Investiga����o de elementos de transposi����o em popula����es de Drosophila mojavensis e D. arizonae e seus h��bridos

Coordena����o de Aperfei��oamento de Pessoal de N��vel Superior (CAPES)

The putative Leishmania telomerase RNA (leishTER) undergoes trans-splicing and contains a conserved template sequence

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Surface characterization and osteoblast-like cells culture on collagen modified PLDLA scaffolds

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Double-Stranded RNA-Activated Protein Kinase Is a Key Modulator of Insulin Sensitivity in Physiological Conditions and in Obesity in Mice

The molecular integration of nutrient-and pathogen-sensing pathways has become of great interest in understanding the mechanisms of insulin resistance in obesity. The double-stranded RNA-dependent protein kinase (PKR) is one candidate molecule that may provide cross talk between inflammatory and metabolic signaling. The present study was performed to determine, first, the role of PKR in modulating insulin action and glucose metabolism in physiological situations, and second, the role of PKR in insulin resistance in obese mice. We used Pkr(-/-) and Pkr(+/+) mice to investigate the role of PKR in modulating insulin sensitivity, glucose metabolism, and insulin signaling in liver, muscle, and adipose tissue in response to a high-fat diet. Our data show that in lean Pkr(-/-) mice, there is an improvement in insulin sensitivity, and in glucose tolerance, and a reduction in fasting blood glucose, probably related to a decrease in protein phosphatase 2A activity and a parallel increase in insulin-induced thymoma viral oncogene-1 (Akt) phosphorylation. PKR is activated in tissues of obese mice and can induce insulin resistance by directly binding to and inducing insulin receptor substrate (IRS)-1 serine307 phosphorylation or indirectly through modulation of c-Jun N-terminal kinase and inhibitor of kappa B kinase beta. Pkr(-/-) mice were protected from high-fat diet-induced insulin resistance and glucose intolerance and showed improved insulin signaling associated with a reduction in c-Jun N-terminal kinase and inhibitor of kappa B kinase beta phosphorylation in insulin-sensitive tissues. PKR may have a role in insulin sensitivity under normal physiological conditions, probably by modulating protein phosphatase 2A activity and serine-threonine kinase phosphorylation, and certainly, this kinase may represent a central mechanism for the integration of pathogen response and innate immunity with insulin action and metabolic pathways that are critical in obesity. (Endocrinology 153:5261-5274, 2012)

RNA Interference of Endochitinases in the Sugarcane Endophyte Trichoderma virens 223 Reduces Its Fitness as a Biocontrol Agent of Pineapple Disease

The sugarcane root endophyte Trichoderma virens 223 holds enormous potential as a sustainable alternative to chemical pesticides in the control of sugarcane diseases. Its efficacy as a biocontrol agent is thought to be associated with its production of chitinase enzymes, including N-acetyl-beta-D-glucosaminidases, chitobiosidases and endochitinases. We used targeted gene deletion and RNA-dependent gene silencing strategies to disrupt N-acetyl-beta-D-glucosaminidase and endochitinase activities of the fungus, and to determine their roles in the biocontrol of soil-borne plant pathogens. The loss of N-acetyl-beta-D-glucosaminidase activities was dispensable for biocontrol of the plurivorous damping-off pathogens Rhizoctonia solani and Sclerotinia sclerotiorum, and of the sugarcane pathogen Ceratocystis paradoxa, the causal agent of pineapple disease. Similarly, suppression of endochitinase activities had no effect on R. solani and S. sclerotiorum disease control, but had a pronounced effect on the ability of T. virens 223 to control pineapple disease. Our work demonstrates a critical requirement for T. virens 223 endochitinase activity in the biocontrol of C. paradoxa sugarcane disease, but not for general antagonism of other soil pathogens. This may reflect its lifestyle as a sugarcane root endophyte.

