Nuovi meccanismi di regolazione dell'autoimmunit�� nella piastrinopenia immune

La Piastinopenia Immune (PTI) �� una patologia autoimmune ad eziologia ignota caratterizzata da piastrinopenia. I linfociti T regolatori (Tregs) sono coinvolti nei meccanismi di tolleranza immunologica e agiscono regolando l���attivit�� delle cellule T autoreattive e delle cellule dendritiche (DCs). Viceversa, le DCs, che esprimono Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), partecipano al mantenimento della tolleranza agli auto-antigeni attraverso l���espansione dei Tregs. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che i linfociti T helper 17 (Th17) sono coinvolti nell���autoimmunit�� e che l���espressione di Interleuchina (IL)-17 �� associata a numerose patologie autoimmuni. Il ruolo dell���interazione fra DCs e Tregs ed il ruolo dei Th17 nella patogenesi della PTI non sono mai stati studiati in maniera approfondita. Gli obiettivi principali di questa tesi sono stati: a) caratterizzare fenotipicamente e funzionalmente i linfociti Tregs e DCs; b) valutare il ruolo patogenetico dell���interazione tra Tregs e DCs; c) quantificare i Th17 circolanti. I risultati dimostrano che: 1) il numero dei Tregs circolanti dei pazienti, identificati tramite i marcatori Foxp3 e CD127, �� significativamente ridotto rispetto alla controparte normale; 2) la conversione in vitro delle cellule CD4+CD25- in linfociti Tregs (CD4+CD25+Foxp3+) dopo stimolazione con DCs mature �� significativamente ridotta nei pazienti rispetto ai controlli; 3) sia l���espressione dell���enzima IDO nelle DCs mature (mRNA) che i livelli di chinurenine prodotte (indice di attivit�� enzimatica) sono risultati significativamente ridotti nei pazienti rispetto alla controparte normale. Questi risultati suggeriscono quindi che il ridotto numero dei Tregs circolanti nei pazienti con PTI pu�� essere, almeno in parte, attribuito alla scarsa capacit�� di conversione delle DCs, in quanto tali cellule esprimono meno IDO. I risultati dimostrano inoltre che: 1) i Tregs dei pazienti con PTI hanno una capacit�� soppressoria che �� significativamente inferiore rispetto ai soggetti normali; tale dato �� stato confermato dal dosaggio di IFN-��� nel surnatante della coltura; 2) i Tregs di pazienti con PTI non sono in grado di inibire la maturazione delle DCs, a differenza di quanto avviene nei soggetti sani: infatti, l���espressione delle molecole costimolatorie CD80 e CD86 sulle DCs �� risultata invariata in seguito a cocoltura con DCs immature; 3) il dosaggio delle citochine nel surnatante delle cocolture dimostra che la concentrazione di IL-10 e IL-6 �� significativamente ridotta nei pazienti rispetto ai controlli. La scarsa abilit�� dei Tregs di inibire la maturazione delle DCs e l���alterato pattern di secrezione di citochine potrebbero quindi contribuire all��� insorgenza del fenotipo pi�� maturo delle DCs nei pazienti con PTI. I linfociti Th17 circolanti di pazienti e controlli sono stati identificati in citofluorimetria come cellule CD4+CD161+CD196+. Da tale analisi �� emerso che la frequenza dei Th17 circolanti non �� significativamente diversa nei due gruppi. Questi dati dimostrano quindi che nella PTI l���interazione bidirezionale tra Tregs e DCs risulta alterata e svolge un ruolo patogenetico, in quanto, da un lato, ci sono Tregs con un deficit numerico e funzionale e, dall���altro, DCs con maggiore capacit�� immunogenica. Il numero dei Th17 non risulta invece alterato.

Die Rolle regulatorischer T-Zellen im experimentellen allergischen Asthma

Im ersten Teil der Dissertation wurde in einem experimentellen Asthmamodell demonstriert, dass die Signaltransduktion ��ber IL-6 das Gleichgewicht zwischen Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen durch verschiedene Rezeptorkomponenten kontrolliert. Hierbei zeigte sich, dass speziell das IL-6 Trans-Signaling ��ber den sIL-6R die TH2 Cytokinproduktion steuert. Dagegen f��hrt die Blockade des mIL-6R zur Expansion regulatorischer T-Zellen mit suppressiven Eigenschaften. Diese CD4+CD25+ Tregs induzieren au��erdem IFN gamma produzierende CD4+ T-Zellen in der Lunge und verbessern daneben die AHR. Im ��berblick konnte in der vorliegenden Dissertation demonstriert werden, dass IL-6 die Balance zwischen der Funktion von Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen in der Lunge ��ber unterschiedliche Wege kontrolliert, dem sIL-6R und dem mIL-6R. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die lokale Blockade der IL-2R alpha- und IL-2R beta-Kette untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass die Blockade der IL-2R beta-Kette zur Verbesserung der AHR als auch der Rekrutierung eosinophiler Granulozyten in den Atemwegen f��hrt. Beide Blockaden f��hren zur Reduktion der TH2 Cytokine IL-4 und IL-5, wohingegen IL-13 nur nach Blockade der IL-2R beta-Kette vermindert sezerniert wird. In diesem Zusammenhang wurde auch die Rolle CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen untersucht, wobei eine Induktion dieser Population in den Lymphknoten nach Blockade der IL-2R beta-Kette nachgewiesen werden konnte. Die Blockade der IL-2R beta-Kette wirkt sich positiv auf experimentelle Asthmastudien aus und stellt somit ein m��gliches therapeutisches Potential dar, erfordert aber teilweise noch weitere Untersuchungen.

