sollicitations particulières d'un tel contexte social. Plus précisément, le chapitre 2 met en perspective des travaux de psychologie sociale sur le décalage entre l'identification d'injustices personnelles et l'identification d'injustices collectives, avec des travaux de sciences politiques sur le contraste entre l'irrationnalité apparente des comportements politiques compte tenu des situations de vie individuelles, et la rationnalité collective émergente de ces comportements en réaction à l'évolution de la situation collective. Le chapitre 3 met en perspective les travaux de psychologie sociale sur les motivations psychologiques et les stratégies mises en oeuvre afin de protéger la croyance fondamentale de vivre dans un monde juste, avec des travaux sociologiques rendant compte de l'incapacité humaine à supporter des situations d'anomie. Ces deux chapitres permettent ainsi d'étayer théoriquement l'hypothèse fondamentale qu'une expérience de vulnérabilité collective suscite des réactions qui dépassent la somme des réactions individuelles aux expériences personnelles de victimisation correspondantes. Ils amèneront à identifier deux types de comportements sociaux comme réactions typiques à un contexte de vulnérabilité collective : la contestation des dirigeants et des institutions du pouvoir établi, ainsi que la condamnation des transgressions des principes normatifs fragilisés. Lors des deux derniers chapitres de la partie théorique, ces phénomènes sont inscrits dans une temporalité plus longue. Le chapitre 4 tâche, d'une part, de préciser les conditions sociohistoriques particulières dans lesquelles la mise en cause du pouvoir établi et la réaffirmation de principes normatifs fragilisés amène à la reconnaissance que ces principes devraient s'appliquer également au traitement de personnes en dehors des frontières d'une communauté d'appartenance exclusive, ainsi qu'en particulier à la reconnaissance de droits universels. D'autre part, ce chapitre soulève la question des processus d'institutionnalisation qui stabilisent dans le temps les acquis normatifs résultant d'épisodes socio-historiques spécifiques, en particulier sous forme d'une inscription dans le droit international. L'idée est développée ainsi que c'est avant tout lors d'épisodes de problématisation d'identités exclusives que naît ou renaît l'aspiration à instituer une identité humaine. Le chapitre 5, finalement, introduit un second processus par lequel les acquis normatifs, résultant d'épisodes de vulnérabilité collective, sont susceptibles d'être préservés, à partir de l'idée que ceux-ci ne génèrent pas seulement des conditions favorables à l'émergence de nouvelles institutions, mais affectent également les engagements identitaires d'un nombre important d'individus simultanément. L'hypothèse est développée que la transition à la vie adulte constitue un passage du parcours de vie qui est particulièrement propice à un effet durable du contexte socio-historique sur les engagements identitaires d'une personne. De cette manière, la génération des jeunes adultes lors d'une expérience de vulnérabilité collective est susceptible de porter à travers le temps les traces des reconfigurations symboliques résultant de l'événement. Les arguments théoriques développés à travers les cinq premiers chapitres sont condensés sous forme d'une série de propositions théoriques falsifiables, en plus de l'hypothèse fondamentale d'irréductibilité de l'expérience collective. Afin de faciliter et de structurer la lecture des chapitres 2 à 5, chacune de ces propositions est placée en amont du chapitre dans lequel sont présentés les principaux arguments théoriques qui l'étayent. Ceci devrait aider à la mise en relief d'un fil rouge qui organise ces chapitres au-delà des ramifications argumentatives plus fines. Les propositions théoriques énoncées sont conçues comme un système théorique ; la signification de chacune d'entre elle peut être appréhendée au mieux en relation avec l'ensemble des autres propositions. Néanmoins, ces propositions sont formulées de manière à ce que chacune puisse être confrontée séparément à des observations empiriques systématiques. Il s'agit de répondre entre autres à une exigence pragmatique : aucune base de données, existante à ce jour, ne permettrait une évaluation complète du système théorique proposé. Les deux autres parties de la thèse présentent une suite d'études empiriques destinées à évaluer la pertinence des idées théoriques développées lorsque celles-ci sont appliquées à deux types particuliers d'expériences de vulnérabilité collective : au contexte des sociétés européennes connaissant actuellement