Rôle essentiel des cellules dendritiques dans l'immunité innée face a des streptocoques encapsulés

Streptococcus du Groupe B (GBS) et Streptococcus suis sont deux pathogènes encapsulés qui induisent des pathologies similaires dont la méningite et la septicémie chez les animaux et/ou les humains. Les sérotypes III et V du GBS et les sérotypes 2 et 14 du S. suis (utilisés dans cette étude) sont parmi les plus prévalents et/ou les plus virulents. La capsule polysaccharidique (CPS) définit le sérotype et est considérée comme un facteur de virulence essentiel pour les deux espèces bactériennes. Malgré que plusieurs études aient été réalisées au niveau des interactions entre ces streptocoques et les cellules de l’immunité innée, aucune information n’est disponible sur la régulation de la réponse immunitaire contre ces pathogènes par les cellules dendritiques (DCs) et leur interactions avec d’autres cellules, notamment les cellules ‘natural killer’ (NK). Dans cette étude, différentes approches (in vitro, ex vivo et in vivo) chez la souris ont été développées pour caractériser les interactions entre les DCs, les cellules NK et GBS ou S. suis. L’utilisation de mutants non encapsulés a permis d’évaluer l’importance de la CPS dans ces interactions. Les résultats in vitro avec les DCs infectées par GBS ou S. suis ont démontré que ces deux pathogènes interagissent différemment avec ces cellules. GBS est grandement internalisé par les DCs, et ce, via de multiples mécanismes impliquant notamment les radeaux lipidiques et la clathrine. Le mécanisme d’endocytose utilisé aurait un effet sur la capacité du GBS à survivre intracellulairement. Quant au S. suis, ce dernier est très faiblement internalisé et, si le cas, rapidement éliminé à l’intérieur des DCs. GBS et S. suis activent les DCs via différents récepteurs et favorisent la production de cytokines et chimiokines ainsi que l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation. Cette activation permet la production d’interferon-gamma (IFN-y) par les cellules NK. Cependant, GBS semble plus efficient à activer les DCs, et par conséquent, les cellules NK que S. suis. La production d’IFN-y, en réponse à la stimulation bactérienne, est principalement assurée par un contact direct entre les DCs et les cellules NK et ne dépend qu’en partie de facteurs solubles. De plus, nos résultats in vivo ont démontré que ces deux streptocoques induisent rapidement la libération d'IFN-y par les cellules NK lors de la phase aiguë de l'infection. Ceci suggère que les interactions entre les DCs et les cellules NK pourraient jouer un rôle dans le développement d’une réponse immune T auxiliaire de type 1 (T ‘helper’ 1 en anglais; Th1). Cependant, la capacité de S. suis à activer la réponse immunitaire in vivo est également plus faible que celle observée pour GBS. En effet, les CPSs de GBS et de S. suis jouent des rôles différents dans cette réponse. La CPS de S. suis empêche une activation optimale des DCs et des cellules NK alors que c’est l’opposé pour la CPS de GBS, indépendamment du sérotype évalué. En résumé, cette étude adresse pour la première fois la contribution des DCs et des cellules NK dans la réponse immunitaire innée lors d’une infection à GBS ou à S. suis et, par extension, dans le développement d’une réponse Th1. Nos résultats renforcent davantage le rôle central des DCs dans le contrôle efficace des infections causées par des bactéries encapsulées.

Rôle des gènes HOX du paralogue 4 dans l'autorenouvellement des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement couramment utilisé pour traiter plusieurs types de maladies hématologiques telles que les leucémies. Par contre, une limite importante de ce type de traitement est la quantité restreinte de CSH disponibles pour la transplantation. Il importe donc de trouver des moyens pour expandre efficacement ces cellules ex vivo tout en préservant leurs propriétés. Le gène HOXB4 est présentement un candidat très prometteur pour atteindre cet objectif. Il a en effet été montré que HOXB4 est capable d’expandre les CSH in vivo et in vitro sans mener au développement de leucémie. Le gène HOXC4, qui appartient au même paralogue est aussi en mesure d’expandre les cellules hématopoïétiques primitives suggérant un rôle commun pour les gènes HOX du paralogue 4 dans l’autorenouvellement des CSH. Le gène HOXA4 est dix fois plus exprimé que le gène HOXB4 dans des CSH du foie fœtal au moment de leur principale expansion. De plus, les CSH mutantes pour Hoxa4, contrairement aux CSH mutantes pour Hoxb4, sont incapables de reconstituer un receveur irradié lorsqu’elles sont transplantées en condition de compétition. HOXA4 pourrait donc jouer un rôle plus important que les autres gènes du paralogue 4 pour l’expansion des CSH au niveau physiologique. Nous avons donc posé l’hypothèse que HOXA4 est capable d’expandre des CSH de façon plus importante que HOXB4. Les résultats obtenues dans le cadre de ce projet de recherche ont montré que la surexpression de HOXA4 était capable d’expandre les CSH et les progéniteurs hématopoïétiques primitifs dans le même ordre que ce qui est connu pour HOXB4. Des cultures et des essais de transplantation en situation de compétition ont confirmé la capacité égale des CSH surexprimant HOXA4 et HOXB4 de proliférer et de reconstituer les receveurs irradiés à long terme. Par contre, nous avons observé une meilleure reconstitution périphérique à court terme par les CSH HOXA4+ par rapport aux CSH HOXB4+, associée à une meilleure reconstitution lymphoïde. Nous avons aussi comparé les niveaux d’expression de gènes cibles potentiels dans des CSH surexprimant HOXA4 ou HOXB4 et observer que plusieurs gènes importants pour la fonction des CSH était régulé positivement suite à leur surexpression, notamment plusieurs gènes impliqués dans les voies de signalisation Notch et Wnt, tels que des récepteurs et ligands. Les gènes HOX du paralogue 4 pourraient donc réguler la communication entre les CSH et leur microenvironnement via ces voies de signalisation majeures et ainsi réguler leur autorenouvellement. La modulation de différents gènes codant pour des facteurs de transcription et des molécules impliquées dans la pluripotence suggère également que HOXA4 et HOXB4 utilisent des mécanismes intrinsèques et extrinsèques pour réguler leur potentiel d’autorenouvellement. Ces connaissances pourront ainsi être utilisées pour optimiser les protocoles d’expansion ex vivo des CSH dans un but thérapeutique.