Induktion regulatorischer T-Zellen zur Inhibition allergenspezifischer Immunantworten im Mausmodell der Typ I-Allergie

Die Induktion regulatorischer T-Zellen (Treg) spielt im Zusammenhang mit der Kontrolle allergenspezifischer Reaktionen, insbesondere auch im Rahmen einer erfolgreichen Hyposensibilisierung mit hohen Allergendosen, eine zentrale Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Rekrutierung allergenspezifischer Treg daher in einem Mausmodell untersucht, in dem analog zur spezifischen Immuntherapie (SIT) die repetitive Verabreichung von hohen Antigendosen einen IgE-spezifischen Suppressionsmechanismus aktiviert, w��hrend die Injektion niedriger Antigendosen eine potente IgE-Antwort induziert. Th1-Zellen sowie konventionelle CD4+CD25+ oder CD8+CD28- Treg konnten als Vermittlerpopulationen des suppressiven Effektes in hochdosig immunisierten M��usen ausgeschlossen werden. Mittels Transferexperimenten wurden erstmals CD4-CD8- doppelt negative Treg als eine die IgE-Suppression vermittelnde Zellpopulation identifiziert. Desweiteren wurden DNA-Transferexperimente durchgef��hrt, mit dem Ziel, adaptive Treg zum Zwecke der Inhibition allergenspezifischer Immunreaktionen zu induzieren. Dazu wurden IL-10- bzw. TGF-��-kodierende Plasmide (pCMV-IL-10, pCMV-TGF-��) hergestellt und in Kombination mit einem Plasmid, welches das Modellallergen ��-Galaktosidase (��Gal) unter der Kontrolle des DC-spezifischen Fascin-Promotors (pFascin-��Gal) kodierte, M��usen mit der Genpistole appliziert. Die Expression des Modellallergens in Verbindung mit der konstitutiven Produktion von immunsuppressiven Zytokinen sollte bei den mit den transfizierten DC interagierenden antigenspezifischen T-Zellen zu einer verst��rkten Differenzierung von Treg f��hren. Die Experimente zeigten, dass die Koapplikation von IL-10-kodierenden Plasmiden eine Immunsuppression induziert, die sich in einer verminderten antigenspezifischen Antik��rperproduktion, Zytokinproduktion und CTL-Induktion zeigt, die jedoch bei nachfolgender Sensibilisierung mit ��Gal-Protein nicht aufrechterhalten werden kann. Dahingegen f��hrte die Koapplikation von TGF-��-kodierenden Plasmiden verbunden mit einer nachfolgenden Sensibilisierung zu einer leichten Inhibition der IgG1- und IgG2a-Produktion verglichen mit der Vakzinierung mit pFascin-��Gal allein. Dieser inhibitorische Effekt von pCMV-TGF-�� wurde interessanterweise nicht bereits nach der DNA-Immunisierung, sondern erst nach Sensibilisierung mit dem Protein beobachtet.

