Cell locations AQP1, AQP4 and 9 in the non-human primate brain

Rapport de synthèse : La présence de trois canaux d'eau, appelés aquaporines AQP1, AQP4 et AQP9, a été observée dans le cerveau sain ainsi que dans plusieurs modèles des pathologies cérébrales des rongeurs. Peu est connu sur la distribution des AQP dans le cerveau des primates. Cette connaissance sera utile pour des futurs essaies médicamenteux qui visent à prévenir la formation des oedèmes cérébraux. Nous avons étudié l'expression et la distribution cellulaire des AQP1, 4 et 9 dans le cerveau primate non-humain. La distribution des AQP4 dans le cerveau primate non-humain a été observée dans des astrocytes périvasculaires, comparable à l'observation faite dans le cerveau du rongeur. Contrairement à ce qui a été décrit chez le rongeur, l'AQPI chez le primate est exprimée dans les processus et dans les prolongations périvasculaires d'un sous-type d'astrocytes, qui est avant tout localisé dans la matière blanche et dans la glia limitans et qui est peut-être impliqué dans l'homéostasie de l'eau. L'AQPI a aussi été observée dans les neurones qui innervent des vaisseaux sanguins de la pie-mère, suggérant un rôle possible dans la régularisation de la vascularisation cérébrale. Comme décrit chez le rongeur, le mRNA et les protéines de l'AQP9 ont été détectés dans des astrocytes et dans des neurones catécholaminergiques. Chez le primate, des localisations supplémentaires ont été observées dans des populations de neurones placées dans certaines zones corticales. Cet article décrit une étude détaillée sur la distribution des AQP1, 4 et 9 dans le cerveau primate non-humain. Les observations faites s'additionnent aux data déjà publié sur le cerveau du rongeur. Ces importantes différences entre les espèces doivent être considérées dans l'évaluation des médicaments qui agiront potentiellement sur des AQP des primates non-humains avant d'entrer dans la phase des essais cliniques sur des humains.

Linking microtubules to the activation of CDC42 in fission yeast

Cell polarity is an essential property of most cell types and relies on a dynamic cytoskeleton of actin filaments and microtubules. In rod-shaped S. pombe cells microtubules are organized along the length of the cell and transport polarity factors to cell tips to regulate cell polarity. An important cell polarity factor is the protein Tea4, which is responsible for correct cell morphogenesis and bipolar growth. During my research I confirmed the known transport mechanism of Tea4 and I also showed alternative localization and anchoring mechanisms at the cell ends. Tea4 contains a conserved SH3 domain, the function of which was unknown and my results show that the SH3 domain of Tea4 is essential for Tea4 function in vivo. First, cells with tea4SH3 mutations show aberrant cell shapes and monopolar growth patterns similar to tea4A and in addition SH3 domain is important for proper localization of multiple cell polarity proteins. Second, I showed that Tea4 associates with Type 1 Phosphatase Dis2 through both its SH3 domain and an RVxF motif. Tea4 also binds the DYRK kinase Pomi through its SH3 domain. In addition Tea4 is proposed to promote the local dephosphorylation of Pomi by Dis2 to induce the formation of a cortical gradient from cell ends essential for cell size homeostasis. Polarized growth is also controlled by cell tip-localized Cdc42. This Rho- family GTPase is activated by the Guanine Exchange Factors Gef1 and Scd1 and inactivated by the Rho GTPase Activating Protein Rga4. In this study, I investigated the mechanisms of how Tea4 promotes Cdc42 activation. My work suggests that Tea4 promotes the local exclusion of Rga4, which in turn allows the accumulation of active Cdc42, which may result in growth. Exclusion of Rga4 by Tea4 is likely to be mediated by Dis2-dependent dephosphorylation. These results suggest a molecular pathway that links the microtubule- associated factor Tea4 with Cdc42 to promote cell polarization and morphogenesis. - La polarité cellulaire est une propriété essentielle de la plupart des types cellulaires et s'appuie sur une dynamique des cytosquelettes d'actine et de microtubules. Dans les cellules en forme de bâtonnet de S. pombe les microtubules sont alignés selon l'axe longitudinal de la cellule et les facteurs de polarité transportés aux extrémité cellulaires afin de réguler la polarité cellulaire. Un facteur important de polarité cellulaire est la protéine Tea4, qui est responsable de la morphogenèse des cellules et leur croissance bipolaire. Au cours de mes recherches, j'ai confirmé les mécanismes connus de transport de Tea4 et j'ai aussi mis en évidence d'autres mechanismes de localisation et d'ancrage de Tea4 aux extrémités cellulaires. Tea4 contient un domaine SH3 conservé, dont la fonction était inconnue et mes résultats montrent que le domaine SH3 est essentiel pour la fonction de Tea4 in vivo. Tout d'abord, les cellules avec des mutations tea4sm ont des formes aberrantes et leur croissance est monopolaire de manière similaire au mutant tea4A. De plus ce domaine SH3 est important pour la localisation correcte de plusieurs protéines de polarité cellulaire. Deuxièmement, j'ai montré que Tea4 s'associe avec la Phosphatase de Type-1 Dis2 par son domaine SH3 et un motif RVxF. Tea4 se lie également la kinase DYRK Pomi par son domaine SH3. De plus, Tea4 pourrait favoriser la déphosphorylation locale de Pomi par Dis2 afin d'induire la formation d'un gradient cortical de Pomi essentiel pour l'homéostasie de la longueur des cellules. La croissance polarisée est également contrôlée par la protéine Cdc42 localisée aux extrémités cellulaires. Cette GTPase de la famille de Rho GTPase est activée par les facteurs échange de guanine Gef1 et Scd1 et inactivée par la protéine "Rho GTPase activating" Rga4. Dans cette étude, j'ai étudié les mécanismes d' activation de Cdc42 par Tea4. Mes résultats suggèrent que Tea4 favorise l'exclusion locale de Rga4, ce qui permet l'accumulation de Cdc42 active, nécessaire à la croissance. L' exclusion de Rga4 par Tea4 est vraisemblablement médiée par une déphosphorylation Dis2- dépendente. Ces résultats suggèrent une voie moléculaire qui lie le facteur associé aux microtubules Tea4 à Cdc42 pour promouvoir la polarisation cellulaire et la morphogenèse. - Cell polarity is important for several essential biological functions such as generation of distinct cell fates during development and function of differentiated cells. Defective cell polarity has been related to uncontrolled cell division and subsequently to cancer initiation. Cell polarity depends on a functional cytoskeleton that consists of actin filaments and microtubules, which maintains cell shape, helps cellular motion, enables intracellular protein transport and plays a vital role in cell division. A component of cytoskeleton is microtubules that regulate cell polarization in diverse cell types. During my research, I worked with Schizosaccharomyces pombe, also named fission yeast, a powerful unicellular model organism that allows combination of genetic, biochemical and microscopic analysis for the proper study of cell polarity. Microtubule-associated protein Tea4 is transported to cell tips where it is thought to organize polarized growth. I showed that Tea4 and its evolutionarily conserved SH3 domain play an important role for maintenance of fission yeast cells shape and growth. Furthermore, Tea4 is responsible for the proper localization of multiple polarity proteins and acts as a mediator to control the local activity of an essential polarity regulator called Cdc42. Thus, my results provide a better understanding of the molecular mechanisms that regulate cell polarity. - La polarité cellulaire est importante pour plusieurs fonctions biologiques essentielles telles que la différenciation cellulaires au cours du développement et de la fonction de cellules différenciées. Les défauts de la polarité cellulaire ont été liés à des divisions cellulaires incontrôlées et à l'initiation de tumeur. La polarité cellulaire dépend d'un cytosquelette fonctionnel, qui maintient la forme des cellules, aide à la migration cellulaire, permet le transport intracellulaire des protéines et joue un rôle essentiel dans la division cellulaire. Un composant du cytosquelette est constitué de microtubules qui régissent la polarisation cellulaire dans divers types cellulaires. Au cours de mes recherches, j'ai travaillé avec Schizosaccharomyces pombe, appelé également levure fissipare, un modèle unicellulare puissant qui permet la combinaison de différentes d'approches expérimentales: génétiques, biochimiques et microscopiques pour l'étude de la polarité cellulaire. La protéine Tea4 associée aux microtubules est transportée aux extrémités cellulaires où elle organise la croissance polarisée. J'ai montré que Tea4 et son domaine conservé SH3 jouent un rôle important pour le maintien de la forme des cellules de levure et leur croissance. De plus, Tea4 est responsable de la localisation correcte de multiples facteurs de polarité et agit comme un médiateur pour contrôler l'activité locale d'un régulateur de polarité essentiel appelé Cdc42. Ainsi, mes résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la polarité cellulaire.