Regulation of neurogenesis and gliogenesis of retinoic acid-induced P19 embryonal carcinoma cells by P2X2 and P2X7 receptors studied by RNA interference

Embryonic carcinoma cells are widely used models for studying the mechanisms of proliferation and differentiation occurring during early embryogenesis. We have now investigated how down-regulation of P2X2 and P2X7 receptor expression by RNA interference (RNAi) affects neural differentiation and phenotype specification of P19 embryonal carcinoma cells. Wild-type P19 embryonal carcinoma cells or cells stably expressing shRNAs targeting P2X2 or P2X7 receptor expression were induced to differentiate into neurons and glial cells in the presence of retinoic acid. Silencing of P2X2 receptor expression along differentiation promoted cell proliferation and an increase in the percentage of cells expressing glial-specific GFAP, while the presence of beta-3 tubulin-positive cells diminished at the same time. Proliferation induction in the presence of stable anti-P2X2 receptor RNAi points at a mechanism where glial proliferation is favored over growth arrest of progenitor cells which would allow neuronal maturation. Differently from the P2X2 receptor, inhibition of P2X7 receptor expression during neural differentiation of P19 cells resulted in a decrease in cell proliferation and GFAP expression, suggesting the need of functional P2X7 receptors for the progress of gliogenesis. The results obtained in this study indicate the importance of purinergic signaling for cell fate determination during neural differentiation, with P2X2 and P2X7 receptors promoting neurogenesis and gliogenesis, respectively. The shRNAs down-regulating P2X2 or P2X7 receptor gene expression, developed during this work, present useful tools for studying mechanisms of neural differentiation in other stem cell models. (C) 2012 ISDN. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.

Antigen-presenting cells transfected with Hsp65 messenger RNA fail to treat experimental tuberculosis

In the last several years, the use of dendritic cells has been studied as a therapeutic strategy against tumors. Dendritic cells can be pulsed with peptides or full-length protein, or they can be transfected with DNA or RNA. However, comparative studies suggest that transfecting dendritic cells with messenger RNA (mRNA) is superior to other antigen-loading techniques in generating immunocompetent dendritic cells. In the present study, we evaluated a new therapeutic strategy to fight tuberculosis using dendritic cells and macrophages transfected with Hsp65 mRNA. First, we demonstrated that antigen-presenting cells transfected with Hsp65 mRNA exhibit a higher level of expression of co-stimulatory molecules, suggesting that Hsp65 mRNA has immunostimulatory properties. We also demonstrated that spleen cells obtained from animals immunized with mock and Hsp65 mRNA-transfected dendritic cells were able to generate a mixed Th1/Th2 response with production not only of IFN-γ but also of IL-5 and IL-10. In contrast, cells recovered from mice immunized with Hsp65 mRNA-transfected macrophages were able to produce only IL-5. When mice were infected with Mycobacterium tuberculosis and treated with antigen-presenting cells transfected with Hsp65 mRNA (therapeutic immunization), we did not detect any decrease in the lung bacterial load or any preservation of the lung parenchyma, indicating the inability of transfected cells to confer curative effects against tuberculosis. In spite of the lack of therapeutic efficacy, this study reports for the first time the use of antigen-presenting cells transfected with mRNA in experimental tuberculosis.