Generierung und Charakterisierung tolerogener muriner dendritischer Zellen

Mechanismen der zentralen und der peripheren Toleranz sch��tzen den K��rper vor Immunreaktionen gegen k��rpereigenes Gewebe oder gegen harmlose Umweltantigene. An der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz sind tolerogene Dendritische Zellen (DC) beteiligt. Tolerogene DC k��nnen in vitro u.a. mit Hilfe von immunsuppressiven und antiinflammatorischen Substanzen, aber auch durch virale Transduktionen, die zur Denovo- oder ��berexpression toleranzassoziierter Molek��le f��hren, generiert werden. rnDa die Wirkung einiger immunmodulatorischer Substanzen ��ber den intrazellul��ren sekund��ren Botenstoff cAMP vermittelt wird, sollte getestet werden, welchen Einfluss eine direkte Erh��hung des intrazellul��ren cAMP-Niveaus mittels Dibutyryl-cyclo-Adenosin-3��,5��-Mono-Phoshat (db-cAMP) auf die ph��notypischen und funktionellen Eigenschaften von BM-DC (���bone marrow derived dendritic cells���) hat.rnIm Vergleich zu unbehandelten BM-DC wiesen db-cAMP-DC ein vermindertes T-Zell-Stimulierungs-potenzial auf. Dieses verminderte T-Zell-Stimulierungspotenzial wird teilweise ��ber die Proteinkinase A, nicht aber ��ber Cyclooxygenase-2 (Cox-2) vermittelt. rnAnhand der FACS-Analyse mit DC- und MDSC- (���myeloid derived suppressor cells���) spezifischen Markern konnte gezeigt werden, dass es sich bei den db-cAMP-DC um CD11c-positive DC mit einer vergleichsweise niedrigen Expression von MHCII und kostimulatorischen Oberfl��chenmolek��len handelt. Des Weiteren zeigte sich, dass sie verglichen mit BM-DC eine vermehrte mRNA-Expression der koinhibitorischen Molek��le B7-H1 und LIGHT und der toleranzassoziierten Molek��le Fc��RIIB, HO-1 und Cox-2 aufweisen. Mittels ELISA konnte eine gesteigerte Expression der HO-1- und eine moderat gesteigerte PGE2-Synthese beobachtet werden. PGE2 wird mit Hilfe der Cox-2 aus Arachidons��ure gebildet.rnIm Gegensatz zu BM-DC wiesen db-cAMP-DC in beiden Reifungsstadien ein ver��ndertes Zytokinprofil auf: Auf mRNA-Ebene zeigte sich, dass db-cAMP-DC verglichen mit BM-DC vermehrt IL-1RA und IL-10 exprimieren. Dieser Unterschied konnte f��r IL-10 auch mittels ELISA best��tigt werden. In den Kultur��berst��nden der stimulierten db-cAMP-DC konnte, im Gegensatz zu denen stimulierter BM-DC, kaum bioaktives IL-12 nachgewiesen werden. rnDb-cAMP-DC induzierten des Weiteren in kokultivierten allogenen T-Zellen ein differenzielles Zytokinprofil: Sie f��rderten die INF��- und IL-17-Sezernierung durch T-Zellen, w��hrend die IL-5-Sezernierung geringer war, wenn T-Zellen mit stimulierten db-cAMP-DC kokultiviert wurden. Db-cAMP-DC hatten hingegen keinen Einfluss auf die IL-10-Produktion. Au��erdem f��hrte eine Kokultur der db-cAMP-DC mit allogenen T-Zellen nicht zu einer gesteigerten Induktion von FoxP3+ Treg. rnIn einem zweiten Ansatz sollte getestet werden ob es m��glich ist die murine DC-Linie SP37A3 lentiviral mit dem toleranzassoziierten Oberfl��chenprotein B7-H3 zu transduzieren. Dies ist von Interesse, da die SP37A3-Zellen einige Vorteile gegen��ber BM-DC aufweisen, wie z.B. ihren homogeneren Ph��notyp und die M��glichkeit sie in einer Expansionskultur zu halten.rnEs konnte gezeigt werden, dass SP37A3-Zellen als Modell f��r myeloide DC f��r die Transduktion mit lentiviralen Partikeln geeignet sind. Hierbei zeigte es sich aber, dass darauf geachtet werden muss, mit konzentriertem Virus zu arbeiten und dass die Reportergen-Expression der Zielzellen ��ber mehr als 3 Tage (mindestens 7 Tage) untersucht werden muss. Nur so kann eine eventuell auftretende Pseudotransduktion erkannt und verhindert werden. Ab einer MOI (���multiplicity of infection���) von 50 konnte in SP37A3-Zellen eine Transgen-Expression nachgewiesen werden.rn

Evaluation eines humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentz��ndung