un phénomène d'exclusion sociale massive (deuxième partie) et au contexte des sociétés d'après-guerre (troisième partie). Dans les deux cas, une stratégie méthodologique en deux temps est poursuivie. La première étape consiste dans la présentation d'analyses secondaires de la base de données internationale la plus pertinente à disposition. Il s'agit des données du European Social Survey (EES), ainsi que de l'enquête People on War (PoW), c'est-à-dire de deux enquêtes comparatives portant sur des échantillons représentatifs des populations d'un nombre de contextes considérables. Elles présentent l'avantage majeur de fournir simultanément des informations sur les expériences de victimisation pertinentes -situations de chômage et de pauvreté, dans le premier cas, expériences traumatisantes de la guerre dans le second - et sur l'expression de jugements politiques ou normatifs. Etant donné le caractère représentatif des échantillons étudiés, il est possible de construire des indicateurs qui informent sur la qualité des expériences collectives par agrégation des expériences individuelles à un niveau contextuel. L'utilisation de méthodes d'analyse multiniveaux permet ensuite de démêler l'impact des expériences collectives de celui des expériences individuelles sur les jugements exprimés. La deuxième étape consiste à compléter les analyses secondaires par une enquête réalisée directement en vue du cadre théorique présenté ici. Deux enquêtes ont été réalisées sur des échantillons de jeunes (pré-)adultes, à travers des contextes moins nombreux, mais directement sélectionnés selon des critères théoriques. Ainsi, l'Enquête sur l'entrée dans la vie adulte à travers trois régions françaises (EVA), se concentre sur trois contextes régionaux qui représentent trois situations-type quant à l'intensité de la vulnérabilité collective liée à l'exclusion sociale : particulièrement forte, intermédiaire ou particulièrement faible. L'enquête Transition to adulthood and collective expériences survey (TRACES) rassemble quatre pays d'ex-Yougoslavie, selon un plan qui croise les deux types de vulnérabilité collective pris en compte : deux contextes sur quatre ont été marqués par un épisode de vulnérabilité collective particulièrement intense lié à la guerre, et deux contextes sont marqués par une très forte vulnérabilité collective liée à l'exclusion sociale ; l'un de ces deux derniers contextes seulement a également été fortement affecté par la guerre. Se concentrant sur des échantillons plus modestes, ces deux enquêtes permettent des approfondissements importants, du fait qu'elles recourent à des outils d'enquête taillés sur mesure pour la problématique présente, en particulier des outils permettant d'évaluer les réactions face à des cas concrets de violations des droits humains, présentés sous forme de scénarios. Dans leur ordre de présentation, l'objet des quatre chapitres empiriques se résume de la manière suivante. Le chapitre 6 présente des analyses secondaires des deux premières vagues du ESS (2002 et 2004), portant en premier lieu sur l'impact du degré d'exclusion sociale sur la contestation des dirigeants et des institutions politiques, à travers vingt pays européens. Une importance particulière est accordée à la manière dont les expériences modulent l'effet des insertions dans des relations entre groupes asymétriques sur les jugements politiques, ainsi que sur la durabilité des effets des expériences collectives en fonction des cohortes. Les analyses de l'enquête EVA, dans le chapitre 7, approfondissent l'étude des liens entre contexte de vulnérabilité collective liée à l'exclusion sociale, l'insertion dans des rapports sociaux asymétriques et la contestation des institutions politiques. De plus, elles mettent en perspective ces liens avec les variations, en fonction du contexte et de l'origine sociale, de la condamnation de transgressions concrètes des droits socio-économiques. Le chapitre 8 rapporte les analyses secondaires de l'enquête PoW de 1999, qui visent en premier lieu à expliquer - à travers 14 contextes d'après-guerre sur quatre continents - les condamnations des violations du droit international humanitaire et la reconnaissance du caractère légal des normes transgressées en fonction de la distribution des expériences traumatisantes au sein de chaque contexte. Ces analyses permettent en particulier de comparer l'effet à moyen terme de ces expériences en fonction de l'âge au moment de la période du conflit armé. Finalement, le chapitre 9 présente des résultats de l'enquête TRACES. Ceux-ci permettent d'évaluer l'impact des expériences d'une vulnérabilité collective liée