Porous Polymeric Bioresorbable Scaffolds for Tissue Engineering

Tissue engineering is a discipline that aims at regenerating damaged biological tissues by using a cell-construct engineered in vitro made of cells grown into a porous 3D scaffold. The role of the scaffold is to guide cell growth and differentiation by acting as a bioresorbable temporary substrate that will be eventually replaced by new tissue produced by cells. As a matter or fact, the obtainment of a successful engineered tissue requires a multidisciplinary approach that must integrate the basic principles of biology, engineering and material science. The present Ph.D. thesis aimed at developing and characterizing innovative polymeric bioresorbable scaffolds made of hydrolysable polyesters. The potentialities of both commercial polyesters (i.e. poly-e-caprolactone, polylactide and some lactide copolymers) and of non-commercial polyesters (i.e. poly-w-pentadecalactone and some of its copolymers) were explored and discussed. Two techniques were employed to fabricate scaffolds: supercritical carbon dioxide (scCO2) foaming and electrospinning (ES). The former is a powerful technology that enables to produce 3D microporous foams by avoiding the use of solvents that can be toxic to mammalian cells. The scCO2 process, which is commonly applied to amorphous polymers, was successfully modified to foam a highly crystalline poly(w-pentadecalactone-co-e-caprolactone) copolymer and the effect of process parameters on scaffold morphology and thermo-mechanical properties was investigated. In the course of the present research activity, sub-micrometric fibrous non-woven meshes were produced using ES technology. Electrospun materials are considered highly promising scaffolds because they resemble the 3D organization of native extra cellular matrix. A careful control of process parameters allowed to fabricate defect-free fibres with diameters ranging from hundreds of nanometers to several microns, having either smooth or porous surface. Moreover, versatility of ES technology enabled to produce electrospun scaffolds from different polyesters as well as ���composite��� non-woven meshes by concomitantly electrospinning different fibres in terms of both fibre morphology and polymer material. The 3D-architecture of the electrospun scaffolds fabricated in this research was controlled in terms of mutual fibre orientation by properly modifying the instrumental apparatus. This aspect is particularly interesting since the micro/nano-architecture of the scaffold is known to affect cell behaviour. Since last generation scaffolds are expected to induce specific cell response, the present research activity also explored the possibility to produce electrospun scaffolds bioactive towards cells. Bio-functionalized substrates were obtained by loading polymer fibres with growth factors (i.e. biomolecules that elicit specific cell behaviour) and it was demonstrated that, despite the high voltages applied during electrospinning, the growth factor retains its biological activity once released from the fibres upon contact with cell culture medium. A second fuctionalization approach aiming, at a final stage, at controlling cell adhesion on electrospun scaffolds, consisted in covering fibre surface with highly hydrophilic polymer brushes of glycerol monomethacrylate synthesized by Atom Transfer Radical Polymerization. Future investigations are going to exploit the hydroxyl groups of the polymer brushes for functionalizing the fibre surface with desired biomolecules. Electrospun scaffolds were employed in cell culture experiments performed in collaboration with biochemical laboratories aimed at evaluating the biocompatibility of new electrospun polymers and at investigating the effect of fibre orientation on cell behaviour. Moreover, at a preliminary stage, electrospun scaffolds were also cultured with tumour mammalian cells for developing in vitro tumour models aimed at better understanding the role of natural ECM on tumour malignity in vivo.

Synthese und radioaktive Markierung potentieller PET- bzw. SPECT-Liganden zur Quantifizierung und Visualisierung der pankreatischen beta-Zell-Masse

Abstract Due to the ongoing efforts in transplanting b-cell mass there is also a great medical interest in specific b-cell imaging agents to quantify the acceptance of transplanted islets in humans in vivo. Additionally, in the context of type 1 diabetes mellitus the chronic and progressive loss of b-cells caused by autoimmune destruction has led to concerted efforts to prevent further loss of b-cells by autoantigen-specific immunotherapy of pre-diabetic patients. nateglinide and glibenclamide are SUR1 ligands used to stimulate insulin secretion in type 2 diabetic patients. They bind to a class of molecules known as the ATP-sensitive potassium channels, located on the insulin producing b-cells of the islets of Langerhans and are therefore excellent candidates as b-cell specific tracers. To obtain a precursor for a direct labelling of nateglinide with [18F]fluoride, the aromatic system of the phenylalanine structure element was derivatised to obtain a phenolic OH-group in 4-position which is capable of further derivatisation. The formed phenylether N-(trans-4-isopropylcyclohexanecarbonyl)-O-(2-hydroxyethyl)-D-tyrosin benzylester was tried to be tosylated according to several literature procedures but none of them was applicable. The catalytic influence of ytterbium(III)triflate in the reaction of toluenesulfonic acid anhydride and the alcohol was investigated. It was found that Yb(III) facilitates the tosylation of the alcohol under non-basic conditions and was extended to the tosylation of a great variety of different alcohols to prove its applicability in general. The radioactive labelling of N-(trans-4-isopropyl-cyclohexanecarbonyl)-O-(2-[18F]fluoroethyl)-D-tyrosine with [18F]F-/ Kryptofix�� 222/ K2CO3-system was achieved in radiochemical yields (RCY) of 10 % after deprotection with Pd/ C and H2. In addition to the direct labelling approach, a labelling procedure applying 2[18F]fluoroethyltosylate and N-(trans-4-isopropyl-cyclohexanecarbonyl)-D-tyrosin was performed in 40 % RCY. Unfortunately the determination of the KD value of N-(trans-4-isopropylcyclohexanecarbonyl)-O-(2-fluoroethyl)-D-tyrosine revealed a significant decrease in affinity compared to original nateglinide. The in vivo evaluation of some 18F-labelled glibenclamide derivatives in humans and animals revealed that longer measuring times are warranted because a high liver uptake spoiles the data acquisition and the activity washout proceeds very slowly. Therefore glibenclamide was labelled with a radioisotope with a longer half life such as 99mTc (t1/2 = 6 h) to lengthen the possible time frame for image acquisition. The synthesis of a 99mTc labelled hydrophilic glibenclamide derivative was performed. It is hoped that gliben-clamide is internalised into the b-cell and there binds to the 95 % of intracellular SUR-1 receptors with eventual metablolisation and thus trapping in the cell. The KD-value of the corresponding Re-compound was determined to be 0.5 nM and the insulin secretion properties were similar to those of original glibenclamide. The labelling precursor N-{4-[N,N-bis-(carboxy-methyl)-aminoethyl)-5-chlorobenzene-carboxamido]-ethyl}-benzene-sulfonyl-N'-cyclohexyl urea tris sodium salt was reacted with [99mTc(I)(OH2)3(CO)3] Cl to yield the final N-{4-[99mTc(I)-tricarbonyl-N,N-bis-(carboxymethyl)-aminoethyl)-5-chloro-benzene-carboxamidoethyl]-benzene-sulfonyl}-N'-cyclo-hexyl-urea sodium salt in 70% RCY.