The inflammatory role of angiogenic growth factors : a neutrophil perspective

De par sa présence dans tous les vaisseaux sanguins, l'endothélium joue un rôle clef dans le processus d’hémostase, tant par sa libération de facteurs anticoagulants que par ses changements protéiques qui permettent à l’organisme de déclencher la réparation tissulaire. La fonction anticoagulante de l’endothélium peut être mise en défaut en cas d’atteinte de son intégrité, entrainant la formation de thrombus, le rejet précoce de greffes ou encore l’induction de l’athérosclérose. L’intégrité de l’endothélium est donc capitale pour la prévention de nombreuses maladies cardiovasculaires. Chez l’adulte, les cellules endothéliales (CE), normalement quiescentes, sont rapidement activées en cas d’hypoxie ou d’inflammation, leur permettant ainsi d’amorcer le processus angiogénique comme suit: Tout d’abord, l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire permet l’extravasation des protéines plasmatiques. Ensuite, la dégradation de la lame basale par des métalloprotéases permet aux CE de se détacher, de proliférer, de migrer et de s’organiser pour former l’ébauche du futur vaisseau. La dernière étape consiste en la maturation du vaisseau, c’est-à-dire son recouvrement par des cellules murales, telles que les cellules musculaires lisses et les péricytes. Ces processus sont régulés par de nombreux facteurs angiogéniques tels que les membres de la famille Notch, du vascular endothelial growth factor (VEGF), du fibroblast growth factor (FGF), des angiopoïétines, et des matrix metalloproteases (MMP). L’angiogenèse pathologique, soit une insuffisance ou un excès de vascularisation, est impliquée dans les blessures chroniques, les accidents cardiovasculaires, les pathologies coronariennes artérielles, les pathologies tumorales, l’arthrite rhumatoïde, la rétinopathie diabétique, l’athérosclérose, le psoriasis et l’asthme. Ces pathologies sont souvent issues d’une dérégulation de l’activité endothéliale, fréquemment observée conjointement à l’expression continue de molécules d’adhésion leucocytaires, à l’augmentation de la perméabilité vasculaire, et aux anomalies de la vasoréactivité. L’activation non-contrôlée de l’endothélium entraîne ainsi une inflammation chronique et la formation de structures vasculaires anarchiques. Les premiers leucocytes à répondre à l’appel inflammatoire sont les neutrophiles. Equippées d’une panoplie de produits antibactériens puissants mais aussi nocifs pour les tissus qui les entourent, ces cellules polylobées participent à chaque étape du processus inflammatoire, depuis l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire jusqu’à la résolution. En effet, grâce à leurs récepteurs, les neutrophiles détectent et interprètent les signaux biochimiques présents dans la circulation et à la surface de l’endothélium, et libèrent aussi leurs propres médiateurs tels le VEGF, les MMP, et l’interleukine-8 (IL-8), dont les effets sont à la fois paracrines et autocrines. Existent-ils d’autres modulateurs typiques de la fonction endothéliale capables d’influencer le comportement des neutrophiles? En effet, notre laboratoire a démontré que chez l’humain, une stimulation directe aux angiopoïétines incitait les neutrophiles à adhérer aux CE, à migrer, à synthétiser et à relâcher l’IL-8, voire même à vivre plus longtemps. La présence du récepteur des angiopoïétines, Tie2, à la surface des neutrophiles laisse présager que la famille possèderait d’autres fonctions leucocytaires encore non-identifiées. Par ailleurs, dans un modèle classique de l’angiogenèse in vivo (matrigel), nous avons observé que sous l’effet du FGF1 et 2, les ébauches des nouveaux vaisseaux étaient parfois accompagnées d’une infiltration de cellules granulocytaires. Ainsi, en partant de ces observations, l’objectif de nos études (présentées ci-après) était d’approfondir nos connaissances sur la relation entre neutrophiles et facteurs angiogéniques, notamment les FGF et les angiopoïétines. Par tests in vitro, nous avons confirmé que les neutrophiles humains exprimaient plusieurs récepteurs du FGF (FGFR1-4) d’une façon hétérogène, et qu’ils migraient vers un gradient des ligands FGF1 et 2. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés aux voies de signalisation inflammatoires activées par les ligands FGF1, FGF2, Ang1 et Ang2. Grâce à une stratégie génique ciblant 84 gènes inflammatoires, nous avons identifié plusieurs cibles d’intérêt touchées par Ang1, dont certains membres de la famille de l’IL-1, alors qu’aucun des gènes testés n’avait changé de façon significative sous l’effet des FGF ou d’Ang2. Suite à des cinétiques approfondies, nous avons démontré qu’Ang1 stimulait la transcription de l’ARN messager de l’IL-1β, et augmentait simultanément la quantité de protéine immature (pro-IL-1β; inactive) et clivée (IL-1β « mature »; active). En parallèle, Ang1 augmentait la sécrétion de l’antagoniste naturel de l’IL-1β, l’IL-1RA, sans pour autant stimuler la relâche de l’IL-1β. A l’instar des endotoxines bactériennes dont les effets liés à l’IL-1 dépendaient de la kinase p38, ceux d’Ang1 découlaient presque entièrement des voies de signalisation du p42/44.