Characterization of the expression, regulation and function of Sorting Nexin 9 and Sorting Nexin 18

Summary : Sorting nexin (SNX) family members play important roles in intracellular protein and membrane trafficking, The membrane-tubulating SNX9 protein has been shown to interact with multiple components of the endocytic machinery and to participate in clathrin-mediated endocytosis of cell surface receptors. It has not been investigated if SNX9 may also participate in other protein sorting pathways that involve vesicular transport, specifically the biogenesis of lysosome-related organelles (LROs). Closely related to SNX9 is SNXl8, whose function is largely unknown. In this work, we have characterized the expression of SNX9 and SNXl8 in LRO-containing cells and investigated their role in protein trafficking during the formation of LROs. Our results indicate that SNX9 and SNXl8 are not essential for the formation of LROs, nor for the sorting of melanosomal proteins. We investigated how the level of intracellular SNX9 protein is regulated and found that it is a substrate of the ubiquitin ligase Itch, a member of the NEDD4 family of E3 ubiquitin ligases. Itch ubiquitylates SNX9 and regulates SNX9 levels by enhancing its degradation. Using ? truncated proteins we found that the interaction with SNX9 is mediated by the proline-rich domain of Itch, a domain distinct from the conventional WW recognition domain, and the SH3 domain of SNX9. Interaction with the PRD of Itch is essential for SNX9 ubiquitylation and degradation. We further showed that Itch binding is not affected by tyrosine phosphorylation of SNX9. Using lentivector-mediated siRNA techniques, we found that Itch regulates the level of melanosomal proteins, while knock-down of SNX9 does not alter their level. Interestingly, we revealed that silencing of SNXIS affects the amount of the melanosomal protein Melan-A, but also of SNX9, and that SNXl8 can interact with SNX9. Taken together, our results highlight that the pool of substrates of NEDD4 family E3 ligases extends to proteins containing SH3 domains and provide insight into the potential functions of SNXI8. Résumé : Les membres de la famille des Sorting Nexins (SNX) jouent des rôles importants dans le trafic intracellulaire de protéines et membranes. Il a été démontré que la protéine SNX9, qui génère les tubules membranaires, interagit avec plusieurs composants de la machinerie d'endocytose et participe à l'endocytose des récepteurs de surface mediée par la clathrine. Aucune étude n'a investigué si SNX9 pourrait aussi participer à d'autres voies de trafic de protéines tel que le transport vésiculaire, et plus particulièrement la biogenèse des organites lysosomaux ("lysosome-related organelles", LR©s). SNXl8 est similaire à SNX9, mais sa fonction est largement inconnue. Dans ce travail, nous avons caractérisé l'expression de SNX9 et SNX18 dans des cellules contenants des LROs et investigué leur rôle dans le trafic de protéines pendant la formation des LROS. Nos résultats indiquent que SNX9 et SNXI8 ne sont essentiels ni pour la formation des LR©s, ni pour le trafic de protéines mélanosomales. Nous avons examiné la régulation du niveau intracellulaire de la protéine SNX9 et avons trouvé qu'elle est un substrat de l'ubiquitine ligase Itch, un membre de la famille NEDD4 des ubiquitine ligases E3. Itch ubiquitine SNX9 et régule les niveaux de SNX9 en augmentant sa dégradation. En utilisant des protéines mutées nous avons découvert que l'interaction avec SNX9 est médiée par le domaine riche en proline de Itch, qui est différent du domaine conventionnel de reconnaissance WW, et par le domaine SH3 de SNX9. L'interaction avec le domaine riche en proline de Itch est essentielle pour l'ubiquitination et la dégradation de SNX9. De plus, nous avons montré que cette liaison n'est pas affectée par la phosphorylation des résidus tyrosine de SNX9. En utilisant des vecteurs lentiviraux exprimant des siARN, nous avons trouvé que Itch régule les niveaux de protéines mélanosomales, alors que l'extinction de l'expression de SNX9 ne change pas leurs niveaux. En autre, nous avons révélé que la diminution de SNXl8 affecte le niveau de la protéine mélanosomale Melan-A et de SNX9, et aussi que SNXl8 peut interagir avec SNX9. En résumé, nos résultats démontrent que l'ensemble des substrats de la famille NEDD4 des ubiquitine ligases E3 s'élargit aux protéines contenant des domaines SH3 et ouvrent des perspectives sur les fonctions potentielles de SNXl8.

Organisation and role of actin microfilaments during cellular growth and morphogenesis in the moss Physcomitrella patens