Glycopeptidliganden von Zelladh��sionsrezeptoren mit sulfatierter Arabino-Lewis a-Struktur

Selektine sind eine Gruppe von Transmembranglycoproteinen, welche als Adh��sionsmolek��le innerhalb des vaskul��ren Systems Zelladh��sionsprozesse zwischen Leukozyten und Endothelzellen vermitteln. Das Sialyl-Lewisa Epitop und verwandte Kohlenhydratstrukturen wurden als Liganden der E- und P-Selektine identifiziert. Durch die chemische Synthese verwandter Strukturen verspricht man sich, die im Laufe inflammatorischer Prozesse exprimierten Rezeptoren gezielt blockieren zu k��nnen und dadurch pathologische Abl��ufe wie h��matogene Metastasierungen oder Absto��ungsreaktionen zu bek��mpfen. Einige Bereiche der Aminos��uresequenz des E-Selektin-Ligand-1 (ESL-1) treten hochkonservativ auch in anderen Selektinliganden wie MG160 oder PSGL-1 auf und wurden deshalb f��r die N-Glycosylierung mit einem sulfatierten Oligosaccharid ausgew��hlt (11). -Val665-Glu-Cys-Arg-Asp-Ile-Val-Gly-Asn(Sulfo-Lea)-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-Ser-Glu-Asp-Ile682- 11 Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Strategie ausgearbeitet, das sulfatierte Trisaccharid 60 im Multigramma��stab zu synthetisieren. Der endogene Ligand 2 wurde an drei Positionen modifiziert: Austausch der ��-L-Fucose gegen die biologisch stabilere ��-D-Arabinose, Einf��hrung einer Sulfatgruppe anstelle der N-Acetylneuramins��ure sowie ��bergang von O- zu N-glykosidischer Verkn��pfung. Die hochregioselektive Einf��hrung der Sulfatgruppe gelingt in sehr guten Ausbeuten durch Vorkomplexierung mit Dibutylzinnoxid und anschlie��ende Umsetzung mit Schwefeltrioxid/Trimethylamin. Durch die Verwendung des anomeren Azids als permanente Schutzgruppe kann das Trisaccharid nach schonender Reduktion zum Amin an ein Asparagins��urederivat angekuppelt und in einer linearen Synthese nach Fmoc-Strategie als N-Glycosylaminos��ure in die Synthese eingebracht werden. Das in der Arbeitsgruppe Kunz entwickelte PTMSEL-Ankersystem 20a erlaubt sowohl die problemlose Synthese als auch die Abspaltung vom polymeren Tr��ger unter sehr milden Bedingungen. Nach dem Entfernen der Benzylester und -ether durch Pd(0) ��� katalysierte Hydrierung k��nnen sulfatierte Glycopeptidsequenzen des Typs 11 ��ber NMR-Spektroskopie (korrelierte Spektren) und Massenspektroskopie (ESI, MALDI) identifiziert werden.