Le rôle d’Akt dans la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN induits par les ultraviolets dans les cellules de mélanomes humains

Le mélanome malin est l’un des cancers les plus mortels dont l’incidence continue à augmenter chaque année avec peu de traitement efficace à long terme. Il est causé et initié principalement par l’exposition excessive aux rayons ultraviolets engendrant des photoproduits hautement génotoxiques. Il est bien connu que la cascade de signalisation PI3K/Akt joue un rôle crucial dans la régulation des processus qui sont généralement dérégulés durant le développement tumoral comme la prolifération, le contrôle du cycle cellulaire et l’apoptose. Néanmoins, l’implication de cette voie moléculaire dans la réponse aux dommages à l’ADN est peu caractérisée. Chez les mammifères, trois isoformes de la protéine kinase Akt ont été identifiées: Akt1, Akt2 et Akt3. Bien qu’elles soient très homologues en termes de séquence, plusieurs études ont montré que ces isoformes ont des fonctions biologiques distinctes, et nous suggérons qu’elles puissent contribuer différemment à la régulation de la réponse génotoxique. Les objectifs de ce projet étaient de: (i) évaluer l’activation d’Akt dans les cellules de mélanomes (ii) déterminer l’impact de l’inhibition de cette activité sur la régulation de la réponse cellulaire aux UV (iii) vérifier si la perte d’expression de l’un ou de l’autre des isoformes d’Akt peut réguler la réponse aux UV. Nous avons démontré qu’Akt est transitoirement hyperactivée par phosphorylation suite aux irradiations UV dans les lignées cellulaires de mélanomes. Afin de déterminer l'importance de cette activation dans la réponse cellulaire aux UV, notre approche était de diminuer (i) la phosphorylation d’Akt par l’usage d’inhibiteurs pharmacologiques ou (ii) l’expression de chaque isoforme d’Akt par l’approche des ARN interférents. Nous avons montré que l’inhibition de la phosphorylation d’Akt amène à l’augmentation du taux de l’apoptose induit par les UV d’une manière isoforme spécifique, alors qu’elle n’a aucun effet sur la régulation de la voie de réparation par excision de nucléotides (NER), qui est la seule voie humaine pour éliminer les dommages à l’ADN induits par les UV. En somme, notre étude constitue un nouvel aspect qui permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires du développement de mélanomes malins suites aux irradiations ultraviolettes.

Nanotoxicité des points quantiques : étude in vitro chez les cellules épithéliales alvéolaires humaines A549

Les nanoparticules (NPs) sont définies comme des particules ayant au moins une dimension comprise entre 1 à 100 nanomètres. Plusieurs études in vitro et in vivo indiquent que les NPs pourraient constituer un risque potentiel pour la santé des personnes les synthétisant ou les manipulant lors de leur incorporation dans d’autres matériaux. La nanotoxicologie est un domaine de recherche émergeant. Les propriétés physico-chimiques particulières des NPs sont responsables d’interférences non spécifiques entre les nanomatériaux et certains des composants des essais in vitro pouvant mener à de faux résultats. L’inhalation a été identifiée comme une voie d’exposition présentant un risque important de toxicité. Dans le cadre de ce projet, nous avons utilisé la lignée de cellules épithéliales alvéolaires humaines, A549. Nous avons étudié chez cette lignée les conséquences de l’exposition aux points quantiques (PQs), NPs d’intérêt pour leurs applications potentielles en médecine (nanovecteur ou nanosonde). La mise au point des conditions expérimentales (interférence entre l’essai LDH et le milieu de culture) a permis de valider les essais de cytotoxicité MTS et LDH en présence des PQs. Nous avons montré que les PQs présentaient une cytotoxicité à court et long terme, et nous avons par la suite étudié un des mécanismes de toxicité potentielle, la mesure du cadmium (Cd2+) libéré des PQs. Nous avons déterminé que la mesure du Cd2+ comportait plusieurs interférences qui invalident cet essai. En conclusion, notre étude a permis d’identifier des interférences qui remettent en question plusieurs conclusions d’études publiées qui n’ont pas vérifié l’existence de telles interférences.

Identification de déterminants impliqués dans la différenciation des cellules souches embryonnaires

Les cellules souches ont attiré l’attention du public ces dernières années, grâce non-seulement à leur utilisation comme thérapies visant à s’attaquer à certains types de cancers, mais aussi en relation avec leur potentiel dans le domaine de la médecine regénérative. Il est établi que le destin cellulaire des cellules souches embryonnaires (ESC) est régulé de façon intensive par un groupe de facteur clés agissant sur leur pluripotence. Il est néanmoins envisageable que certains déterminants influençant l’auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules soient toujours inconnus. Afin de tester cette hypothèse, nous avons généré, en utilisant une méthode par infections virales, une collection de ESC contenant des délétions chromosomales chevauchantes que nous avons baptisée DelES (Deletion in ES cells). Cette librairie contient plus de 1000 clones indépendants dont les régions délétées couvrent environ 25% du génome murin. À l’aide de cette ressource, nous avons conduit un criblage de formation de corps embryoïdes (EB), démontrant que plusieurs clones délétés avaient un phénotype de différenciation anormal. Nos études de complémentation sur un groupe de clones ont par la suite permis l’identification de Rps14 - un gène codant pour une protéine ribosomale (RP) comme étant haploinsuffisant pour la formation de EB. Dans un deuxième temps, l’analyse approfondie des résultats de notre crible a permis d’identifier un groupe de gènes codants pour des RP qui semblent essentiels pour la différenciation des ESC, mais dispensables pour leur auto-renouvellement. De manière intéressante, les phénotypes anormaux de formation en EB les plus marqués sont associés à des délétions de RP qui se retrouvent au site de sortie des ARN messagers (ARNm) du ribosome, soit Rps5, Rps14 et Rps28. Étonnament, alors qu’un débalancement des RP conduit généralement à une réponse de type p53, l’haploinsuffisance de ces trois gènes ne peut être renversée par une simple réduction des niveaux d’expression de ce gène suppresseur de tumeurs. Finalement, nos études de profilage polysomal et de séquençage à haut-débit montrent une signature spécifique de gènes liés au mésoderme chez un clone hétérozygote pour Rps5, suggérant ainsi une explication au phénotype de différenciation p53-indépendant identifié chez ces ESC. Nos travaux rapportent donc la création d’une ressource intéressante de génomique fonctionnelle qui a permis de mettre à jour le rôle essentiel que jouent les RP dans le processus de formation de EB. Nos résultats permettent aussi de documenter une réponse p53-indépendante suite à un débalancement de RP dans un contexte opposant l’auto-renouvellement et la différenciation des ESC.