Aus der zunehmenden Pr��valenz allergischer Erkrankungen vor allem in den Industrienationen ergibt sich ein erh��hter Bedarf an Grundlagenforschung im Bereich von Allergie und Asthma sowie der Entwicklung innovativer Therapiestrategien. In der vorliegenden Dissertation wurden die immundefizienten Mausst��mme NOD-Scid und NOD-Scid gc als vielversprechender translationaler Schritt zwischen dem reinen Tiermodell und der Erprobung neuer Therapieans��tze an Probanden in klinischen Studien beleuchtet. Im experimentellen Verlauf der Arbeit wurde ein humanisiertes Mausmodell der allergischen Atemwegsentz��ndung zun��chst in immundefizienten NOD-Scid und darauffolgend in NOD-Scid gc M��usen etabliert. Diese Mausst��mme zeichnen sich durch das Nichtvorhandensein von B- und T-Zellen aus. Im NOD-Scid gc Stamm resultiert aus einer zus��tzlichen Mutation des Gens f��r die gamma-Kette des IL-2 Rezeptors der Verlust von nat��rlichen Killerzellen (NK-Zellen), was die Immunit��t in diesem Stamm weiter herabsetzt und eine Humanisierung erleichtert. Die Humanisierung der M��use erfolgte durch die intraperitoneale Injektion von mononukle��ren Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die unter Anwendung der Ficoll-Dichtezentrifugation aus dem Blut von Probanden isoliert wurden. F��r die Gewinnung der PBMCs wurden zum einen Asthma-Patienten mit einer hochgradigen Sensibilisierung gegen Birkenpollen herangezogen. Zum anderen wurden in Kontrollexperimenten PBMCs nicht-allergischer Probanden verwendet. W��hrend sich f��r den NOD-Scid Stamm 80 Millionen PBMCs als angemessene Transferzahl erwiesen, reichten f��r die Rekonstitution des NOD-Scid gc Stammes 5 Millionen PBMCs aus. Eine Analyse der Tiere erfolgte 24 Tage nach Injektion der humanen Zellen. Der Transfer der PBMCs allergischer Asthmatiker f��hrte besonders nach additiver Applikation des Birkenallergens sowie des humanen rekombinanten Zytokins IL-4 und darauffolgender nasaler allergener Provokation zu einer starken pulmonalen Entz��ndung in den M��usen. Die nasale Allergenprovokation an den Tagen 20-22 nach PBMC-Transfer erwies sich f��r das Aufkommen der Inflammation als unbedingt erforderlich. Die nasale Provokation mit Phosphat-gepufferter Salzl��sung (PBS) m��ndete in einer herabgesetzten Inflammation ohne Auspr��gung einer Atemwegs��berempfindlichkeit (AHR), reduzierten Zellzahlen in der bronchoalveol��ren Lavage (BAL) sowie verminderten Frequenzen humaner Zellen in den Lungen von Versuchstieren, die mit atopischen PBMCs supplementiert mit Birkenallergen und IL-4 rekonstituiert wurden. Die Allergenabh��ngigkeit des etablierten Modells wurde anhand von Experimenten untermauert, die verdeutlichten, dass ein Transfer von PBMCs nicht-allergischer Probanden trotz Zugabe des Allergens und humanem IL-4 keine Atemwegsinflammation ausl��ste. Bei den humanen Zellen, die an Tag 24 nach Rekonstitution in den M��usen detektiert werden konnten, handelte es sich haupts��chlich um T-Zellen. Innerhalb dieser CD3+ T-Zellen konnten CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert werden. Depletionsexperimente, in denen nach Gewinnung der PBMCs aus dem Blut der Probanden verschiedene T-Zellsubpopulationen (CD3+, CD4+, CD8+) eliminiert wurden, f��hrten zu dem Befund, dass die allergische Atemwegsentz��ndung in dem System von humanen CD4+ T-Zellen abh��ngig war. Nach der Etablierung des humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentz��ndung wurde das System zur Analyse des suppressionsf��rdernden Potentials des HIV-1 - H��llproteins gp120 genutzt. Die Applikation von gp120 f��hrte zu einer Reduktion der Atemwegsinflammation. Dies ��u��erte sich in einer Aufhebung der AHR, verminderten Zellzahlen in der BAL sowie dem reduzierten Einstrom humaner T-Zellen in die Lungen der rekonstituierten Tiere. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die anti-inflammatorische Wirkung des gp120 strikt von der Anwesenheit regulatorischer T-Zellen (Tregs) innerhalb der f��r die Humanisierung genutzten PBMCs abh��ngig war. Eine Depletion der Tregs vor Transfer in die M��use f��hrte zum Verlust der anti-inflammatorischen Effekte des gp120. Diese Ergebnisse sprechen f��r die Modulation regulatorischer T-Zellen als hoffnungsvolle Ma��nahme in der Behandlung allergischer Erkrankungen. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse er��ffnen innovative Ans��tze zur Analyse neuer Therapiestrategien in einem Testsystem, dass die Erforschung humaner Zellinteraktionen sowie die Wirkung potentieller Arzneistoffe auf humane Zellen unter in vivo Bedingungen erlaubt.

Funktionelle Charakterisierung der Casein Kinase 2 in der Etablierung und Aufrechterhaltung peripherer Toleranz durch dendritische Zellen