Synthese von Sialyl-Lewis X -Glycopeptiden und -Mimetika als Zelladh��sionsinhibitoren f��r E-Selektin

Die Selektine initiieren im Verlauf von Entz��ndungsprozessen einen ersten Zellkontakt zwischen Leukozyten und Endothelzellen und erm��glichen so die Auswanderung der Leukozyten aus den Blutgef����en in das umliegende Gewebe, wo sie ihre immunologische Wirkung entfalten k��nnen. Viele Krankheiten gehen allerdings mit einer ��berm����igen, durch Selektine vermittelten Zelladh��sion einher. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, Selektininhibitoren zu synthetisieren, die pathologische Zelladh��sionsprozesse, wie man sie z.B. bei rheumatoider Arthritis, bei Erkrankungen der Herzkranzgef����e oder im Verlauf von Tumormetastasierungen findet, unterbinden k��nnen. Als Leitstruktur f��r solche Inhibitoren dient das auf den nat��rlichen Selektinliganden vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewis-X. Sialyl-Lewis-X stellt aber nur einen Teil der nat��rlichen Selektinliganden dar. Es bindet auch nur im millimolaren Bereich an die Selektine. Die komplexen nat��rlichen Selektinliganden wie z.B. ESL-1 (E-Selektin-Ligand-1), die an verschiedenen Glycosylierungs-stellen des Glycoproteins Sialyl-Lewis-X pr��sentieren, binden mit deutlich h��herer Affinit��t an die Selektine. F��r eine spezifische Rezeptorbindung sind daher au��er dem Tetrasaccharid weitere Partialstrukturen verantwortlich, wobei gezeigt werden konnte, dass ein Ankn��pfen von Sialyl-Lewis-X-Derivaten an die Partialsequenz 672-681 des ESL-1 eine Affinit��tssteigerung hervorruft. Ein weiterer Nachteil des nat��rlichen Sialyl-Lewis-X-Tetrasaccharids im Hinblick auf seine pharmakologische Verwendung besteht darin, dass sowohl die fucosidische Bindung als auch die glycosidische Verkn��pfung zur Neuramins��ure durch Enzyme leicht gespalten werden, wodurch Sialyl-Lewis-X als potenzielles Anti-Ad��sionsmolek��l an Wert verliert. Um die Kohlenydratliganden vor einem solchen enzymatischen Abbau zu bewahren, wurden in dieser Arbeit neben der im Sialyl-Lewis-X vorliegenden L-Fucose die im Menschen nicht vorkommenden Kohlenhydrate D-Arabinose und L-Galactose sowie neben der Neuramins��ure die (S)-Cyclohexylmilchs��ure zur Herstellung der sechs Glycopeptid-Selektinliganden 1-6 mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 verkn��pft. Die Tetrasaccharide und Tetrasaccharid-Mimetika k��nnen aus den gesch��tzten Monosacchariden und der gesch��tzten Cyclohexylmilch-s��ure in parallelen Synthesen im Gramm-Ma��stab hergestellt werden. Die automatisierten Glycopeptid-Festphasensynthesen wurden an einem Peptidsynthesizer nach der Fmoc-Strategie unter Verwendung von mit Asparagins��ure vorbeladenen TentaGel��-Harzen durchgef��hrt. Die Strukturen aller sechs Glycopeptide 1-6 wurden sowohl durch hoch aufl��sende massenspektrometrische Analysen als auch durch ein- und zweidimensionale NMR-Experimente belegt. Als Ergebnis dieser Arbeit liegen sechs Sialyl-Lewis-X-Glycopeptide und -Mimetika mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 vor. Diese werden in K��rze auf ihre Wirksamkeit als Zelladh��sions-inhibitoren f��r E-Selektin getestet. Daraus sollen sich Erkenntnisse ��ber Struktur-Wirkungs-Beziehungen gewinnen lassen, insbesondere was das kooperative Zusammenwirken von Saccharid- und Peptidteilstrukturen in der Erkennung der Liganden durch das E-Selektin anbetrifft.