Rôles des protéines d’échafaudage Gab dans la signalisation et l’angiogenèse médiées par le VEGF

La protéine d’échafaudage Gab1 amplifie la signalisation de plusieurs récepteurs à fonction tyrosine kinase (RTK). Entre autres, elle promeut la signalisation du VEGFR2, un RTK essentiel à la médiation de l’angiogenèse via le VEGF dans les cellules endothéliales. En réponse au VEGF, Gab1 est phosphorylé sur tyrosine, ce qui résulte en la formation d’un complexe de protéines de signalisation impliqué dans le remodelage du cytosquelette d’actine et la migration des cellules endothéliales. Gab1 est un modulateur essentiel de l’angiogenèse in vitro et in vivo. Toutefois, malgré l’importance de Gab1 dans les cellules endothéliales, les mécanismes moléculaires impliqués dans la médiation de ses fonctions, demeurent mal définis et la participation du second membre de la famille, Gab2, reste inconnue. Dans un premier temps, nous avons démontré que tout comme Gab1, Gab2 est phosphorylé sur tyrosine, qu’il s’associe de façon similaire avec des protéines de signalisation et qu’il médie la migration des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Cependant, contrairement à Gab1, Gab2 n’interagit pas avec le VEGFR2 et n’est pas essentiel pour l’activation d’Akt et la promotion de la survie cellulaire. En fait, nous avons constaté que l’expression de Gab2 atténue l’expression de Gab1 et l’activation de la signalisation médiée par le VEGF. Ainsi, Gab2 semble agir plutôt comme un régulateur négatif des signaux pro-angiogéniques induits par Gab1. La migration cellulaire est une des étapes cruciales de l’angiogenèse. Nous avons démontré que Gab1 médie l’activation de la GTPase Rac1 via la formation et la localisation d’un complexe protéique incluant la GEF VAV2, la p120Caténine et la Cortactine aux lamellipodes des cellules endothéliales en réponse au VEGF. De plus, nous montrons que l’assemblage de ce complexe corrèle avec la capacité du VEGF à induire l’invasion des cellules endothéliales et le bourgeonnement de capillaires, deux phénomènes essentiels au processus angiogénique. La régulation des RhoGTPases est également régulée par des inactivateurs spécifiques les « Rho GTPases activating proteins », ou GAPs. Nous décrivons ici pour la première fois le rôle de la GAP CdGAP dans les cellules endothéliales et démontrons son importance dans la médiation de la signalisation du VEGF via la phosphorylation sur tyrosine de Gab1 et l’activation des RhoGTPases Rac1 et Cdc42. Ainsi, dù à son importance sur l’activation de voies de signalisation du VEGF, CdGAP représente un régulateur crucial de la promotion de diverses activités biologiques essentielles à l’angiogenèse telles que la migration cellulaire, et le bourgeonnement de capillaires in vitro et d’aortes de souris ex vivo. De plus, les embryons de souris CdGAP KO présentent des hémorragies et de l’œdème, et ces défauts vasculaires pourraient être responsables de la mortalité de 44% des souris CdGAP knock-out attendues. Nos études amènent donc une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires induits par le VEGF et démontrent l’implication centrale de Gab1 et des régulateurs des RhoGTPases dans la promotion de l’angiogenèse. Cette meilleure compréhension pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles ou approches thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients souffrant de maladies associées à une néovascularisation incontrôlée telles que le cancer.

Identification de composé sensibilisant préférentiellement les cellules exprimant les protéines E6 et E7 du VPH à l'irradiation