Dendritische Zellen (DCs) nehmen eine Schl��sselrolle in unserem Immunsystem ein, indem DCs sowohl Immunit��t, als auch Toleranz induzieren k��nnen. Im Falle der Immunit��t sind DCs in der Lage die Differenzierung der verschiedenen T-Helferzellen, wie Th1-, Th2- und Th17-Zellen zu steuern und tragen so zu der Qualit��t einer Immunantwort bei. Auf der anderen Seite k��nnen DCs in Gegenwart von TGF-��, IDO und Retins��ure die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen induzieren und tragen somit zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz bei. Insbesondere in den Darm-assoziierten lymphatischen Geweben (GALT) m��ssen DCs unverh��ltnism����ige Immunantworten gegen harmlose Antigene aus der Nahrung und kommensale Bakterien verhindern, w��hrend gegen Pathogene sch��tzende Immunantworten induziert werden m��ssen. Auf Grund dieser entgegengesetzten Funktionen der DCs wollten wir die molekularen Mechanismen der DCs untersuchen, die der Regulation von Immunit��t und Toleranz zu Grunde liegen. Insbesondere der Wnt-Signalweg ist f��r die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz im GALT von Bedeutung. Da die Casein Kinase 2 in diesem Signalweg entscheidend beteiligt ist, haben wir die CK2-Funktion konditionell, unter der Kontrolle des CD11c-Promotors, deletiert. Hierf��r haben wir CD11c-cre M��use mit M��usen verpaart, welche ein von loxP-Signalsequenzen flankiertes Ck2�� Gen (CK2��-fl/fl) tragen. Die konditionelle Deletion der CK2-Funktion in DCs, f��hrte zu einer verst��rkten Expression der kostimulatorischen Molek��le (wie CD40, CD80, CD86) und der Zytokine IL-6 und IL-12 unter ���steady-state��� Bedingungen. Detaillierte Untersuchungen der T-Zellen in CD11c-cre x CK2��-fl/fl M��usen zeigte eine deutlich reduzierte naive T-Zellpopulation, einhergehend mit einer erh��hten Th1- und Th17-Differenzierung. Speziell in den mesenterialen Lymphknoten konnte eine h��here Frequenz von T-bet+ und Ror��t+ CD4+ T-Zellen gefunden werden, welche gro��e Mengen der Zytokine IFN-�� und IL-17 nach ex vivo Stimulation produzierten. Weiterf��hrende in vivo Versuche, hier wurde das Modell der oralen Toleranz gew��hlt, zeigten das eine CK2-Deletion in DCs die Induktion einer oralen Toleranz verhindert. Unsere Daten zeigen eindeutig, dass die CK2 entscheidend in der Regulation der DC Hom��ostase und der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz beteiligt ist.

Regulatory T cell-mediated suppression of Th9 cell development and effector function

T helper (Th) 9 cells are an important subpopulation of the CD4+ T helper cells. Due to their ability to secrete Interleukin-(IL-)9, Th9 cells essentially contribute to the expulsion of parasitic helminths from the intestinal tract but they play also an immunopathological role in the course of asthma. Recently, a beneficial function of Th9 cells in anti-tumor immune responses was published. In a murine melanoma tumor model Th9 cells were shown to enhance the anti-melanoma immune response via the recruitment of CD8+ T cells, dendritic cells and mast cells. In contrast to Th9 effector cells regulatory T cells (Tregs) are able to control an immune response with the aid of different suppressive mechanisms. Based on their ability to suppress an immune response Tregs are believed to be beneficial in asthma by diminishing excessive allergic reactions. However, concerning cancer they can have a detrimental function because Tregs inhibit an effective anti-tumor immune reaction. Thus, the analysis of Th9 suppression by Tregs is of central importance concerning the development of therapeutic strategies for the treatment of cancer and allergic diseases and was therefore the main objective of this PhD thesis.rnIn general it could be demonstrated that the development of Th9 cells can be inhibited by Tregs in vitro. The production of the lineage-specific cytokine IL-9 by developing Th9 cells was completely suppressed at a Treg/Th9 ratio of 1:1 on the transcriptional (qRT-PCR) as well as on the translational level (ELISA). In contrast, the expression of IRF4 that was found to strongly promote Th9 development was not reduced in the presence of Tregs, suggesting that IRF4 requires additional transcription factors to induce the differentiation of Th9 cells. In order to identify such factors, which regulate Th9 development and therefore represent potential targets for Treg-mediated suppressive mechanisms, a transcriptome analysis using ���next-generation sequencing��� was performed. The expression of some genes which were found to be up- or downregulated in Th9 cells in the presence of Tregs was validated with qRT-PCR. Time limitations prevented a detailed functional analysis of these candidate genes. Nevertheless, the analysis of the suppressive mechanisms revealed that Tregs probably suppress Th9 cells via the increase of the intracellular cAMP concentration. In contrast, IL-9 production by differentiated Th9 cells was only marginally affected by Tregs in vitro and in vivo analysis (asthma, melanoma model). Hence, Tregs represent very effective inhibitors of Th9 development whereas they have only a minimal suppressive influence on differentiated Th9 cells.rn

Evaluation zellul��rer Mechanismen der allergen-spezifischen Immuntherapie in einem chronischen Modell der allergischen Atemwegsentz��ndung