ABSTRACT The network of actin cytoskeleton is composed of actin filaments (F-actin) that are made by polymerisation of actin monomers and actin binding proteins. It is required for growth and morphogenesis of eukaryotic cells. The labelling of F-actin with constitutively expressed GFP-Talin (Kost et al., 1998) reveals the organisation of cellular actin networks in plants. Due to the lack of information on actin cytoskeleton through gametophytic development of the model moss plant Physcornitrella patens, stable transgenic lines overexpressing GFP-Talin were generated to detect F-actin structures. It is shown that the 35S promoter driven expression is not suitable for F-actin labelling in all cells. When it is replaced by the inducible heat-shock promoter Gmhsp17.3 from soybean, one hour mild heat stress at 37°C followed by recovery at 25°C is enough to induce efficient and transient labelling in all tissues without altering cellular morphology. The optimal observations of F-actin structures at different stages of moss development can be done between 12-18 hours after the induction. By using confocal microscopy, we demonstrate that stellated actin arrays were densely accumulated at the growing tip in regenerating protoplasts, apical protonemal cells and rhizoids and connected with a fine dispersed F-actin mesh. Following three-dimensional growth, the cortical star-like structures are widespread in the meristematic cells of developing bud and young gametophores. On the contrary, undulating networks of actin cables are found at the final stage of cell differentiation. During redifferentiation of mature leaf cells into protonemal filaments the rather stagnant web of actin cables is replaced by diffuse actin meshwork. In eukaryotes, nucleation of the actin monomers prior to their polymerization is driven by the seven-subunit ARP2/3 complex and formins. We cloned the gene encoding the ARP3 subunit of P. patens and generated arp3 mutants of the moss through gene disruption. The knockout of ARP3 affects the elongation of chloronemal cells and blocks further differentiation of caulonemal cells and rhizoids, and the gametophores are slightly stunted compared to wild-type. The arp mutants were created in the heat-shock inducible GFP-Talin strains allowing us to visualise a disorganised actin network and a lack of star-like actin cytoskeleton arrays. We conclude that ARP2/3 dependent nucleation of actin filaments is critical for the growth of filamentous cells, which in turn influences moss colonization. In complementation assays, the overexpression of Physcomitrella and Arab idopsis ARP3 genes in the moss arp3 mutant results in full recovery of wild type phenotype. In contrast the ARP3 subunit of fission yeast is not able to complement the moss arp3 mutant of moss indicating that regulation of the ARP2/3 dependent actin nucleation diverged in different kingdoms. RESUME Le réseau d'actine est composé de filaments de F-actine et d'un ensemble de protéines s'y attachant (Actin binding proteins). Le réseau d'actine est nécessaire à la croissance et à la morphogenèse de toutes les cellules eucaryotes. Chez les plantes, le marquage ainsi que l'étude de l'organisation du réseau d'actine ont été réalisés en utilisant une fusion GFP-Talin (Kost et al., 1998) exprimée sous le control d'un promoteur constitutif. Afin d'étudier les structures F-actine dans les cellules de Physcomitrella Patens et pour combler le manque d'information sur le développement des gamétophores, des lignées transgéniques stables surexprimant GFP-Talin ont été crées. Nous avons démontré que l'utilisation du promoteur 35S est inadéquate pour le marquage complet et homogène des filaments d'actine dans toutes les cellules de P. patens. Par contre, l'utilisation du promoteur inductible Gmhsp17.3 nous a permis de réaliser un marquage transitoire et général dans tous les tissus de la mousse. Une heure de choc thermique à 37°C suivis d'un temps de récupération de 12-18h à 25°C sont les conditions optimales (sans dommages cellulaires) pour l'observation des structures F-actine à différentes étapes de développement de la mousse. En utilisant la microscopie confocale, nous avons observé l'existence de structures F-actine accumulées en forme d'étoiles. Ces structures, qui sont liées au réseau de microfilaments d'actine, ont été observées dans les protoplastes en régénération, les cellules des protonema apicales ainsi que dans les rhizoïdes. En suivant la croissance tridimensionnelle, ces structures en étoiles ont été observées dans les cellules meristématiques des bourgeons et des jeunes gamétophores. Par contre, dans les cellules différentiées ces structures laissent place à des réseaux de câbles épais. Nous avons également remarqué que durant la redifferentiation des cellules foliaires le réseau de câbles de F-actine est remplacé par un réseau de F-actine diffus. Dans les cellules eucaryotes, la nucléation des filaments d'actirie précédant leur polymérisation est contrôlé par sept sous unités du complexe ARP2/3 et par des formines. Nous avons isolé le gène codant pour la sous unité ARP3 de P. patens et nous avons crée des mutants arp3 par intégration ciblée (Knockout). L'élongation des cellules chloronema est clairement affectée dans les mutants arp3. La différentiation des caulonemata et des rhizoïdes est bloquée et les gametophores sont légèrement plus courts comparé au type sauvage. A fin d'étudier l'organisation des filaments d'actines dans les mutants arp3, nous avons aussi réalisé un arp3-knockout dans la lignée Hsp-GFP-Talin. La nouvelle lignée générée nous a permis de visualiser une désorganisation du réseau d'actine et une absence complète de structures de F-actine accumulée en forme d'étoiles. Les résultats obtenus nous amènent à conclure que la nucléation (ARP2/3 dépendante) des filaments d'actine est indispensable à la croissance des cellules filamenteuses. Par conséquent, les filaments d'actine semblent avoir un rôle dans la colonisation des milieux par les mousses. Nous avons également procédé à des essais de complémentation du mutant arp3. La surexpression des gènes ARP3 de Physcomitrella et d'Arabidopsis dans les cellules du mutant arp3 rétabli complètement le phénotype WT. Par contre, le gène ARP3 des levures n'est pas suffisant pour complémenter la même mutation dans les cellules de mousses. Ce résultat démontre que les mécanismes de régulation de la nucléation des filaments d'actine (ARP2/3 dépendante) sont différents entre les différents groupes d'eucaryotes.

Lymphoid stroma in health and disease

Summary Secondary lymphoid organs (SLOB), such as lymph nodes and spleen, are the sites where primary immune responses are initiated. T lymphocytes patrol through the blood and SLOs on the search for pathogens which are presented to them as antigens by dendritic cells. Stromal cells in the Tzone - so called T zone fibroblastic reticular cells (TRCs) -are critical in organizing the migration of T cells and dendritic cells by producing the chemoattractants CCL19 and CCL21 and by forming a network which T cells use as a guidance system. They also form a system of small channels or conduits that allow rapid transport of small antigen molecules or cytokines from the subcapsular sinus to high endothelial venules. The phenotype and function of TRCs have otherwise remained largely unknown. We found a critical role for lymph node access in CD4+ and CD8+ T cell homeostasis and identified TRCs within these organs as the major source of interleukin-7 (IL-7). IL-7 is an essential survival factor for naïve T lymphocytes of which the cellular source in the periphery had been poorly defined. In vitro, TRC were able to prevent the death of naïve T but not of B lymphocytes by secreting IL-7 and the CCR7 ligand CCL 19. Using gene-targeted mice, we show anon-redundant function of CCL19 in T cell homeostasis. The data suggest that TRCs regulate T cell numbers by providing a limited reservoir of survival factors for which T cells have to compete. They help to maintain a diverse T cell repertoire granting full immunocompetence. To determine whether TRCs also play a role in pathology, we characterized so-called tertiary lymphoid organs (TLOs) that often develop at sites of chronic inflammation. We show that TLOs resemble lymph nodes or Peyer's patches not only with regard to lymphoid cells. TLOs formed extensive TRC networks and a functional conduit system in all three marine inflammation models tested. In one model we dissected the cells and signals leading to the formation of these structures. We showed that they critically depend on the presence of lymphotoxin and lymphoid tissue inducer cells. TRCs in TLOs also produce CCL19, GCL21 and possibly IL-7 which are all involved in the development of TLOs. Stromal cells therefore play a central role in the onset and perpetuation of chronic inflammatory diseases and could be an interesting target for therapy. Résumé Le système immunitaire est la défense de notre corps contre toutes sortes d'infections et de tumeurs. II est constitué de différentes populations de lymphocytes qui patrouillent constamment le corps à la recherche de pathogène. Parmi eux, les lymphocytes T et B passent régulièrement dans les organes lymphoïdes secondaires (SLO) qui sont les sites d'initiation de la réponse immunitaire. Les lymphocytes T sont recrutés du sang aux SLO où ils cherchent leur antigène respectif présenté par des cellules dendritiques. Des cellules stromales dans la zone T -nommées fibroblastic reticular cells' (TRC) -sécrètent des chimiokines CCL19 et CCL21 et ainsi facilitent les rencontres entre lymphocytes T et cellules dendritiques. De plus, elles forment un réseau que les lymphocytes T utilisent comme système de guidage. Ce réseau forme des petits canaux (ou conduits) qui permettent le transport rapide, d'antigène soluble ou de cytokines, de la lymphe aux veinules à endothelium épais (HEV). Le phénotype ainsi que les autres fonctions des TRCs demeurent encore à ce jour inconnus. Nous avons trouvé que l'accès des lymphocytes T CD4+ et CD8+ aux ganglions joue un rôle central pour l'homéostasie. Interleukin-7 (IL-7) est un facteur de survie essentiel pour les lymphocytes T naïfs dont la source cellulaire dans la périphérie était mal définie. Nous avons identifié les TRCs dans les ganglions comme source principale d'interleukin-7 (IL-7). In vitro, les TRCs étaient capable de prévenir la mort des lymphocytes T mais pas celle de lymphocytes B grâce à la sécrétion d'IL-7 et de CCL19. En utilisant des souris déficientes du gène CCL19, nous avons observé que l'homéostasie des lymphocytes T dépend aussi de CCL19 in vivo. Les données suggèrent que les TRCs aident à maintenir un répertoire large et diversifié de cellules T et ainsi l'immunocompétence. Pour déterminer si les TRCs pourraient jouer un rote également dans la pathologie, nous avons caractérisé des organes lymphoïdes tertiaires (TLOs) souvent associés avec l'inflammation chronique. Les TLOs ressemblent à des ganglions ou des plaques de Peyer pas seulement en ce qui concerne la présence de lymphocytes. Nous avons constaté que les TLOs forment des réseaux de TRC et un système fonctionnel de conduits. La formation de ces structures est fortement diminuée dans l'absence du signal lymphotoxin ou des cellules connues comme ymphoid tissue-inducer tells: Les TRCs dans les TLOs produisent les chimiokines CCL19, CCL21 et possiblement aussi IL-7 qui sont impliquées dans le développement des TLOs. Les cellules stromales jouent donc un rôle central dans l'initation et la perpétuation des maladies inflamatoires chroniques et pourraient être une cible intéressante pour la thérapie.