Le cancer du col utérin (CCU) est dans plus de 99% des cas provoqué par une infection avec le virus du papillome humain (VPH), dont le potentiel oncogénique réside dans l'expression des proto-oncogènes viraux E6/E7. Le potentiel carcinogénique de ces protéines virales réside essentiellement dans leurs actions sur les produits des gènes suppresseurs de tumeur p53 et RB. Les produits de ces gènes, p53 et Rb, font parti des voies de signalisation de réponse aux dommages de l'ADN cellulaire (RDA) et leur perte entraine une perte de fonctionnalité qui mène à une instabilité génomique. À long terme et en présence de d'autres facteurs ceux-ci mèneront au développement d'un cancer. Les protéines E6 et E7 sont constitutivement exprimées dans les cellules du CCU ainsi que dans les cellules de tout autre cancer induit par le VPH et seulement dans ces dernières. La prise en charge des cas avancés de ces cancers se fait principalement par radiothérapie et chimiothérapie concomitante. La chimio-radiothérapie utilisée en traitement est efficace mais résulte en un taux élevé de morbidité et un nombre important de patientes récidiveront. Nous proposons que l'exploitation de l'expression spécifique d’E6 et d’E7 dans les cellules du CCU permette d’envisager une stratégie de létalité synthétique afin d'amplifier l'effet létal de l'irradiation sur les cellules CCU. Ceci permettrait potentiellement d'augmenter l'efficacité du traitement et de diminuer les récidives, ainsi que la morbidité liée au traitement. En s'appuyant sur cette hypothèse, notre objectif est d’identifier des composés dont l'action seule ou couplée à l'irradiation provoquerait préférentiellement la mort des cellules exprimant les protéines E6 et E7 du VPH. Les cellules testées comprennent des cellules isogéniques humaines issues de kératinocytes normaux que nous avons modifiées séquentiellement pour obtenir les modifications associées aux cellules CCU (hTERT, E6 et E7), ainsi que les lignées de cellules de CCU HeLa et CaSki .Nous avons procédé à la mise au point et à la validation du protocole de criblage et des méthodes d’évaluation de la sensibilisation, qui se définit comme une perte de viabilité, un arrêt ou ralentissement de la croissance, par détection d’ATP ainsi que par coloration d’ADN génomique au DRAQ5. Suite à un criblage ciblé impliquant des inhibiteurs connus de la voie de réparation des dommages à l’ADN, nous avons identifié l’inhibiteur de mdm2, Nutlin-3, comme étant un composé sensibilisant et radio-sensibilisant préférentiellement les cellules exprimant E6 et E7 du VPH. La Nutlin-3 a été testée sur des cellules HEKn-hTERT-E6-E7, des cellules CaSki et HeLa. L’effet de sensibilisation et de radio-sensibilisation a été confirmé dans ces trois lignées. Tel que suggéré par son action sur mdmd2, la Nutlin-3 permet la stabilisation de p53 dans les cellules HEKn-hTERT-E6-E7 et CaSki et sa réactivation dans les lignées cellulaires HeLa et CaSki. Malgré cette stabilisation de p53, de façon surprenante, l’effet de la Nutlin-3 sur la sensibilisation et la radio-sensibilisation des cellules HeLa et CaSki semble indépendant de p53, tel qu’observé en utilisant des cellules HeLa-GSE et CaSki-GSE dont le p53 est déficient. In vivo la Nutlin-3a montre dans un essai préliminaire l’inhibition de la croissance tumorale des xénogreffes HeLa chez des souris RAG2γc. Ce résultat reste à confirmer avec un essai impliquant un nombre d’échantillons plus grand. À plus long terme, nous comptons étudier l’implication de mdm2 dans l’effet de sensibilisant de la Nutlin-3 dans les cellules CCUs, ainsi que les autres cibles pouvant être impliquées dans la création de cet effet sensibilisant observé.

L'expression de nestine est associée à l'entrée des cardiomyocytes de rats néonataux dans le cycle cellulaire.

L’infarctus du myocarde est une des conséquences possibles de l’ischémie cardiaque; il se traduit par la mort des cardiomyocytes se situant en aval du blocus coronaire, puis par la formation d’une cicatrice formée essentiellement de dépôts de matrices extracellulaires sécrétées par les myofibroblastes. Nestine est une protéine filamenteuse intermédiaire de classe VI couramment associée à la prolifération et à la migration cellulaire. Chez l’homme et les rongeurs, à la suite d’un infarctus du myocarde, une sous-population de cardiomyocytes localisée à la zone infarcie/péri-infarcie exprimait la forme striée de nestine. Le but principal de cette étude était de déterminer la source cellulaire des cardiomyocytes nestine (+) observée dans le cœur infarci ainsi que le mécanisme de signalisation cellulaire sous-jacent impliqué dans l’expression de nestine. L’utilisation de souris transgénique a révélé que l’augmentation des cardiomyocytes nestine (+) dans le cœur infarci des souris n’était pas attribuable à la différenciation de cellules souches/progénitrices nestine (+) en cardiomyocytes nestine (+). Le traitement des cardiomyocytes ventriculaires de rats néonataux avec l’activateur des protéines kinases C PDBu et l’inhibition concomitante des voies p38 MAPK a mené à l’augmentation du nombre de ces cellules exprimant nestine. De plus, une population importante de cardiomyocytes ventriculaires de rats néonataux a incorporé la bromodéxoxyuridine, signe d’une capacité à réentrer dans le cycle cellulaire et à synthétiser de l’ADN. Sur la base de ces observations, l’apparition de cardiomyocytes nestine (+) dans le cœur infarci des rongeurs et des hommes pourrait possiblement refléter une sous-population de cardiomyocytes en prolifération tentant de régénérer le cœur infarci.

Effet du stress prolifératif sur la fonction des cellules souches hématopoïétiques : rôles des gènes Scl, E2A et Heb