Klinische Studien haben gezeigt, dass die allergenspezifische Immuntherapie (SIT) eine effektive Therapieoption f��r allergische Erkrankungen ist. Obwohl dieses Therapieverfahren seit ��ber 100 Jahren existiert, sind die zugrunde liegenden Suppressionsmechanismen jedoch nicht vollst��ndig verstanden. Bisher wird angenommen, dass der Behandlungserfolg der SIT auf einer Blockade durch allergenspezifische Antik��rper, einer Verschiebung des Th1-Th2-Gleichgewichtes und/oder auf einer Suppression durch regulatorische T-Zellen (Tregs) basiert. Um die Effekte der SIT in einer chronischen Erkrankung in vivo untersuchen zu k��nnen, wurde in dieser Doktorarbeit ein Mausmodell f��r chronisches Asthma entwickelt, das die Situation im Menschen nach einer SIT nachahmt. rnDurch eine SIT war es m��glich, allergeninduzierte Asthmasymptome wie Atemwegshyperreagibilit��t (AHR), Eosinophilie in der Lunge, IgE-Produktion und Atemwegsentz��ndung im Modell zu unterdr��cken. Bemerkenswert ist, dass durch OVA-spezifische Immuntherapie (OVA-IT) ebenfalls eine Verringerung der strukturellen Ver��nderungen im Lungengewebe im chronischen Krankheitsverlauf erreicht wurde.rnDes Weiteren wurde in diesem Modell nach den Prozessen gesucht, die f��r die toleranzinduzierende Wirkung der SIT verantwortlich sein k��nnen. Dabei wurde im Vergleich zur Placebo-behandelten Gruppe eine erh��hte Antwort spezifischer IgG1-Antik��rper, eine verst��rkte Th1-Antwort, sowie eine erh��hte Frequenz von FoxP3+ Tregs und von IL-10-produzierenden T-Zellen (Tr1-Zellen) nach OVA-IT festge-stellt. Zur weiteren Untersuchung der von SIT-induzierten T-Zellantworten wurden Mausmodelle des allergischen Asthmas mit einem akuten Verlauf gew��hlt.rnDie Bedeutung der Th1-Zellen f��r die SIT wurde in T-bet-/- M��usen untersucht, welche aufgrund des Fehlens des Transkriptionsfaktors T-bet keine stabile Th1-Antwort induzieren k��nnen. Durch SIT war es m��glich, allergeninduzierte Asthmasymptome wie AHR, eosinophile Granulozyten in der Lunge, IgE-Produktion und Atemwegsentz��ndung in den T-bet-/- Tieren im gleichen Ma��e wie in den Wildtyptieren zu unterdr��cken. Diese Untersuchung zeigte, dass die SIT auch ohne funktionelle Th1-Zellen die allergische Entz��ndung unterdr��cken kann. rnDie Rolle der Tregs f��r die SIT wurde in DO11.10 M��usen und DO11.10 RAG-/- M��usen untersucht. In beiden St��mmen konnte nach SIT eine Induktion OVA-spezifischer Tregs nachgewiesen werden. In DO11.10 RAG-/- M��usen k��nnen durch den Knockout im rag2-Gen keine nat��rlichen, d.h. im Thymus gereiften, Tregs entstehen. Im Blut von DO11.10 RAG-/- M��usen war direkt nach Durchf��hrung der OVA-IT eine FoxP3+ Treg-Population detektierbar. Demnach wird durch die OVA-IT eine de-novo-Induktion von FoxP3+ Tregs in Gang gesetzt. In Abwesenheit der nat��rlichen Tregs zeigte sich weiterhin, dass diese Zellen zur Produktion von IL-10 in T-Zellen und somit zum Erfolg der SIT beitragen.rnDie Rolle der FoxP3+ Tregs bei der SIT wurde in DEREG M��usen untersucht. Eine Depletion der FoxP3+ Tregs in DEREG M��usen w��hrend der Durchf��hrung der OVA-IT hob die protektiven Effekte der Therapie jedoch nur teilweise auf. rnUm die Rolle des regulatorischen Zytokins IL-10 bei der SIT zu untersuchen, wurde ein blockierender Antik��rper gegen den IL-10-Rezeptor (anti-IL-10R) im chronischen Modell des allergischen Asthmas mit SIT angewendet. Anti-IL-10R hob die protektive Wirkung der SIT auf die AHR, die Atemwegsentz��ndung und die strukturellen Ver��nderungen im Lungengewebe auf. Somit ist die protektive Wirkung der SIT abh��ngig vom IL-10-Signalweg.rnZusammenfassend stellt diese Arbeit die Bedeutung der SIT f��r allergische Erkrankungen heraus. SIT kann durch die positive Beeinflussung der allergiebedingten, strukturellen Ver��nderungen in der Lunge auch f��r Asthmapatienten gro��e Vorteile bringen. Die aus Studien bekannten Mechanismen konnten im Modell best��tigt werden und wurden im weiteren Verlauf untersucht. Die Arbeit stellt im Besonderen die Bedeutung der IL-10-produzierenden und FoxP3+ Tregs f��r die Effektivit��t der SIT in den Vordergrund. Zudem ist durch die Etablierung eines neuen Mausmodells der SIT f��r chronisches allergisches Asthma ein Mittel zur weiteren Erforschung der zugrunde liegenden Prozesse dieser erfolgreichen Therapie geschaffen worden. rn