à la guerre sur la cohorte des jeunes adultes de la guerre, et de le mettre en perspective avec l'impact de l'exclusion sociale massive. Plusieurs dimensions sont prises en compte : la contestation des institutions politiques et la force de la condamnation de la violation des normes humanitaires ou des droits socio-économiques, ainsi que la reconnaissance d'une juridiction internationale en la matière. De plus, les fonctions psychologiques spécifiques de l'engagement dans la réaffirmation de normes fragilisées sont étudiées, notamment en termes d'effets sur la restauration de la croyance en une justice fondamentale, et sur la satisfaction de vie personnelle. Au fil de ces quatre chapitres empiriques, les propositions théoriques énoncées au préalable servent de passerelles entre le système théorique et les études empiriques. Dans l'introduction de chaque étude, les propositions qui s'y appliquent sont reprises et ensuite reformulées sous forme d'une hypothèse opérationnelle qui adopte la proposition générale au contexte et au phénomène spécifiques. Les deux parties empiriques sont suivies d'une conclusion, qui établit d'abord un bilan de l'apport de l'ensemble des quatre enquêtes analysées à la vérification de toutes les propositions théoriques, pour extraire ensuite trois principes explicatifs plus généraux et pour préciser leur insertion dans un contexte méta-théorique plus large.

Jeunes et personnes âgées face au rationnement des soins

Après avoir indiqué que les personnes âgées - parmi lesquelles les femmes surtout - risquent d'être particulièrement touchées par d'éventuelles mesures de rationnement des prestations sanitaires, les auteurs insistent sur les affinités entre l'idée de rationnement et l'hygiène sociale. Une recherche empirique conduite en Suisse romande auprès d'individus jeunes et âgés révèle que plus les rapports intergénérationnels sont tendus, plus l'âge apparaît comme un critère de rationnement pertinent pour l'une et l'autre génération. Finalement, les auteurs se prononcent contre le rationnement explicite des prestations sanitaires, cette mesure apparaissant discutable aussi bien sur les plans économique, politique qu'éthique.

Targeting anticancer therapy : clinical and preclinical approaches

AbstractCancer treatment has shifted from cytotoxic and nonspecific chemotherapy to chronic treatment with targeted molecular therapies. These new classes of drugs directed against cancer-specific molecules and signaling pathways, act at a particular level of the tumor cell development. However, in both types of therapeutic approaches (standard cytotoxic chemotherapy and targeted signal transduction inhibitions), toxicity and side effects can occur. The aim of this thesis was to investigate various approaches to improve the activity and tolerability of cancer treatment, in a clinical setting, a) by molecular targeting through the use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs), whose dosage can be adapted to each patient according to plasma levels, and, b) in a preclinical model, by tissue targeting with locoregional administration of cytotoxic chemotherapy to increase drug exposure in the target tissue while reducing systemic toxicity of the treatment.A comprehensive program for the Therapeutic Drug Monitoring (TDM) of the new class of targeted anticancer drugs of TKIs in patient's blood has been therefore initiated comprising the setting up, validation and clinical application of a multiplex assay by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry of TKIs in plasma from cancer patients. Information on drugs exposure may be clinically useful for an optimal follow-up of patients' anticancer treatment, especially in case of less than optimal clinical response, occurrence of adverse drug reaction effects and the numerous risks of drug-drug interactions. In this context, better knowledge of the potential drug interactions between TKIs and widely prescribed co- medications is of critical importance for clinicians, to improve their daily care of cancer patients. For one of the first TKI imatinib, TDM interpretation is nowadays based on total plasma concentrations but, only the unbound (free) form is likely to enter cell to exert its pharmacological action. Pharmacokinetic analysis of the total and free plasma level of imatinib measured simultaneously in patients have allowed to refine and validate a population pharmacokinetic model integrating factors influencing in patients the exposure of pharmacological active species. The equation developed from this model may be used for extrapolating free imatinib plasma concentration based on