Pregnancy-associated changes in host permissiveness to metastasis

THESIS SUMMARY : Metastasis is a multistep process involving tumour cell-autonomous features, the host tissue stroma of the primary tumour, the blood or lymphatic system as well as a receptive target organ. Most studies on factors influencing metastasis have concentrated on the characteristics of the disseminating tumour cell and on early steps of metastasis including invasion and angiogenesis. Although these steps are necessary for tumour cells to disseminate, it is the challenges encountered in the later steps of metastasis -survival while in the circulation and engraftment and outgrowth in the target organ -that account for the inefficiency of circulating tumour cells in establishing secondary lesions. Full understanding of the metastatic process therefore requires elucidation of the mechanisms that regulate these late steps, and in particular that determine what makes any given tissue permissive for metastatic tumour growth. To address this issue, we assessed the mechanisms whereby a physiological situation -pregnancy -can alter host permissiveness toward metastasis. We show that pregnant NOD/SCID mice -injected intravenously with tumour cells -develop more metastases than their non-pregnant counterparts irrespective of the tumour cell type. There was no direct effect of pregnancy-related circulating factors on tumour cell proliferation, and subcutaneous tumour growth does not vary between pregnant and nonpregnant animals. However, decreased elimination of tumour cells from the lung microvasculature was observed in pregnant mice, prompting us to assess whether pregnancy-related adaptations in innate immunity could account for this differential clearing. We found that natural killer (NK) cell fractions are decreased in blood and spleen of pregnant mice and that NK cell cytotoxicity is impaired, as reported previously. The use of NK-deficient mice or tumour cell lines resistant to NK killing abrogates the difference in metastasis load between pregnant and virgin mice. CD11 b+ Gr-1+ myeloid-derived suppressor cells (MDSC) have previously been shown to accumulate in tumour-bearing mice and to down-modulate NK activity. Accordingly, we show an increase in MDSC in pregnant mouse blood, spleen, lungs and liver. Depletion of MDSC prior to tumour cell injection decreased metastasis load in pregnant NOD/SCID mice but had no effect on virgin mice. Similarly, adoptive transfer of MDSC extracted from pregnant mice into virgin mice lead to increased metastasis take. In parallel, we investigated whether the lung and liver microenvironments are modified during pregnancy thereby providing a more "permissive soil" for the establishment of metastases. A comparative analysis of microarray data of pregnant mouse lungs and liver with "premetastatic niche" gene expression profiles of these organs shows that similar mechanisms could mediate an increase in lung and liver metastasis in pregnant mice and in mice harbouring an aggressive primary tumour. Several commonly up-regulated genes point towards the recruitment of myeloid cells, consistent with the accumulation of MDSC observed in pregnant mice. MDSC have never been evoked in the context of pregnancy before. Although the role of MDSC in pregnancy requires further investigation we suggest that MDSC accumulation constitutes an important and hitherto unrecognised common denominator of maternal immune tolerance and cancer immune escape. RESUME DE THESE : La métastatisation est un processus en plusieurs étapes qui implique des compétences particulières chez les cellules tumorales, le stroma de la tumeur primaire, les vaisseaux sanguins ou lymphatiques ainsi qu'un organe cible' réceptif. Jusqu'alors, la recherche s'est principalement intéressée aux facteurs qui influencent les étapes précoces de la métastatisation donc aux caractéristiques de la cellule métastatique, et aux processus tels que l'invasion et l'angiogenèse, tandis que peu d'études traitent des étapes tardives tel que la survie dans la circulation sanguine et l'établissement d'une lésion dans l'organe cible. En particulier, l'élucidation des facteurs qui déterminent la permissivité d'un tissu à la greffe de cellules disséminantes est indispensable à la compréhension de ce processus complexe qu'est la métastatisation. Nous proposons ici un modèle de souris récapitulant les étapes tardives de la métastatisation dans un contexte d'une permissivité accrue aux métastases chez la souris gravide, et nous évaluons les mécanismes impliqués. Les souris gestantes développent plus de métastases après l'injection intraveineuse de cellules tumorales, indépendamment du type de tumeur d'origine. Les taux élevés d'hormones et de facteurs de croissance chez la souris gravide n'inflúencent pas la prolifération des cellules tumorales et fa croissance de tumeurs sous-cutanées n'est pas non plus accélérée par la gestation. En revanche, une fois injectées, les cellules tumorales sont éliminées ` moins rapidement des vaisseaux pulmonaires chez la souris gravide que chez les contrôles. Cette observation est compatible avec un effet de la gestation sur l'immunité innée et nous avons mis en évidence une diminution des proportions de cellules NK (natural killer) dans le sang et la rate en particulier, ainsi qu'une cytotoxicité moindre envers des cellules tumorales. En utilisant des souris déficientes en cellules NK ou en injectant des cellules résistantes à l'attaqué par des cellules NK, la différence entre souris gestantes et non-gestantes disparaît. Il a été démontré chez des souris porteuses de tumeurs, que l'accumulation de cellules immunosuppressives de la lignée myélo-monocytaire (ou MDSC pour myeloid-derived suppressor tells) pouvait être responsable d'une inhibition de l'activité de cellules NK. Des nombres augmentés de ces cellules, caractérisées par les marqueurs de surface CD11b et Gr-1, ont été trouvés dans le sang, la rate, les poumons et le foie de souris gravides. Leur rôle dans la métastatisation est démontré par le fait que leur dépletion diminue le nombre de lésions secondaires chez la souris gestante, tandis que leur transfert dans des souris non-gestantes augmente le taux de métastases. L'utilisation de puces à ADN sur les foies et poumons de souris gravides a permis de mettre en évidence des différences d'expression génique proches de celles observées dans l'établissement de niches pré-métastatiques. Ceci suggère que des mécanismes similaires pourraient être responsables d'une permissivité accrue aux métastases chez la souris gravide et chez la souris porteuse d'une tumeur primaire agressive, telle que, en particulier, l'accumulation de cellules immunosuppressives dans les organes cibles. C'est la première fois que l'accumulation de MDSC est évoquée chez la souris gravide et nous proposons ici que celles-ci jouent un rôle dans la tolérance immunitaire envers le foetus et sont responsables de l'échappement de cellules tumorales injectées à la surveillance immunitaire par des cellules NK.