The continuum of intestinal CD4+ T cell adaptations in host-microbial mutualism

How a mutualistic relationship between the intestinal microbiota and intestinal T cell compartments is established is important, as a breakdown of intestinal T cell homeostasis may cause inflammatory bowel diseases. A number of studies have shown that different bacterial species modulate the intestinal CD4+ T cell compartment in different ways. We performed mechanistic in vivo studies that demonstrated the crucial requirement for regulatory T cells (Treg) and interleukin-10 (IL-10) in the induction of intestinal T cell homeostasis even following colonization with a completely benign microbiota. In the absence of a functional Treg response or IL-10 receptor signaling, the same bacteria that induced a Treg response in wild-type animals now induced T helper type 17 responses, without intestinal inflammation. Therefore, Treg, IL-10 and Th17 are crucial regulatory mechanisms in the intestine not only for controlling inflammation, but also to establish a continuum of CD4+ T cell homeostasis upon commensal colonization.

The transcription factor IFN regulatory factor-4 controls experimental colitis in mice via T cell-derived IL-6

The proinflammatory cytokine IL-6 seems to have an important role in the intestinal inflammation that characterizes inflammatory bowel diseases (IBDs) such as Crohn disease and ulcerative colitis. However, little is known about the molecular mechanisms regulating IL-6 production in IBD. Here, we assessed the role of the transcriptional regulator IFN regulatory factor-4 (IRF4) in this process. Patients with either Crohn disease or ulcerative colitis exhibited increased IRF4 expression in lamina propria CD3+ T cells as compared with control patients. Consistent with IRF4 having a regulatory function in T cells, in a mouse model of IBD whereby colitis is induced in RAG-deficient mice by transplantation with CD4+CD45RB(hi) T cells, adoptive transfer of wild-type but not IRF4-deficient T cells resulted in severe colitis. Furthermore, IRF4-deficient mice were protected from T cell-dependent chronic intestinal inflammation in trinitrobenzene sulfonic acid- and oxazolone-induced colitis. In addition, IRF4-deficient mice with induced colitis had reduced mucosal IL-6 production, and IRF4 was required for IL-6 production by mucosal CD90+ T cells, which it protected from apoptosis. Finally, the protective effect of IRF4 deficiency could be abrogated by systemic administration of either recombinant IL-6 or a combination of soluble IL-6 receptor (sIL-6R) plus IL-6 (hyper-IL-6). Taken together, our data identify IRF4 as a key regulator of mucosal IL-6 production in T cell-dependent experimental colitis and suggest that IRF4 might provide a therapeutic target for IBDs.

Evaluation of histological, serological and clinical changes in response to abatacept treatment of primary Sj��gren's syndrome: A pilot study

Objectives To prospectively evaluate histopathologic, blood cellular, serological and clinical changes in response to abatacept treatment in patients with primary Sj��gren's syndrome (pSS). Methods Blood, saliva and minor salivary gland biopsies were obtained before and after the last of 8 doses of abatacept in 11 pSS patients. The histologic data evaluated the number of lymphocytic foci and of B- and T-cell subtypes (CD20(+) , CD3(+) , CD4(+) , CD8(+) ). The numbers of FoxP3(+) regulatory T-cells were measured and the FoxP3 /CD 3 ratio was calculated. Histologic data were compared with results from peripheral blood and with changes in saliva secretion. Results The numbers of lymphocytic foci decreased significantly (p=0.041). Numbers of local FoxP3(+) T-cells decreased significantly in percentage of total lymphocytic infiltrates (p=0.037). In the peripheral blood B-cells increased (p=0.038). This was due to an expansion of the na��ve B cell pool (p=0.034). When adjusting for disease duration, an increase was also noted for total lymphocytes (p=0.044) and for CD 4 cells (p=0.009). Gamma globulins decreased significantly (p=0.005), but IgG reduction did not reach significance. Adjusted for disease duration, saliva production increased significantly (p=0.029). Conclusions CTLA4-Ig treatment significantly reduces glandular inflammation in pSS, induces several celluar changes and increases saliva production. Remarkably, this increase in saliva production is significantly influenced by disease duration.