the total plasma levels that are currently measured in TDM from patients. Finally, the specific influence of Pglycoprotein on the intracellular disposition of TKIs has been studies in cell systems using the siRNA silencing approach.Another approach to enhance the selectivity of anticancer treatment may be achieved by the loco-regional administration of a cytostatic agent to the target organ while sparing non- affected tissues. Isolated lung perfusion (ILP) was designed for the treatment of loco-regional malignancies of the lung but clinical results have been so far disappointing. It has been shown in a preclinical model in rats that ILP with the cytotoxic agent doxorubicin alone allows a high drug uptake in lung tissue, and a low systemic toxicity, but was characterized by a high spatial tissular heterogeneity in drug exposure and doxorubicin uptake in tumor was comparatively smaller than in normal lung tissue. Photodynamic therapy (PDT) is a new approach for the treatment of superficial tumors, and implies the application of a sensitizer activated by a laser light at a specific wavelength, that disrupts endothelial barrier of tumor vessels to increase locally the distribution of cytostatics into the tumor tissue. PDT pre-treatment before intravenous administration of liposomal doxorubicin was indeed shown to selectively increase drug uptake in tumors in a rat model of sarcoma tumors to the lung.RésuméLe traitement de certains cancers s'est progressivement transformé et est passé de la chimiothérapie, cytotoxique et non spécifique, au traitement chronique des patients avec des thérapies moléculaires ciblées. Ces médicaments ont une action ciblée en interférant à un niveau spécifique du développement de la cellule tumorale. Dans les deux types d'approches thérapeutiques (chimiothérapie cytotoxique et traitements ciblés), on est confronté à la présence de toxicité et aux effets secondaires du traitement anticancéreux. Le but de cette thèse a donc été d'étudier diverses approches visant à améliorer l'efficacité et la tolérabilité du traitement anticancéreux, a) dans le cadre d'une recherche clinique, par le ciblage moléculaire grâce aux inhibiteurs de tyrosines kinases (TKIs) dont la posologie est adaptée à chaque patient, et b) dans un modèle préclinique, par le ciblage tissulaire grâce à l'administration locorégionale de chimiothérapie cytotoxique, afin d'augmenter l'exposition dans le tissu cible et de réduire la toxicité systémique du traitement.Un programme de recherche sur le suivi thérapeutique (Therapeutic Drug Monitoring, TDM) des inhibiteurs de tyrosine kinases a été ainsi mis en place et a impliqué le développement, la validation et l'application clinique d'une méthode multiplex par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem des TKIs chez les patients souffrant de cancer. L'information fournie par le TDM sur l'exposition des patients aux traitements ciblés est cliniquement utile et est susceptible d'optimiser la dose administrée, notamment dans les cas où la réponse clinique au traitement des patients est sous-optimale, en présence d'effets secondaires du traitement ciblé, ou lorsque des risques d'interactions médicamenteuses sont suspectés. Dans ce contexte, l'étude des interactions entre les TKIs et les co-médications couramment associées est utile pour les cliniciens en charge d'améliorer au jour le jour la prise en charge du traitement anticancéreux. Pour le premier TKI imatinib, l'interprétation TDM est actuellement basée sur la mesure des concentrations plasmatiques totales alors que seule la fraction libre (médicament non lié aux protéines plasmatiques circulantes) est susceptible de pénétrer dans la cellule pour exercer son action pharmacologique. L'analyse pharmacocinétique des taux plasmatiques totaux et libres d'imatinib mesurés simultanément chez les patients a permis d'affiner et de valider un modèle de pharmacocinétique de population qui intègre les facteurs influençant l'exposition à la fraction de médicament pharmacologiquement active. L'équation développée à partir de ce modèle permet d'extrapoler les concentrations libres d'imatinib à partir des concentrations plasmatiques totales qui sont actuellement mesurées lors du TDM des patients. Finalement, l'influence de la P-glycoprotéine sur la disposition cellulaire des TKIs a été étudiée dans un modèle cellulaire utilisant l'approche par la technologie du siRNA permettant de bloquer sélectivement l'expression du gène de cette protéine d'efflux des médicaments.Une autre approche pour augmenter la sélectivité du traitement anticancéreux consiste en une administration loco-régionale