Defining molecular components of symbiotic phosphate uptake in rice

Phosphate (Pi) acquisition of crops via arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis acquires increasing importance due to the limited rock Pi reserves and the demand for environmentally sustainable agriculture. However, the symbiotic Pi uptake machinery has not been characterized in any monocotyledonous plant species. Among these, rice is the primary staple food for more than half of the human population and thus central for future food security. However, the relevance of the AM symbiosis for rice Pi nutrition is presently unclear. Here, we show that 70% of the overall Pi acquired by rice is delivered via the symbiotic route. To better understand this pathway we combined genetic, molecular and physiological approaches to determine the specific functions of the two rice Pi transporters, PT11 and PT13, which are expressed only during AM symbiosis. The PT11 lineage of proteins is present in mono- and dicotyledons whereas PT13, while found across the Poaceae, is absent from dicotyledons. Surprisingly, mutations in either PT11 or PT13 affected fungal colonization and arbuscule formation demonstrating that both genes are essential for AM symbiosis between rice and Glomus intra.rad.ices. Importantly, for symbiotic Pi uptake, only PT11 is necessary and sufficient. We found that mycorrhizal rice, remarkably, received almost all Pi via the symbiotic route. Such dominating mycorrhizal Pi uptake was found in plants grown under controlled conditions as well as in field soils, suggesting that the AM symbiosis is relevant for the Pi nutrition of field grown rice. Development of smaller arbuscules in PT11 mutants suggested that symbiotic Pi signaling is required for fungal nourishment by the plant. However, co-culture of mutant with wild type nurse plants did not restore normal arbuscule size in mutant roots, indicating that other factors than malnutrition accounted for the altered arbuscule phenotype. Surprisingly, the loss of PT13 did not affect symbiotic Pi uptake although it impacted arbuscule morphology, suggesting that PT13 is involved in signaling during arbuscule development. However, induction of PT13 was not only monitored in arbusculated cells but also in inner cortex cells of non-inoculated roots of plants grown under high Pi fertilization conditions. According to preliminary observations, PT13 localized at the tonoplast in arbusculated and non-arbusculated cells, suggesting that it might be involved in transporting Pi into the vacuole, possibly for maintaining cellular Pi homeostasis. The further investigation showed that fungal colonization level was significantly affected in the crown roots of two ptlS mutant alleles, but not in large lateral roots, implying the possible role of PT13 for maintaining Pi homeostasis in the crown roots. - L'acquisition de phosphate (Pi) par les plantes cultivées s'effectue grâce à une symbiose mycorhizienne arbasculaire (AM). L'étude de cette symbiose devient fondamentale puisque d'une part, les réserves en phosphate minéral sont limitées, et, d'autre part, la demande pour une agriculture écologiquement soutenable se renforce. La machinerie d'absorption symbiotique du phosphate n'est cependant pas encore élucidée chez les plantes monocotylédones. Parmi celles-ci, le riz occupe une place primordiale. Aliment de base pour plus de la moitié de la population mondiale, il revêt de ce fait une dimension essentielle en termes de sécurité alimentaire. Pourtant, l'importance de la symbiose AM chez le riz dans le processus d'acquisition du phosphate n'est, encore de nos jours, que peu comprise. Dans cette étude, nous montrons que 70% du phosphate acquis par le riz est mis à disposition de la plante grâce à la symbiose AM. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, nous avons employé des approches physiologiques et génétiques nous permettant de déterminer les fonctions spécifiques de deux transporteurs de Pi, PT11 et PT13, présents chez le riz et exprimés uniquement durant la symbiose AM. La famille de gènes à laquelle appartient PT11 est présente chez les monocotylédones ainsi que chez les dicotylédones tandis que PT13, bien que retrouvé au sein des Poaceae, est absent chez les dicotylédones. Etonnamment, des versions mutées de PT11 ou de PT13 affectent la colonisation par le champignon endo-mycorhizien ainsi que la formation d'arbuscules, démontrant l'importance de ces deux gènes dans la symbiose AM entre le riz et Glomus intraradices. Il est à noter que seul PT11 se révèle nécessaire et suffisant pour l'apport de Pi grâce à la symbiose. Nous avons observé que la presque totalité du phosphate dont dispose le riz lors d'une symbiose AM provient du champignon. De telles proportions ont été observées tant chez des plantes cultivées en conditions contrôlées que chez des plantes cultivées dans les champs. Cela suggère l'importance de la symbiose AM dans le processus d'acquisition du Pi chez le riz cultivé à l'extérieur. Le développement d'arbuscules plus petits chez le mutant PT11 tend à montrer qu'une voie signalétique impliquant le Pi symbiotique est nécessaire pour l'entretien du champignon par la plante. Toutefois, une co-culture du mutant avec des plantes sauvages ne permet pas de restaurer des arbuscules de taille normale dans les racines du mutant. Ce résultat indique le rôle de facteurs autres que la malnutrition aboutissant à la formation d'arbuscules altérés. Si la perte de PT13 n'affecte pas l'acquisition de phosphate symbiotique, la morphologie de l'arbuscule est, quant à elle, modifiée. Ceci suggère un rôle de PT13 durant le développement de l'arbuscule. Or, l'induction de PT13 est non seulement détectée dans des cellules contenant des arbuscules mais également dans des cellules du cortex, ceci chez des plantes cultivées sans champignon mais dans des conditions de fortes concentrations en engrais phosphaté. En accord avec des observations précédentes, PT13 est localisé au niveau du tonoplaste des cellules contenant ou non des arbuscules. Ceci suggère que PT13 pourrait être impliqué dans le transport du Pi vers la vacuole, éventuellement pour maintenir une certaine homéostasie du phosphate. Dans cette étude, nous démontrons également que le niveau de colonisation par le champignon est affecté de manière significative dans les racines principales des deux allèles du mutants ptl3, mais pas dans les grosses racines latérales. Cela impliquerait un rôle possible de PT13 dans le maintien de l'homéostasie du phosphate dans les racines principales. RESUME POUR UN LARGE PUBLIC Le phosphate (Pi), l'un des éléments minéraux essentiel au développement des plantes, se trouve généralement en faible quantité dans le sol, limitant ainsi la croissance des plantes. Le rendement de la production agricole dépend dès lors de l'addition d'engrais contenant du phosphate inorganique (Pi), obtenu à partir de ressources minières riches en phosphate. Or, ces ressources devraient être épuisées d'ici la fin du siècle. Les racines des plantes possèdent des transporteurs de phosphate efficaces leur permettant d'acquérir rapidement le Pi présent dans le sol. Comme le Pi s'avère immobile dans le sol, l'absorption rapide par les racines crée des zones pauvres en Pi autour des systèmes racinaires. Pour surmonter cet obstacle, les plantes ont développé une symbiose avec des champignons endomycorhiziens, la symbiose mycorhizienne arbusculaire (AM). Cette association leur donne accès à d'autres ressources en phosphate puisque le mycélium de ces champignons se développe sur une surface 100 fois supérieure à celle des racines. Cela augmente considérablement la surface de nutrition, dépassant ainsi la zone appauvrie en Pi. Le phosphate, transporté grâce au champignon jusqu'à l'intérieur des racines, est fourni à la plante par le biais de structures établies à l'intérieur des cellules végétales, appelées arbuscules. De leur côté, les plantes possèdent des transporteurs spécifiques afin de recevoir le Pi fourni par les champignons. A l'heure actuelle, la machinerie nécessaire à cette absorption a été uniquement décrite chez des plantes dicotylédones. Or, comprendre l'apport de phosphate par les champignons mycorhiziens s'avère particulièrement pertinent dans le cas des espèces monocotylédones cultivées telles que les céréales. Ces dernières constituent en effet la majeure partie de l'alimentation humaine. Parmi les céréales, le riz demeure l'aliment de base de la population mondiale, d'où son importance en terme de sécurité alimentaire. Durant mon travail de thèse, j'ai identifié et caractérisé le transporteur du riz impliqué dans l'apport de phosphate par ce type de symbiose AM. J'ai également démontré que le riz, lorsqu'il vit en symbiose, bénéficie de la presque totalité du Pi transporté par le champignon. Environ 40% de la production globale de riz est cultivée dans des conditions permettant la symbiose avec des mycorhizes arbusculaires. Les variétés de riz adaptées à ces conditions aérobiques deviennent des alternatives favorables aux cultivars actuels nécessitant une forte irrigation. Elles se révèlent en effet plus tolérantes aux pénuries d'eau et permettent l'utilisation de pratiques agricoles moins intensives. Les données présentées dans cette étude enrichissent nos connaissances concernant l'absorption du phosphate chez le riz grâce à la symbiose AM. Ces connaissances peuvent s'avérer décisives pour le développement de cultivars du riz plus adaptés à une agriculture écologiquement soutenable.