IL-21 restricts virus-driven Treg cell expansion in chronic LCMV infection

Foxp3+ regulatory T (Treg) cells are essential for the maintenance of immune homeostasis and tolerance. During viral infections, Treg cells can limit the immunopathology resulting from excessive inflammation, yet potentially inhibit effective antiviral T cell responses and promote virus persistence. We report here that the fast-replicating LCMV strain Docile triggers a massive expansion of the Treg population that directly correlates with the size of the virus inoculum and its tendency to establish a chronic, persistent infection. This Treg cell proliferation was greatly enhanced in IL-21R-/- mice and depletion of Treg cells partially rescued defective CD8+ T cell cytokine responses and improved viral clearance in some but not all organs. Notably, IL-21 inhibited Treg cell expansion in a cell intrinsic manner. Moreover, experimental augmentation of Treg cells driven by injection of IL-2/anti-IL-2 immune complexes drastically impaired the functionality of the antiviral T cell response and impeded virus clearance. As a consequence, mice became highly susceptible to chronic infection following exposure to low virus doses. These findings reveal virus-driven Treg cell proliferation as potential evasion strategy that facilitates T cell exhaustion and virus persistence. Furthermore, they suggest that besides its primary function as a direct survival signal for antiviral CD8+ T cells during chronic infections, IL-21 may also indirectly promote CD8+ T cell poly-functionality by restricting the suppressive activity of infection-induced Treg cells.

High expression of FOXP3 in primary melanoma is associated with tumour progression.

BACKGROUND The antitumour immune response plays an important role in the prognosis of melanoma. High numbers of circulating regulatory T cells have been associated with rapid disease progression. OBJECTIVES To assess the influence of forkhead box protein (FOXP)3, CD1a and langerin expression on the prognosis of primary melanoma. METHODS We analysed 185 primary melanomas by immunohistochemical staining for expression of the regulatory T-cell marker FOXP3 and the dendritic cell markers langerin and CD1a, and correlated marker expression with clinical outcome. RESULTS Disease-free survival and overall survival were significantly longer in patients expressing low levels of FOXP3 in the primary melanoma, whereas they were associated with high expression of CD1a. The negative prognostic value of FOXP3 expression was independent of the Breslow tumour thickness. Langerin expression did not correlate with the clinical outcome. CONCLUSIONS High expression of FOXP3 in the primary melanoma may be used as an additional independent prognostic marker for early tumour progression in patients with melanoma.

Increased FOXP3 expression in tumour-associated tissues of horses affected with equine sarcoid disease.

Recent studies suggest that regulatory T cells (Tregs) are associated with disease severity and progression in papilloma virus induced neoplasia. Bovine papilloma virus (BPV) is recognised as the most important aetiological factor in equine sarcoid (ES) disease. The aim of this study was to compare expression levels of Treg markers and associated cytokines in tissue samples of ES-affected equids with skin samples of healthy control horses. Eleven ES-affected, and 12 healthy horses were included in the study. Expression levels of forkhead box protein 3 (FOXP3), interleukin 10 (IL10), interleukin 4 (IL4) and interferon gamma (IFNG) mRNA in lesional and tumour-distant samples from ES-affected horses, as well as in dermal samples of healthy control horses were measured using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (PCR). Expression levels were compared between lesional and tumour-distant as well as between tumour-distant and control samples. Furthermore, BPV-1 E5 DNA in samples of ES-affected horses was quantified using quantitative PCR, and possible associations of viral load, disease severity and gene expression levels were evaluated. Expression levels of FOXP3, IL10 and IFNG mRNA and BPV-1 E5 copy numbers were significantly increased in lesional compared to tumour-distant samples. There was no difference in FOXP3 and cytokine expression in tumour-distant samples from ES- compared with control horses. In tumour-distant samples viral load was positively correlated with IL10 expression and severity score. The increased expression of Treg markers in tumour-associated tissues of ES-affected equids indicates a local, Treg-induced immune suppression.

Kinetics of T cell receptor ��, ��, and �� rearrangements during adult thymic development: T cell receptor rearrangements are present in CD44+CD25+ Pro-T thymocytes

We performed a comprehensive analysis of T cell receptor (TCR) �� rearrangements in T cell precursors of the mouse adult thymus. Using a sensitive quantitative PCR method, we show that TCR�� rearrangements are present in CD44+CD25+ Pro-T thymocytes much earlier than expected. TCR�� rearrangements increase significantly from the Pro-T to the CD44���CD25+ Pre-T cell transition, and follow different patterns depending on each V�� gene segment, suggesting that ordered waves of TCR�� rearrangement exist in the adult mouse thymus as has been described in the fetal mouse thymus. Recombinations of TCR�� genes occur concurrently with TCR�� and D-J�� rearrangements, but before V�� gene assembly. Productive TCR�� rearrangements do not increase significantly before the Pre-T cell stage and are depleted in CD4+CD8+ double-positive cells from normal mice. In contrast, double-positive thymocytes from TCR�����/��� mice display random proportions of TCR�� rearranged alleles, supporting a role for functional TCR��/�� rearrangements in the ���� divergence process.