d'un agent cytostatique directement au sein de l'organe cible tout en préservant les tissus sains. La perfusion isolée du poumon (ILP) a été conçue pour le traitement loco-régional des cancers affectant les tissus pulmonaires mais les résultats cliniques ont été jusqu'à ce jour décevants. Dans des modèles précliniques chez le rat, il a pu être démontré que l'ILP avec la doxorubicine, un agent cytotoxique, administré seul, permet une exposition élevée au niveau du tissu pulmonaire, et une faible toxicité systémique. Toutefois, cette technique est caractérisée par une importante variabilité de la distribution dans les tissus pulmonaires et une pénétration du médicament au sein de la tumeur comparativement plus faible que dans les tissus sains.La thérapie photodynamique (PDT) est une nouvelle approche pour le traitement des tumeurs superficielles, qui consiste en l'application d'un agent sensibilisateur activé par une lumière laser de longueur d'onde spécifique, qui perturbe l'intégrité physiologique de la barrière endothéliale des vaisseaux alimentant la tumeur et permet d'augmenter localement la pénétration des agents cytostatiques.Nos études ont montré qu'un pré-traitement par PDT permet d'augmenter sélectivement l'absorption de doxorubicine dans les tumeurs lors d'administration i.v. de doxorubicine liposomale dans un modèle de sarcome de poumons de rongeurs.Résumé large publicDepuis une dizaine d'année, le traitement de certains cancers s'est progressivement transformé et les patients qui devaient jusqu'alors subir des chimiothérapies, toxiques et non spécifiques, peuvent maintenant bénéficier de traitements chroniques avec des thérapies ciblées. Avec les deux types d'approches thérapeutiques, on reste cependant confronté à la toxicité et aux effets secondaires du traitement.Le but de cette thèse a été d'étudier chez les patients et dans des modèles précliniques les diverses approches visant à améliorer l'activité et la tolérance des traitements à travers un meilleur ciblage de la thérapie anticancéreuse. Cet effort de recherche nous a conduits à nous intéresser à l'optimisation du traitement par les inhibiteurs de tyrosines kinases (TKIs), une nouvelle génération d'agents anticancéreux ciblés agissant sélectivement sur les cellules tumorales, en particulier chez les patients souffrant de leucémie myéloïde chronique et de tumeurs stromales gastro-intestinales. L'activité clinique ainsi que la toxicité de ces TKIs paraissent dépendre non pas de la dose de médicament administrée, mais de la quantité de médicaments circulant dans le sang auxquelles les tumeurs cancéreuses sont exposées et qui varient beaucoup d'un patient à l'autre. A cet effet, nous avons développé une méthode par chromatographie couplée à la spectrométrie de masse pour mesurer chez les patients les taux de médicaments de la classe des TKIs dans la perspective de piloter le traitement par une approche de suivi thérapeutique (Therapeutic Drug Monitoring, TDM). Le TDM repose sur la mesure de la quantité de médicament dans le sang d'un patient dans le but d'adapter individuellement la posologie la plus appropriée: des quantités insuffisantes de médicament dans le sang peuvent conduire à un échec thérapeutique alors qu'un taux sanguin excessif peut entraîner des manifestations toxiques.Dans une seconde partie préclinique, nous nous sommes concentrés sur l'optimisation de la chimiothérapie loco-régionale dans un modèle de sarcome du poumon chez le rat, afin d'augmenter l'exposition dans la tumeur tout en réduisant la toxicité dans les tissus non affectés.La perfusion isolée du poumon (ILP) permet d'administrer un médicament anticancéreux cytotoxique comme la doxorubicine, sélectivement au niveau le tissu pulmonaire où sont généralement localisées les métastases de sarcome. L'administration par ILP de doxorubicine, toxique pour le coeur, a permis une forte accumulation des médicaments dans le poumon, tout en épargnant le coeur. Il a été malheureusement constaté que la doxorubicine ne pénètre que faiblement dans la tumeur sarcomateuse, témoignant des réponses cliniques décevantes observées avec cette approche en clinique. Nous avons ainsi étudié l'impact sur la pénétration tumorale de l'association d'une chimiothérapie cytotoxique avec la thérapie photodynamique (PDT) qui consiste en l'irradiation spécifique du tissu-cible cancéreux, après l'administration d'un agent photosensibilisateur. Dans ce modèle animal, nous avons observé qu'un traitement par PDT permet effectivement d'augmenter de façon sélective l'accumulation de doxorubicine dans les tumeurs lors d'administration intraveineuse de médicament.