Le système hématopoïétique est un tissu en constant renouvellement et les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) sont indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang. Deux fonctions définissent les CSHs; la propriété d’auto-renouvellement, soit la capacité de préserver l’identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, le potentiel de différenciation permettant de générer toutes les lignées hématopoïétiques. Chez l’adulte, la majorité des CSHs sont quiescentes et l’altération de cet état corrèle avec une diminution du potentiel de reconstitution des CSHs, suggérant que la quiescence protège les fonctions des CSHs. La quiescence est un état réversible et dynamique et les réseaux génétiques le contrôlant restent peu connus. Un nombre croissant d’évidences suggère que si à l’état d’homéostasie il y a une certaine redondance entre les gènes impliqués dans ces réseaux de contrôle, leurs rôles spécifiques sont révélés en situation de stress. La famille des bHLHs (basic helix-loop-helix) inclue différentes classes des protéines dont ceux qui sont tissu-spécifiques comme SCL, et les protéines E, comme E12/E47 et HEB. Certains bHLHs sont proposés êtres important pour la fonction des cellules souches, mais cela ne fait pas l’unanimité, car selon le contexte cellulaire, il y a redondance entre ces facteurs. La question reste donc entière, y a-t-il un rôle redondant entre les bHLHs d’une même classe pour la fonction à long-terme des CSHs? Les travaux présentés dans cette thèse visaient dans un premier temps à explorer le lien encore mal compris entre la quiescence et la fonction des CSHs en mesurant leurs facultés suite à un stress prolifératif intense et dans un deuxième temps, investiguer l’importance et la spécificité de trois gènes pour la fonction des CSHs adultes, soit Scl/Tal1, E2a/Tcf3 et Heb/Tcf12. Pour répondre à ces questions, une approche cellulaire (stress prolifératif) a été combinée avec une approche génétique (invalidation génique). Plus précisément, la résistance des CSHs au stress prolifératif a été étudiée en utilisant deux tests fonctionnels quantitatifs optimisés, soit un traitement basé sur le 5-fluorouracil, une drogue de chimiothérapie, et la transplantation sérielle en nombre limite. Dans la mesure où la fonction d’un réseau génique ne peut être révélée que par une perturbation intrinsèque, trois modèles de souris, i.e. Scl+/-, E2a+/- et Heb+/- ont été utilisés. Ceci a permis de révéler que l’adaptation des CSHs au stress prolifératif et le retour à l’équilibre est strictement contrôlé par les niveaux de Scl, lesquels règlent le métabolisme cellulaire des CSHs en maintenant l’expression de gènes ribosomaux à un niveau basal. D’autre part, bien que les composantes du réseau puissent paraître redondants à l’équilibre, mes travaux montrent qu’en situation de stress prolifératif, les niveaux de Heb restreignent la prolifération excessive des CSHs en induisant la sénescence et que cette fonction ne peut pas être compensée par E2a. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse montrent que les CSHs peuvent tolérer un stress prolifératif intense ainsi que des dommages à l’ADN non-réparés, tout en maintenant leur capacité de reconstituer l’hématopoïèse à long-terme. Cela implique cependant que leur métabolisme revienne au niveau de base, soit celui trouvé à l’état d’homéostasie. Par contre, avec l’augmentation du nombre de division cellulaire les CSHs atteignent éventuellement une limite d’expansion et entrent en sénescence.

La glycine décarboxylase désensibilise les cellules initiatrices de tumeur à la metformine

Le cancer du pancréas est l’un des plus chimiorésistants, avec un taux de survie sur 5 ans inférieur à 5%. La chimiorésistance pourrait être due à la présence de cellules initiatrices de tumeur (TICs), une petite sous-population des cellules tumorales possédant la capacité de régénérer une nouvelle tumeur. Il a été démontré que la metformine cible les TICs par un mécanisme non élucidé. Il est connu que la metformine affecte le métabolisme du carbone. Il a également été démontré que le métabolisme du carbone, plus précisément la glycine décarboxylase (GLDC), est à la fois nécessaire et suffisant à l’acquisition de propriétés d’initiation tumorale. Nous proposons que la metformine cible les cellules initiatrices de tumeur en affectant le métabolisme du carbone. Nous avons utilisé des lignées cellulaires dérivées d’un modèle murin de cancer du pancréas pour comparer l’expression génique de lésions bénignes versus malignes. Les cellules malignes surexpriment Gldc. La metformine diminue l’expression de Gldc, et la surexpression de Gldc diminue la sensibilité à la metformine dans un essai de sphères tumorales. La metformine induit une augmentation du ratio NADP+/NADPH, et la surexpression de Gldc empêche cette augmentation. Nous proposons que la metformine diminue l’expression de Gldc, ce qui cause une diminution du flux du métabolisme du carbone, et donc une diminution de la production de NADPH par ce dernier. L’augmentation du ratio NADP+/NADPH inhibe la synthèse des acides gras et la régénération de la glutathione, ce qui pourrait expliquer la diminution de la formation de sphères tumorales sous traitement metformine.

Rôle des cellules dendritiques dans la modulation de la réponse immunitaire de l'hôte contre Streptococcus suis