Development of newly conceived biomimetic nano-structured biomaterials as scaffolds for bone and osteochondral regeneration

The present research thesis was focused on the development of new biomaterials and devices for application in regenerative medicine, particularly in the repair/regeneration of bone and osteochondral regions affected by degenerative diseases such as Osteoarthritis and Osteoporosis or serious traumas. More specifically, the work was focused on the synthesis and physico-chemical-morphological characterization of: i) a new superparamagnetic apatite phase; ii) new biomimetic superparamagnetic bone and osteochondral scaffolds; iii) new bioactive bone cements for regenerative vertebroplasty. The new bio-devices were designed to exhibit high biomimicry with hard human tissues and with functionality promoting faster tissue repair and improved texturing. In particular, recent trends in tissue regeneration indicate magnetism as a new tool to stimulate cells towards tissue formation and organization; in this perspective a new superparamagnetic apatite was synthesized by doping apatite lattice with di-and trivalent iron ions during synthesis. This finding was the pin to synthesize newly conceived superparamagnetic bone and osteochondral scaffolds by reproducing in laboratory the biological processes yielding the formation of new bone, i.e. the self-assembly/organization of collagen fibrils and heterogeneous nucleation of nanosized, ionically substituted apatite mimicking the mineral part of bone. The new scaffolds can be magnetically switched on/off and function as workstations guiding fast tissue regeneration by minimally invasive and more efficient approaches. Moreover, in the view of specific treatments for patients affected by osteoporosis or traumas involving vertebrae weakening or fracture, the present work was also dedicated to the development of new self-setting injectable pastes based on strontium-substituted calcium phosphates, able to harden in vivo and transform into strontium-substituted hydroxyapatite. The addition of strontium may provide an anti-osteoporotic effect, aiding to restore the physiologic bone turnover. The ceramic-based paste was also added with bio-polymers, able to be progressively resorbed thus creating additional porosity in the cement body that favour cell colonization and osseointegration.

Synthese, Tritierung, 99m Tc-Markierung und Evaluierung von Benzamid-Derivaten zur Visualisierung der D 2, D 3-Rezeptoren