The role of Notch receptors in T helper differentiation

After encountering antigens, naïve CD4+ Τ cells can differentiate into various effector Τ helper (Th) cell subsets, including CD4+ Thi, Th2, Thi7, regulatory Τ cells and the recently described follicular Τ helper cells (TFH cells). To date, most of the studies used either gain-of-function approaches that do not reflect the physiological Notch signaling intensity or loss-of-function models that block the entire Notch pathway. The contribution of single Notch receptors during Th differentiation occurring upon infection has not been investigated yet. In the present thesis, we wanted to assess the individual role of Notchi and Notch2 in Th differentiation, by using mice with Τ cell-specific deletion of Notchi, Notch2 or both (NiN2/iCD4Cre) in different models of infection/immunization.¦In the first part, we characterized the role of Notchi and Notch2 in Thi differentiation. We used experimental infection with the protozoan parasite Leishmania major, known to induce a protective Thi immune response in mice on the C57BL/6 background. Mice deficient for both Notchi and Notch2 developed unhealing lesions and were unable to control the parasite burden in their footpad. A profound defect in IFNy secretion by CD4+ Τ cells was shown to be responsible for the susceptibility of these mice. Although CD4+ Τ cells did not secrete IFNy following L. major infection, they exhibited higher IFNymRNA expression as well as higher frequency of CD4+IFNy+Τ cells in dLN. Altogether, these data indicate that Notch is dispensable for the differentiation of Thi cells expressing IFNy but controls, directly or not, the secretion of IFNy, allowing the development of a fully functional Thi immune response.¦In the second part of this thesis, we determined whether Notch is involved in differentiation of follicular Τ helper (TFH) cells. Using different models of immunization (NP-CGG, Schistosoma mansoni eggs) or infection (Leishmania mexicana), we showed that NiN2ACD4Cre mice were unable to generate TFH cells, displayed impaired germinal center (GC) formation as well as a profound defect in high affinity specific-antibodies secretion. We demonstrated an essential and previously unknown role of Notch in TFH cell development, the consequent GC formation and high affinity antibodies secretion, although the mechanisms by which Notch affects TFH development remain to be clearly demonstrated.¦-¦Lors d'une réponse immune, les lymphocytes Τ CD4+ se différencient en différentes sous- populations de lymphocytes Τ auxiliaires (T helper ou Th en anglais) incluant les populations de cellules Thi, Th2, Thn.7, Τ régulatrices ou Τ folliculaires. De nombreuses études ont montré un rôle de la voie de signalisation Notch dans la différentiation des lymphocytes Τ auxiliaires, bien que les résultats soient controversés. A ce jour, la majorité de ces études sont basées sur des modèles de gain de fonction qui ne reflètent pas le niveau physiologique du signal ou des modèles de perte de fonction pour lesquels toute la voie de signalisation est bloquée. De ce fait, nous avons voulu établir le rôle individuel de Notchi et Notch2 dans la réponse immune de type Thi et dans la différentiation des lymphocytes Τ auxiliaires folliculaires avec l'aide de souris déficientes pour Notchi, Notch2 ou les 2 (NiN2ACD4Cre) à la surface de leurs cellules T.¦Dans la première partie de cette thèse, nous avons analysé le rôle de Notch dans la différentiation de type Thi suite à infection avec le parasite Leishmania major, connu pour induire une forte réponse Thi dans des souris de souche C57BL/6. Les souris déficientes pour Notchi et Notch2 développent une importante lésion et sont incapables de contrôler la prolifération du parasite au site d'infection. Le profond défaut de la sécrétion d'IFNy par les cellules Τ des ganglions drainants est probablement responsable de la susceptibilité de ces souris à L. major. Bien que les cellules Τ ne sécrètent pas d'IFNy, nous avons observé des niveaux plus importants d'expression au niveau de l'ARN messager, et une proportion plus élevée de cellules positives pour CD4 et IFNy. Ces résultats indiquent que Notch est nécessaire pour la sécrétion d'IFNy mais pas pour la différentiation de cellules compétentes pour l'IFNy.¦Dans un second temps, nous avons voulu déterminer si Notch est impliqué dans la différentiation des cellules Τ folliculaires. En utilisant divers modèles d'immunisation (avec NP-CGG ou des oeufs de Schistosoma mansoni) ou d'infection (avec L. mexicana), nous avons montré que les souris NlN2ACD4Cre sont incapables de générer des cellules Τ folliculaires. En conséquence, la formation des centres germinatifs et la sécrétion d'anticorps de haute affinité sont profondément affectés. Nous avons démontré dans cette seconde partie un rôle crucial et inconnu à ce jour de Notch dans la différentiation des cellules Τ et en conséquence dans la formation des centres germinatifs et la sécrétion des anticorps de haute affinité, bien que les mécanismes par lesquels Notch contrôle cette différentiation restent à identifier.¦-¦Lors d'une réponse immune, les lymphocytes Τ CD// se différencient en différentes sous- populations de lymphocytes Τ auxiliaires de types Thi, Th2, Thi7, régulatrices ou folliculaires, définies selon la sécrétion de cytokines spécifiques. Le rôle de ces sous-populations dans le contrôle de diverses infections ou leur association avec de nombreuses maladies rend la compréhension des mécanismes de différentiation de ces cellules particulièrement importante. De nombreux facteurs sont impliqués dans ce processus, tels que la présence de diverses cytokines dans l'environnement, la nature de l'antigène ou encore la force de la stimulation. Par ailleurs, de nombreuses études ont montré un rôle de la voie de signalisation Notch dans la différentiation des lymphocytes T, bien que les résultats soient controversés. Dans cette thèse, nous avons voulu évaluer le rôle individuel des récepteurs Notch dans la différentiation des cellules Τ auxiliaires de type Thi et folliculaires à l'aide de souris dont les récepteurs Notch sont spécifiquement absents à la surface des lymphocytes T.¦Dans la première partie, nous avons utilisé le modèle d'infection au parasite Leishmania major, connu pour induire une forte réponse protectrice de type Thi dans la majorité des souches de souris. Suite à l'infection, les souris déficientes pour les récepteurs Notch sont incapables de contrôler la prolifération du parasite et développent une importante lésion au site d'infection. Cette susceptibilité est due à l'incapacité des cellules Τ auxiliaires à sécréter une cytokine spécifique des cellules de type Thi et nécessaire à l'éradication du parasite, l'IFNy. Ces résultats indiquent que les récepteurs Notch sont indispensables au développement d'une réponse Thi fonctionnelle, permettant la guérison suite à l'infection avec L. major.¦Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons voulu déterminer si Notch est impliqué dans la différentiation des lymphocytes Τ folliculaires. Ces cellules ont la particularité d'aider les lymphocytes Β à former des centres germinatifs au sein desquels les lymphocytes Β prolifèrent et sécrètent des anticorps, un processus nécessaire à la protection contre les pathogènes. Actuellement, l'efficacité de la majorité des vaccins repose sur la sécrétion d'anticorps par les lymphocytes B, aidés par les cellules Τ folliculaires. En raison du rôle important de ces cellules dans l'éradication des pathogènes et lors d'un processus de vaccination, il est important de connaître les facteurs et les mécanismes permettant la différentiation de ces cellules. Dans cette étude, nous montrons que la formation des cellules Τ folliculaires dépend de la voie de signalisation Notch, impliquant un rôle essentiel de cette molécule dans l'induction de la sécrétion d'anticorps par les lymphocytes B.