Recherche translationnelle: de l'animal modèle de schizophrénie à la forme humaine de difficulté cognitive. Evaluation des performances de navigation spatiale et des stratégies utilisées

Un protocole de tests sur labyrinthe radial permettant d'évaluer la navigation spatial chez l'homme a été réalisé. Ces tests sur labyrinthe radial sont basés sur le protocole utilisé sur l'animal modèle de schizophrénie dans le CNP (Centre de neuroscience psychiatrique) de Lausanne. Les recherches actuelles du CNP ont montré un déficit dans les capacités d'orientation spatiale de ces animaux [13]. Ainsi notre méthodologie consistera à tester des sujets humains dans des tâches de labyrinthe afin d'étudier de la manière la plus équivalente les différents déficits observés dans la pathologie humaine et dans le rat modèle. Cette démarche est à la base d'une approche translationnelle qui combine recherches cliniques et expérimentales. Le travail expérimental a été mené sur deux dispositifs analogues. a) «radial au doigt», ensemble de petits canaux qui peuvent être explorés par le doigt, yeux ouverts ou fermés et dans lesquels des textures différentes tapissent chaque bras. b) «radial sur écran tactile», deux labyrinthes qui comparent deux types d'indice locale, couleurs différentes ou patrons noir-blanc. Dans les deux dispositifs a été prévu une série de tests permettant d'évaluer la mémorisation des indices utilisés en les supprimant temporairement où en les mettant en contradiction. La première perturbation a pour but de tester l'importance du référentiel locale par une rotation de 90° du labyrinthe. La permutation des bras lors d'un dernier essai permet d'induire une situation ou les informations ont été soit correctes spatialement mais incorrectes localement (texture) soit inversement. Ces perturbations des informations sensorielles qui sont fournies au sujet, permettent d'observer les systèmes de repérage et leur poids relatif dans la construction d'un système de référence durant la navigation spatiale. Les résultats du labyrinthe radial au doigt montrent que dans les conditions utilisant les informations visuelles les participants sont sensiblement plus performants. Il est apparu que les informations visuelles prédominent sur les informations proprioceptives et tactiles. Ainsi dans la condition intégrant informations visuospatiales, proprioceptives et tactiles, les sujets basent plus fortement leur navigation spatiale sur les indices visuelles soit locale soit spatiale. Dans cette condition une différence significative de stratégie entre hommes et femmes est apparue. Les hommes se basent majoritairement sur des indices spatiaux tandis que les femmes préfèrent les indices locaux. En présence d'informations tactiles et proprioceptives mais en absence de la vision, les participants utilisent les références spatiale et locale complémentairement sans avoir un système prédominant. Alors que si uniquement les informations proprioceptives sont présentes, les sujets utilisent un système de référence spatiale (globale). Le labyrinthe radial sur écran tactile indique une différence de système de référence selon l'indice local employé. Les couleurs, étant des forts indices locaux, vont favoriser un système de référence local. Au contraire les patrons noirs-blancs sont des indices visiblement très complexes et difficiles à mémoriser qui vont pousser les sujets à utiliser une stratégie de référence spatiale.