Die Diagnose und Therapie von neurodegenerativen Krankheiten, wie beispielsweise Morbus Parkinson besitzt in der heutigen Gesellschaft eine immer gr����ere Bedeutung. ��ber moderne, bild��gebende nuklear��medizinische Verfahren wie SPECT und PET ist es mit geeigneten Radioliganden m��glich, Morbus Parkinson vor dem Auftreten von Symptomen zu diagnostizieren. Ein wichtiger Ansatzpunkt zur Diagnose von Morbus Parkinson ist die Visualisierung der postsynaptischen Dopamin-Rezeptoren ��ber radioaktiv (11C, 18F, 123I) markierte Benz��amid-Derivate. Auf Grundlage der (S)-Pyrolidin-2,3-dimethoxy-Benzamid-Struktur des 18F-Liganden Fallypride wurden verschiedene 99mTc-markierte Benzamid-Derivate als potentielle Radio��liganden zur Parkinson-Diagnostik entwickelt. Um das Potential von Metall-konjugierten Benzamiden absch��tzen zu k��nnen, wurden zun��chst einfache Vergleichssubstanzen entwickelt. Diese sollten die Einf��hrung eines Chelators simulieren und wurden hierf��r hinsichtlich ihrer in vitro-Bindungsaffinit��ten zu den Dopamin-, Serotonin- und adrenergen Rezeptoren evaluiert. Die zun��chst entwickelten Derivate mit unterschiedlichen Kettenl��ngen zur Kopplung des Chelators zeigten f��r die Propylkette Affinit��ten im nanomolaren Bereich. Im Anschluss sollten basierend auf diesen Ergebnissen vier verschiedene Chelatoren (Carbony-Cyclopentadienyl, Amido-Cyclopentadienyl, 2-Pyridyl-Imin und N2S2) ��ber eine Propylkette an die 5-Position der Benzamidgrundstruktur gekoppelt werden. Die geplante Synthese des Carbonyl-Cyclopentadienyl-Derivates gelang jedoch nicht. F��r die weiteren Chelatoren (Amido-Cyclopentadieny, 2-Pyridyl-Imin und N2S2) konnten die jeweiligen Markierungs��vorl��ufer und Rhenium-Komplexe dargestellt werden, die ebenfalls hinsichtlich ihrer Bindungs��affinit��ten evaluiert wurden. Die erzielten Affinit��ten zeigten, dass eine ��ber��tragung der Affinit��ten der einfachen Vergleichssubstanzen auf die komplexeren Metall-Benzamide nicht m��glich war. Insbesondere der N2S2-Rhenium-Komplex besitzt nur noch geringe Affinit��t (490 - 900 nM) zu den D2- und D3-Rezeptoren. Die mittel-affinen 2-Pyridyl-Imin- und Amdio��cyclopentadien-Komplexe wurden mit 99mTc markiert und die Markierungsausbeute hinsichtlich Reaktionstemperatur, Markierungs-vorl��uferkonzentration und Heizmethoden optimiert. Dabei konnte der Imin-Komplex quantitativ mittels fac-[99mTc(CO)3(H2O)3]+ in 30 Minuten bei 45��C markiert werden. Der Amido-Cyclopentadien-Komplex konnte ��ber die Umsetzung des Ferrocen-Markierungsvorl��ufer mit Mn(CO)5Br und [99mTcO4]- in Ausbeuten von bis zu 60 % markiert werden. Im Anschluss an die Markierungen wurden die 99mTc-Komplexe ��ber HPLC isoliert und in in vitro-Auto��radiographien von Rattenhirnschnitten weiter evaluiert. Die erhaltenen Ergebnisse best��tigten die f��r die Rhenium-Komplexe erzielten Affinit��ten und zeigten keine spezifische Anreicherung in bestimmten Hirnarealen. Aus diesen Ergebnissen kann ge��schlossen werden, dass die dargestellten 99mTc-Benzamide aufgrund mangelnder Affinit��ten und einer hohen unspezifischen Bindung keine geeigneten Liganden zur Darstellung der D2- und D3- Rezeptoren sind. Um die dargestellten 99mTc-Benzamide mit [18F]Fallypride vergleichen zu k��nnen, wurde zus��tzlich [3H]Fallypride dargestellt. Hierf��r wurde zun��chst der Nor-Markierungsvor��l��ufer synthetisiert und die Markierungsausbeute optimiert. Die finale Umsetzung mit [3H]Methylnosylat ergab nach HPLC-Aufreinigung 15 mCi [3H]Fallypride mit einer radio��chemischen Reinheit von >99,5 %. Erste Autoradiographien zeigten eine hohe Anreicherung des Liganden im Striatum, verbunden mit einer sehr niedrigen unspezifischen Bindung.

Synthese, Evaluierung und 18 F-Markierung von neuen Liganden zur Visualisierung der Strychnin-insensitiven Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors

Glutamat ist der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im Gehirn. Folglich spielen Glutamat-kontrollierte Rezeptorsysteme eine entscheidende Rolle in neurologischen Vorg��ngen, wie beispielsweise in Lern- und Ged��chtnisprozessen. Gerade der NMDA-Rezeptor ist in eine Vielzahl solcher Vorg��nge involviert und wird vor allem mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Chorea Huntington, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und zerebraler Isch��mie in Verbindung gebracht. Folglich stellt die Visualisierung des NMDA-Rezeptorstatus eine M��glichkeit dar, den Verlauf solcher Prozesse zu untersuchen.rnDie Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist eine leistungsstarke Anwendung in der molekularen Bildgebung und erlaubt die in vivo-Visualisierung sowie Quantifizierung biochemischer Prozesse. Durch die Verwendung geeigneter Tracer k��nnen bestimmte pathologische und neurologische Abl��ufe beurteilt werden. rnZurzeit sind keine geeigneten PET-Tracer zur Untersuchung des NMDA-Rezeptors verf��gbar. Bisher dargestellte PET-Liganden zeichneten sich durch nicht zufriedenstellende Affinit��ten und Selektivit��ten aus und f��hrten meist auf Grund der hohen Lipophilie zu einem hohen Ma�� an unspezifischer Bindung. rnDie Strychnin-insensitive Glycinbindungsstelle des NMDA-Rezeptors stellt ein vielversprechendes Target dar, spezifische Liganden f��r diese Bindungsstelle zu synthetisieren. Hier zeichnen sich einige Verbindungsklassen durch exzellente Affinit��ten und Selektivit��ten sowie durch vielversprechende in vivo-Eigenschaften aus. rnAuf Grundlage dieser biologischen Daten wurden zwei Substanzen der 2-Indolcarbons��ure, n��mlich die 4,6-Dichlor-3-(2-oxo-3-phenylimidazolidin-1-ylmethyl)-1H-indol-2-carbons��ure (MDJ-114) und die (E)-4,6-Dichlor-3-(2-phenylcarbamoylvinyl)-1H-indol-2-carbons��ure (GV150526), als Leitstruktur gew��hlt. Ferner wurde das 7-Chlor-4-hydroxy-3-(3-phenoxyphenyl)-1H-chinolin-2-on (L-701,324) aus der Substanzklasse der 4-Hydroxy-1H-chinolin-2-one als dritte Leitstruktur gew��hlt.rnF��r diese Substanzen wurden 19F-markierte Analogverbindungen synthetisiert, um als inaktive Referenzverbindungen auf ihre Eignung ��berpr��ft zu werden. Hierzu wurde eine Fluorethoxygruppierung im terminalen Phenylring der entsprechenden Leitstruktur eingef��hrt. Durch Variation der Fluorethoxysubstitution in ortho-, meta- und para-Stellung, konnten die besten Affinit��ten in einem kompetitiven Rezeptorbindungsassay durch Verdr��ngung von [3H]MDL-105,519 bestimmt werden. Als Ma�� f��r die Lipophilie wurden die entsprechenden log D-Werte ��ber die HPLC-Methode bestimmt. Basierend auf den Ergebnissen der Evaluierung wurden zwei Derivate identifiziert, welche zur 18F-Markierung genutzt werden sollten (GV150526-Derivat 34: log D = 0,23 �� 0,03, IC50 = 0,20 �� 0,25 ��M, Ki = 0,13 �� 0,16 ��M; L701,324-Derivat 55: log D = - 0,25 �� 0,01, IC50 = 78 �� 37 ��M, Ki = 51 �� 24 ��M). Die 18F-Markierung erfolgte durch die Reaktion des entsprechenden Markierungsvorl��ufers mit dem Markierungssynthon 2-[18F]Fluorethyltosylat, welches durch die Umsetzung von Ethylenditosylat mit [18F]Fluorid hergestellt wurde. Die Radiosynthesen der beiden 18F-markierten Verbindungen [18F]34 (4,6-Dichlor-3-{2-[4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenylcarbamoyl]-vinyl}-1H-indol-2-carbons��ure) und [18F]55 (7-Chlor-3-{3-[4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenoxy]-phenyl}-4-hydroxy-1H-chinolin-2-on) wurden optimiert sowie semipr��parative Abtrennverfahren entwickelt. Beide Tracer wurden auf ihre in vivo-Eignung im ��PET-Experiment untersucht. Die Zeitaktivit��tskurven lassen erkennen, dass beide Tracer entgegen der Erwartung nicht die Blut-Hirn-Schranke ��berwinden k��nnen. F��r das GV150526-Derivat ([18F]34) wurden zus��tzlich Autoradiographiestudien durchgef��hrt. Die erhaltenen Aufnahmen zeigten ein heterogenes Verteilungsmuster der Aktivit��tsanreicherung. Ebenso wurde ein hohes Ma�� an unspezifischer Bindung beobachtet. M��glicherweise sind Cross-Affinit��ten zu anderen Rezeptorsystemen oder der recht hohe lipophile Rest des Molek��ls hierf��r verantwortlich. Ein Grund f��r die unzureichende Hirng��ngigkeit der Radioliganden kann sich in der Carboxylatfunktion des GV150526-Derivats bzw. in der 4-Hydroxy-1H-chinolin-2-on-Einheit des L-701,324-Derivats wiederspiegeln. rnAuf Grundlage dieser Resultate k��nnen Versuche unternommen werden, f��r die Verbindungsklasse der 2-Indolcarbons��uren entsprechende Ester als Prodrugs mit einer verbesserten Bioverf��gbarkeit darzustellen. Ebenso k��nnen neue Strukturen als Grundlage f��r neue PET-Tracer untersucht werden.rnrn