T-dependent B cell activation and differentiation in Lat Y136F mice : polyclonal response leading to autoimmune disease

SUMMARY LatY136F knock-in mice harbor a point mutation in tyrosine 136 of the linker for activation of T cells (LAT), and show accumulation of TH2 effector cells leading to IgG1 and IgE hypergammaglobulinemia. The observed polyclonal. B cell activation was not a direct effect of the mutation on B cells since in the absence of T cells mutant B cells did not show an activated phenotype. After adoptive transfer of LAT mutant T cells into wild type (WT) Tcell-deficient recipients, recipient B cells became activated. We show in vivo and in vitro that the LatY136F mutation promotes Tcell-dependent B cell activation leading to germinal center, memory and plasma cell formation even in the absence of MHC class II. This effect was, however, dependant on CD40 and CD80/CD86. All the plasma and memory B cell populations found in physiological T cell-dependent B cell responses were found. Characterization of the abundant plasmablasts observed in. secondary lymphoid organs of LatY136F mice revealed the presence of a previously uncharacterized CD93expressing subpopulation, whose existence was confirmed in WT mice after immunization. In LatY136F mice, B cell activation was polyclonal and not antigen-driven, since the increase in serum IgG1 and IgE concentrations involved antibodies and autoantibodies with different specificities equally. Although the non-complement-fixing IgG1 and IgE were the only isotypes significantly increased in LatY136F serum, we observed early onset of systemic autoimmunity with nephritis showing IgE autoantibody deposits and severe proteinuria. These results show that TH2 cells developing in LatY136F mice can trigger polyclonal B cell activation and thereby lead to systemic autoimmune disease. RESUME Les souris présentent une mutation ponctuelle au niveau de la tyrosine 136 de l'adaptateur requis pour l'activation des cellules T (LAT) et développent, de ce fait, une accumulation de cellules T effectrices de type TH2 ainsi qu'une hypergammaglobulémie des isotypes IgG1 et IgE. Dans ce modèle murin, l'activation des cellules B et la production d'anticorps qui y est associée ne sont pas dues à un effet direct de la mutation. Nous avons mis en évidence que l'interaction physique entre cellules T activées et cellules B est indispensable au développement de ce phenotype. D'un point de vue moléculaire, cette interaction ne requiert pas l'intervention des complexes majeurs d'histocompatibilité de classe II, garant de la spécificité d'une réponse immunitaire. Cependant, les molécules de costimulation CD40 et CD80/CD86 sont indispensables à une réponse complète des cellules B. Les souris LatY136F développent d'importantes populations de cellules B des centres germinatifs, de cellules B mémoires ainsi que de cellules sécrétant des anticorps, qui présentent les mêmes caractéristiques que lors d'une réponse immunitaire à un antigène classique. En observant plus précisément les plasmablastes présents dans les ganglions des souris LatY13sF, nous avons détecté une sous-population exprimant CD93; l'expression de ce marqueur par les cellules B n'a jamais été mise en évidence durant une réponse immunitaire. Cependant, notre étude a permis de confirmer sa présence, dans les ganglions de souris de type sauvage, lors d'immunisation avec différents antigènes. Nous avons montré que l'activation des cellules B des souris LatY136F est polyclonale et n'est pas dirigée par un antigène; les taux d'autoanticorps augmentent de manière proportionnelle à ceux des anticorps totaux. Bien que les IgG1 et les IgE ne soient pas des isotypes connus pour leurs propriétés pathogéniques, nous avons observé le développement d'une autoimmunité systémique caractérisée par une néphrite impliquant des dépôts d'autoanticorps du type IgE ainsi que par une sévère proteinurée.