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et agent zoonotique responsable de méningites et de septicémies. À ce jour, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis sont peu connus; et il en est de même pour les stratégies utilisées par S. suis afin de déjouer cette réponse. L’augmentation de l’incidence et de la sévérité des cas humains souligne le besoin d’une meilleure compréhension des interactions entre S. suis et le système immunitaire afin de générer une réponse immunitaire efficace contre ce pathogène. Les cellules dendritiques (DCs) sont de puissantes cellules présentatrices d’antigènes qui stimulent les lymphocytes T et B, assurant la liaison entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. L’objectif principal de ce projet était d’évaluer le rôle joué par différents facteurs de virulence de S. suis sur la modulation de la fonction des DCs et de la réponse T-dépendante. Nous avons examiné l’effet des facteurs clés pour la virulence de S. suis, dont la capsule polysaccharidique (CPS), les modifications de la paroi cellulaire (D-alanylation de l’acide lipotéichoïque et N-déacétylation du peptidoglycane) et la toxine suilysine, sur l’activation et la maturation de DCs murines dérivées de la moelle osseuse (bmDCs). Suite à l’infection par S. suis, les bmDCs sont activées et subissent un processus de maturation caractérisé par l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation et la production de cytokines pro-inflammatoires. La CPS est le principal facteur interférant avec la production de cytokines, même si les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine peuvent également moduler la production de certaines cytokines. Enfin, la CPS, les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine interfèrent avec la déposition du complément à la surface des bactéries et, en conséquence, avec le « killing » dépendant du complément. Les résultats ont été confirmés à l’aide de bmDCs porcines. Nous avons aussi voulu identifier les récepteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance de S. suis par les DCs. Nous avons démontré que la production de cytokines et l’expression des molécules de co-stimulation par les DCs sont fortement dépendantes de la signalisation par MyD88, suggérant que les DCs reconnaissent S. suis et deviennent activées majoritairement via la signalisation par les récepteurs de type Toll (TLRs). En effet, on remarque une diminution de la production de plusieurs cytokines ainsi que de l’expression de certaines molécules de co-stimulation chez les DCs TLR2-/- ou TLR2-/- et TLR9-/- double négatives. Finalement, le récepteur NOD2 semblait jouer un rôle partiel dans l’activation des DCs suite à une infection par S. suis.Enfin, nous avons évalué les conséquences de la modulation des fonctions des DCs sur le développement de la réponse T-dépendante. Les splénocytes totaux produisent plusieurs cytokines en réponse à S. suis. Des analyses in vivo et ex vivo ont permis d’observer l’implication des cellules T CD4+ et le développement d’une réponse de type « T helper » 1 (TH1) bien que la quantité de cytokines TH1 produites lors de l’infection in vivo par S. suis demeure assez basse. La CPS de S. suis interfère avec la production de plusieurs cytokines par les cellules T in vitro. Expérimentalement, l’infection induite par S. suis résulte en de faibles niveaux de production d’anticorps anti-S. suis, mais aussi d’anticorps dirigés contre l’ovalbumine utilisée comme antigène rapporteur. Cette interférence est corrélée avec la sévérité des signes cliniques, suggérant que S. suis interfère avec le développement d’une réponse immunitaire adaptative appropriée qui serait requise pour contrôler la progression de l’infection. Les résultats de cette étude mèneront à une meilleure compréhension de la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis.

Les effets de l’Angiopoietin-like 2 sur la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2

L’angiopoietin-like 2 (angptl2) est une glycoprotéine de 64 kDa pro-inflammatoire et pro-athérogénique associée à divers maladies inflammatoires chroniques. Il est probable que l’angptl2 possède également un effet pro-oxydant, puisqu’elle stimule la production aigüe de dérivés réactifs oxygénés (DRO). Le facteur de transcription « nuclear factor (erythroidderived 2)-like 2 » (Nrf2) fait partie d’un mécanisme antioxydant majeur permettant de maintenir l’équilibre redox via l’induction de plusieurs gènes de l’élément de réponse antioxydante (ERA). En présence de DRO, la protéine Keap-1 se dissocie de Nrf2 et cesse de promouvoir sa dégradation protéasomale. Cette dissociation est stimulée par la protéine DJ-1 qui favorise la translocation nucléaire de Nrf2. La p38MAPK peut phosphoryler Nrf2 et promouvoir son interaction avec Keap-1. Nous avons posé l’hypothèse selon laquelle l’angptl2 causait un stress oxydant chronique, d’abord en stimulant en aigu la production de DRO, puis en inhibant la voie antioxydante Nrf2. Nous avons étudié, par immunobuvardage de type Western sur des cellules endothéliales en culture (HUVEC), les effets de l’angptl2 recombinante (100 nM) sur les niveaux protéiques nucléaires de Nrf2, les niveaux de Keap-1 dans le cytosol et de DJ-1 dans le noyau, en absence et en présence de l’antioxydant NAC (10 μM). Nous avons également étudié l’activation de la p38MAPK. Les niveaux nucléaires de Nrf2 n’ont pas été affectés par la stimulation aigüe (10 min) à l’angptl2 recombinante, mais ont été diminués par la stimulation chronique (24 h). L’ajout d’un agent antioxydant n’a pas altéré l’effet chronique, indiquant que les DRO ne sont pas directement impliqués. Les niveaux protéiques cytosoliques de Keap-1, protéine inhibitrice de Nrf2, et les niveaux nucléaires de DJ-1, protéine stabilisatrice de Nrf2, n’ont pas été affectés par l’angptl2 de manière significative. La phosphorylation de la p38MAPK n’a pas été non plus affectée par la stimulation aigüe ou chronique à l’angptl2. Ces données suggèrent que l’angptl2 n’a pas d’effet aigu, mais a un effet chronique inhibiteur sur la voie Nrf2, qui n’est pas associé à un effet sur Keap-1, DJ-1 ou p38MAPK.

Rôle de l'autophagie dans la dissémination du VIH-1 par les cellules dendritiques dérivées des monocytes circulants