Acid-sensing ion channels : modulation by serine-proteases and involvement in acid-induced action potential generation in hippocampal neurons

SUMMARY Acid-sensing ion channels (ASICs) are non-voltage gated sodium channels. They are activated by rapid extracellular acidification and generate an inactivating inward current. Four ASIC genes have been cloned: ASIC1, 2, 3 and 4, with variants a and b for ASIC1and AS1C2. ASICs are expressed in neurons of the central (CNS) and peripheral nervous system (PNS). In the CNS, ASICs have a role in learning, memory, as well as in neuronal death in ischemia. In the PNS, ASICs are involved in the perception of acid-induced pain, as well as in mechanoperception. In one part of my thesis project, we addressed the question of the mechanism of regulation of ASIC1 a by the serine protease trypsin at the molecular level. Trypsin modifies the function of ASIC1 a but not of ASIC1b. In order to identify the channel region responsible for this effect, we created chimeras between ASIC1 a and 1b. Subsequently, to identify the exact trypsin target(s), we mutated predicted trypsin sites in the region identified by the chimera. In the second part of a project, we investigated the role of ASICs at the cellular level, in neuronal signaling. Using the whole-cell patch clamp in hippocampal neuronal culture, we studied the potential involvement of ASICs in action potential (AP) generation. In the first part of the thesis work, we showed that trypsin modifies ASIC1a function: it shifts the pH activation and the steady-state inactivation curve towards more acidic values and accelerates the time course of the channel recovery from inactivation. We also showed that trypsin cleaves ASIC1a and that the functional effect and a channel cleavage correlate. In the inactivated state, channels cannot be modified by trypsin. Cleavage occurs in a channel region that is also important for inactivation of all ASICs; a part of this region is critical for the inhibition of ASIC1 a by the spider toxin Psalmotoxin1. In the second part of the thesis work, we showed that ASIC activity can modulate AP generation. ASIC activity by itself can induce trains of APs. In situations in which this activity by itself is not sufficient to induce APs, it can contribute to AP generation. During high neuronal activity, ASIC activity can block already existing trains of APs. In conclusion, depending on the activity of neuron in a particular moment, ASICs can differently modulate AP generation; they can induce, facilitate or inhibit APs. We also showed that trypsin changes the capability of ASICs to modulate AP generation by shifting the pH dependence to more acidic values, which adapts channel gating to pH conditions which may occur in pathological conditions such as ischemia. Our finding that trypsin modifies ASIC1 a function identifies a novel pharmacological tool, and proposes a mechanism of ASIC1a regulation that may have a physiological importance. The identification of the exact site of trypsin action gives insight to the molecular mechanisms of ASIC regulation. This work proposes a role in modulation of AP generation for ASICs in the CNS. RESUME Les canaux ASIC sont les canaux ioniques activés par l'acidification rapide extracellulaire. Activés, ils génèrent un courant entrant qui inactive en présence de stimulus acide. Quatre gènes ASIC ont été clonés, ASIC1, 2, 3 et 4, avec les variants a et b pour ASIC1 et 2. Les ASICs sont exprimés dans les neurones du système nerveux central (SNC) et périphérique (SNP). Dans le SNC, les ASIC ont un rôle dans le mémoire, apprentissage et la mort neuronale dans t'ischémie. Dans le SNP, ils ont un rôle dans la perception de la douleur et méchanosensation. Dans une partie de mon projet de thèse, nous avons étudié les mécanismes de la régulation d'ASIC1a par la sérine-protéase trypsine au niveau moléculaire. La trypsine modifie la fonction d'ASIC1a et pas ASIC1b. Nous avons créé les chimères entre ASIC1 a et 1 b, afin d'identifier la région du canal responsable pour l'effet. Pour identifier le(s) site(s) exactes de l'action de la trypsine, nous avons muté les sites potentiels de la trypsine dans la région identifiée par les chimères. Dans la deuxième partie du projet, nous avons étudié le rôle des ASICs au niveau cellulaire. En utilisant la technique du patch clamp dans les cultures des neurones de l'hippocampe, nous avons étudié l'implication des ASICs dans la génération des potentiels d'action (PA). Nous avons montré que la trypsine agit sur le canal ASIC1a ; elle décale l'activation et « steady-state » inactivation vers les valeurs plus acides, et elle raccourcit le temps du « recovery » du canal. La trypsine coupe ASIC1a sur le résidu K145 et l'effet fonctionnel et la coupure corrèlent. Nous avons identifié la région du canal responsable pour l'inactivation de tous les ASICs ; une partie de cette région est responsable pour ['inhibition d'ASIC1 a par la Psalmotoxinel . Nous avons montré que les ASICs peuvent moduler la génération des PAs. L'activité des ASICs peut induire les trains des PAs. Quand l'activité des ASICs n'est pas suffisante pour induire le PA, elle peut contribuer à sa génération. Pendant l'activité neuronale forte, l'activité des ASICs peut bloquer les trains des PAs qui existent déjà. En conclusion, dépendant de l'activité neuronale, les ASICs peuvent moduler la génération des PAs différemment ; ils peuvent induire, faciliter ou inhiber les PAs. La trypsine change la capacité des ASICs de moduler les PAs. Après l'action de la trypsine, les ASICs peuvent moduler la génération des PAs dans les conditions légèrement acides, suivies par les fluctuations du pH acide, qui peuvent exister dans l'ischémie. Le fait que la trypsine agit sur ASIC1a définit l'outil pharmacologique et propose le mécanisme de la régulation d'ASICI a qui pourrait avoir l'importance physiologique. L'identification du site de l'action de la trypsine éclaircit les mécanismes moléculaires de la régulation des ASICs. Cette étude propose un rôle des ASICs dans la modulation de la génération des PAs. Résumé pour le public large Les neurones sont les cellules de système nerveux dont la fonction est la signalisation. Comme toutes les autres cellules, les neurones ont une membrane qui sépare l'intérieur du milieu extérieur. Cette membrane est imperméable pour des particules chargées (ions). Dans cette membrane existent les protéines spécifiques, « canaux », qui permettent le transport des ions d'un côté de la membrane à l'autre, comme réponse aux stimuli différents. Ce transport des ions à travers la membrane génère un courant, qu'on peut mesurer. Ce courant est la base de la communication entre les neurones, ou, ce qu'on appelle la signalisation neuronale. Quand ce courant est suffisamment grand, il permet la génération du potentiel d'action, qui est le message principal de communication neuronale. Les canaux ASIC (acid-sensing ion channel), que nous étudions dans le laboratoire, sont activés par les acides. Les acides sont relâchés dans beaucoup de situations dans le système nerveux. Les ASIC ont été découverts récemment (en 1996), et nous ne connaissons pas encore très bien toutes les fonctions de ces canaux. Nous savons qu'ils ont un rôle dans le mémoire, apprentissage, la sensation de la douleur et l'infarctus cérébral. Dans la première partie de ce projet de thèse, nous avons voulu mieux comprendre comment fonctionnent ces canaux. Pour faire ça, nous avons étudié la régulation des ASICs par une protéine, trypsine, qui coupe le canal ASIC. Nous avons étudié ou exactement la trypsine coupe le canal et quels effets ça produit sur la fonction du canal. Dans la deuxième partie du projet de thèse, nous avons voulu mieux connaître comment le canal fonctionne au niveau de la cellule, comment il interagit avec les autres canaux et si il a un rôle dans la génération des potentiels d'action. Nous avons pu montrer que la trypsine change la fonction du canal, ce qui lui permet de fonctionner différemment. Nous avons aussi déterminé ou exactement ta trypsine coupe le canal. Au niveau de la cellule, nous avons montré que les ASIC peuvent moduler la génération des potentiels d'action, étant, dépendant de l'activité du neurone, soit activateurs, soit inhibiteurs. La trypsine est une molécule qui peut être libérée dans le système nerveux pendant certaines conditions, comme l'infarctus cérébral. A cause de ça, les connaissances que la trypsine agit sur le anal ASIC pourraient être important physiologiquement. La connaissance de l'endroit exacte ou la trypsine coupe le canal nous aide à mieux comprendre la relation structure-fonction du canal. La modulation de la génération des potentiels d'actions par les ASIC indique que ces canaux peuvent avoir un rôle important dans la signalisation neuronale.