Les cellules myéloïdes incluant les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs, dendritic cells) contribuent à la pathogénèse de l’infection à VIH-1 en participant à la dissémination du virus, mais également en représentant des réservoirs viraux potentiels. Leurs fonctions sont exploitées par le VIH-1 afin d’assurer sa propagation à travers l’organisme. Notamment, une infection à VIH-1 est associée à une altération de la présentation antigénique et la perte de lymphocytes T CD4+ spécifiques à des antigènes. L’autophagie est un processus catabolique universel impliqué dans la régulation de la présentation antigénique subséquente à la neutralisation/destruction du pathogène. Des études récentes suggèrent que le VIH-1 altère le mécanisme d’autophagie afin d’assurer sa survie. Le premier volet de ce projet de maîtrise a visé la caractérisation des effets du VIH-1 sur l’autophagie dans les DCs dérivées de monocytes circulants (MDDC, monocyte-derived dendritic cells) et l’identification des stratégies thérapeutiques pour contrecarrer ces effets. Les objectifs spécifiques ont été de : (i) caractériser l’expression de marqueurs de maturation sur des MDDC exposées au VIH-1 in vitro, (ii) quantifier l’expression des protéines liées à la régulation positive (i.e., ATG5, LC3, p62) et négative (i.e., mTOR) de l’autophagie dans les MDDC exposées au VIH, (iii) déterminer le rôle de l’autophagie dans la trans infection du VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ et (iv) explorer l’impact de l’autophagie sur la présentation antigénique par les MDDC infectées à VIH-1 in vitro. Nos résultats démontrent qu’une exposition des MDDC au VIH-1 in vitro altère dramatiquement leur maturation et leur habileté à induire la prolifération des cellules T autologues en réponse à Staphylococcus aureus et Cytomegalovirus (CMV) mais pas la réponse induite par Staphylococcal enterotoxin B (SEB). Nous démontrons que l’exposition des MDDC au VIH s’associe à une augmentation de l’expression de la protéine mTOR totale et de sa forme phosphorylée (phospho-mTOR) et de la protéine p62. Le traitement des MDDC à la rapamycine diminue l’expression de mTOR et réduit la capacité de trans infection du VIH-1 par les MDDC, sans toutefois restaurer leur potentiel immunogène. En effet, nous observons que la rapamycine réduit l’expression de CD83 par les MDDC et augmente l’expression de CCR7, indiquant ainsi que l’effet immunosuppresseur documenté de la rapamycine est associé à une défaillance de maturation des MDDC. Le second volet de ce projet de recherche s’est intéressé à la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale chez les sujets infectés par le VIH-1 sous thérapie antirétrovirale. Les objectifs spécifiques ont été : (i) d’évaluer la présence de différentes formes d’ADN viral dans les monocytes circulants de patients infectés par le VIH-1 et (ii) de mesurer l’intégration et la réplication virale dans des macrophages dérivés de monocytes (MDM) de patients infectés sous ART. Nos résultats indiquent que les monocytes portent des formes précoces de transcription virale inverse (ADN du VIH RU5) et que, malgré une charge virale plasmatique indétectable sous ART, les MDM supportent la réplication virale. Ces données très préliminaires apportent des évidences en faveur de la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale sous ART et représentent une ouverture pour un projet de recherche plus complexe dans le futur. En somme, nos résultats démontrent que le VIH-1 altère le potentiel immunogène des MDDC et que la rapamycine peut être employée pour limiter la trans infection des lymphocytes T CD4+ par les MDDC. Néanmoins, l’incapacité de la rapamycine à rétablir le potentiel immunogène des MDDC incite à identifier de nouvelles stratégies manipulant l’autophagie pour une restauration optimale de la compétence immunitaire chez les sujets infectés à VIH-1. Les cellules myéloïdes jouent un rôle primordial dans la dissémination et la persistance virale et doivent donc être ciblées par les stratégies actuelles d’éradication des réservoirs du VIH sous ART.

Impact de la maladie du greffon contre l’hôte sur la reconstitution immunitaire suite à une transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques

La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (ASCT) est couramment utilisée pour traiter différents cancers hématologiques. Malheureusement, l’effet bénéfique de cette technique est limité par la réaction du greffon contre l’hôte (GVHD) qui demeure la cause principale de mortalité post-greffe. La GVHD endommage différents organes et retarde la reconstitution immunitaire des lymphocytes T (LT) ce qui augmente les risques d’infection et de rechute. Le développement de nouveaux traitements permettant d’accélérer la reconstitution immunitaire augmenterait donc les chances de survie des patients greffés. Il existe deux façons de régénérer des LT: via la thymopoïèse qui consiste à produire de nouveaux LT, ou par la prolifération homéostatique (PH) qui implique l’expansion rapide des LT matures retrouvés dans le greffon. La PH requiert deux signaux essentiels: l’interleukine-7 (IL-7) et la présentation d’antigènes du soi par les cellules dendritiques (DC) via le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) I pour les LT CD8+ et le CMH II pour les LT CD4+. Dans un contexte d’ASCT, la chimiothérapie et la GVHD endommagent le thymus rendant la thymopoïèse inefficace. Par conséquent, la reconstitution immunitaire repose presque entièrement sur la PH des LT. L’objectif de cette thèse était de comprendre comment la GVHD affecte la reconstitution des LT. Grâce à un modèle murin, nous avons démontré que la PH des LT CD4+ est absente durant la GVHD et ce, dû à de faibles niveaux d’IL-7 et une diminution du nombre de DC. La perte des DC est en grande partie causée par des niveaux réduits de stromal derived factor-1α (SDF-1α) et par l’absence de progéniteurs de DC dans la moelle osseuse des souris en GVHD. Le traitement des souris en GVHD avec du SDF-1α permet d’augmenter le nombre de DC, et lorsqu’administré avec l’IL-7, améliore significativement la PH des LT CD4+. Contrairement aux LT CD4+, l’administration d’IL-7 seule est suffisante pour restaurer la PH des LT CD8+ durant la GVHD et ce, même en absence des DC. Ces différences s’expliquent pour deux raisons : 1) l’expression du CMH I, contrairement au CMH II, n’est pas limitée aux DC mais est également exprimée par les cellules stromales du receveur ce qui est suffisant pour induire la PH des LT CD8+ et 2) les LT CD8+ répondent à des concentrations plus faibles d’IL-7 systémique comparativement aux LT CD4+. En conclusion, l’ensemble de ces résultats permettra de mettre en place des études translationnelles sur le potentiel thérapeutique du SDF-1α et de l’IL-7 dans la reconstitution immunitaire des patients greffés.