Characterization of polyphosphate synthesis by isolated yeast vacuoles

Polyphosphate (iPOP) is a linear polymer of orthophosphate units linked together by high energy phosphoanhydride bonds. It is found in all organisms, localized in organelles called acidocalcisomes and ranges from a few to few hundred monomers in length. iPOP has been found to play a vast array of roles in all organisms, including phosphate and energy metabolism, regulation of enzymes, virulence, pathogenicity, bone remodelling and blood clotting, among many others. Recently it was found that iPOP levels were increased in myeloma cells. The growing interest in iPOP in human cell lines makes it an interesting molecule to study. However, not much is known about its metabolism in eukaryotes. Acidocalcisomes are electron dense, acidic organelles that belong to the group of Lysosome Related Organelles (LROs). The conservation of acidocalcisomes among all kingdoms of life is suggestive of their important roles for the organisms. However, they are difficult to analyse because of limited biochemical tools for investigation. Yeast vacuoles present remarkable similarities to acidocalcisomes in terms of their physiological and structural features, including synthesis and storage of iPOP, which make them an ideal candidate to study biological processes which are shared between vacuoles and acidocalcisomes. The availability of tools for genetic manipulation and isolation of vacuoles makes yeast a candidate of choice for the characterization of iPOP synthesis in eukaryotes. Our group has identified the Vacuolar Transporter Chaperone (VTC) complex as iPOP polymerase and identified the catalytic subunit (Vtc4). The goal of my study was to characterize the process of iPOP synthesis by isolated vacuoles and to reconstitute iPOP synthesis in liposomes. The first step was to develop a method for monitoring iPOP by isolated vacuoles over time and comparing it with previously known methods. Next, a detailed characterization was performed to determine the modulators of the process, both for intact as well as solubilized vacuoles. Finally, attempts were made to purify the VTC complex and reconstitute it in liposomes. A parallel line of study was the translocation and storage of synthesized iPOP in the lumen of the vacuoles. As a result of this study, it is possible to determine distinct pools of iPOP- inside and outside the vacuolar lumen. Additionally, I establish that the vacuolar lysate withstands harsh steps during reconstitution on liposomes and retains iPOP synthesizing activity. The next steps will be purification of the intact VTC complex and its structure determination by cryo-electron microscopy. - Les organismes vivants sont composés d'une ou plusieurs cellules responsables des processus biologiques élémentaires tels que la digestion, la respiration, la synthèse et la reproduction. Leur environnement interne est en équilibre et ils réalisent un très grand nombre de réactions chimiques et biochimiques pour maintenir cet équilibre. A différents compartiments cellulaires, ou organelles, sont attribuées des tâches spécifiques pour maintenir les cellules en vie. L'étude de ces fonctions permet une meilleure compréhension de la vie et des organismes vivants. De nombreux processus sont bien connus et caractérisés mais d'autres nécessitent encore des investigations détaillées. L'un de ces processus est le métabolisme des polyphosphates. Ces molécules sont des polymères linéaires de phosphate inorganique dont la taille peut varier de quelques dizaines à quelques centaines d'unités élémentaires. Ils sont présents dans tous les organismes, des bactéries à l'homme. Ils sont localisés principalement dans des compartiments cellulaires appelés acidocalcisomes, des organelles acides observés en microscopie électronique comme des structures denses aux électrons. Les polyphosphates jouent un rôle important dans le stockage et le métabolisme de l'énergie, la réponse au stress, la virulence, la pathogénicité et la résistance aux drogues. Chez l'homme, ils sont impliqués dans la coagulation du sang et le remodelage osseux. De nouvelles fonctions biologiques des polyphosphates sont encore découvertes, ce qui accroît l'intérêt des chercheurs pour ces molécules. Bien que des progrès considérables ont été réalisés afin de comprendre la fonction des polyphosphates chez les bactéries, ce qui concerne la synthèse, le stockage et la dégradation des polyphosphates chez les eucaryotes est mal connu. Les vacuoles de la levure Saccharomyces cerevisiae sont similaires aux acidocalcisomes des organismes supérieurs en termes de structure et de fonction. Les acidocalcisomes sont difficiles à étudier car il n'existe que peu d'outils génétiques et biochimiques qui permettent leur caractérisation. En revanche, les vacuoles peuvent être aisément isolées des cellules vivantes et manipulées génétiquement. Les vacuoles comme les acidocalcisomes synthétisent et stockent les polyphosphates. Ainsi, les découvertes faites grâce aux vacuoles de levures peuvent être extrapolées aux acidocalcisomes des organismes supérieurs. Le but de mon projet était de caractériser la synthèse des polyphosphates par des vacuoles isolées. Au cours de mon travail de thèse, j'ai mis au point une méthode de mesure de la synthèse des polyphosphates par des organelles purifés. Ensuite, j'ai identifié des composés qui modulent la réaction enzymatique lorsque celle-ci a lieu dans la vacuole ou après solubilisation de l'organelle. J'ai ainsi pu mettre en évidence deux groupes distincts de polyphosphates dans le système : ceux au-dehors de la vacuole et ceux en-dedans de l'organelle. Cette observation suggère donc très fortement que les vacuoles non seulement synthétisent les polyphosphates mais aussi transfère les molécules synthétisées de l'extérieur vers l'intérieur de l'organelle. Il est très vraisemblable que les vacuoles régulent le renouvellement des polyphosphates qu'elles conservent, en réponse à des signaux cellulaires. Des essais de purification de l'enzyme synthétisant les polyphosphates ainsi que sa reconstitution dans des liposomes ont également été entrepris. Ainsi, mon travail présente de nouveaux aspects de la synthèse des polyphosphates chez les eucaryotes et les résultats devraient encourager l'élucidation de mécanismes similaires chez les organismes supérieurs. - Les polyphosphates (iPOP) sont des polymères linéaires de phosphates inorganiques liés par des liaisons phosphoanhydres de haute énergie. Ces molécules sont présentes dans tous les organismes et localisées dans des compartiments cellulaires appelés acidocalcisomes. Elles varient en taille de quelques dizaines à quelques centaines d'unités phosphate. Des fonctions nombreuses et variées ont été attribuées aux iPOP dont un rôle dans les métabolismes de l'énergie et du phosphate, dans la régulation d'activités enzymatiques, la virulence, la pathogénicité, le remodelage osseux et la coagulation sanguine. Il a récemment été montré que les cellules de myélome contiennent une grande quantité de iPOP. Il y donc un intérêt croissant pour les iPOP dans les lignées cellulaires humaines. Cependant, très peu d'informations sur le métabolisme des iPOP chez les eucaryotes sont disponibles. Les acidocalcisomes sont des compartiments acides et denses aux électrons. Ils font partie du groupe des organelles similaires aux lysosomes (LROs pour Lysosome Related Organelles). Le fait que les acidocalcisomes soient conservés dans tous les règnes du vivant montrent l'importance de ces compartiments pour les organismes. Cependant, l'analyse de ces organelles est rendue difficile par l'existence d'un nombre limité d'outils biochimiques permettant leur caractérisation. Les vacuoles de levures possèdent des aspects structuraux et physiologiques très similaires à ceux des acidocalcisomes. Par exemple, ils synthétisent et gardent en réserve les iPOP. Ceci fait des vacuoles de levure un modèle idéal pour l'étude de processus biologiques conservés chez les vacuoles et les acidocalcisomes. De plus, la levure est un organisme de choix pour l'étude de la synthèse des iPOP compte-tenu de l'existence de nombreux outils génétiques et la possibilité d'isoler des vacuoles fonctionnelles. Notre groupe a identifié le complexe VTC (Vacuole transporter Chaperone) comme étant responsable de la synthèse des iPOP et la sous-unité Vtc4p comme celle possédant l'activité catalytique. L'objectif de cette étude était de caractériser le processus de synthèse des iPOP en utilisant des vacuoles isolées et de reconstituer la synthèse des iPOP dans des liposomes. La première étape a consisté en la mise au point d'un dosage permettant la mesure de la quantité de iPOP synthétisés par les organelles isolés en fonction du temps. Cette nouvelle méthode a été comparée aux méthodes décrites précédemment dans la littérature. Ensuite, la caractérisation détaillée du processus a permis d'identifier des composés modulateurs de la réaction à la fois pour des vacuoles intactes et des vacuoles solubilisées. Enfin, des essais de purification du complexe VTC et sa reconstitution dans des liposomes ont été entrepris. De façon parallèle, une étude sur la translocation et le stockage des iPOP dans le lumen des vacuoles a été menée. Il a ainsi été possible de mettre en évidence différents groupes de iPOP : les iPOP localisés à l'intérieur et ceux localisés à l'extérieur des vacuoles isolées. De plus, nous avons observé que le lysat vacuolaire n'est pas détérioré par les étapes de reconstitution dans les liposomes et conserve l'activité de synthèse des iPOP. Les prochaines étapes consisteront en la purification du complexe intact et de la détermination de sa structure par cryo-microscopie électronique.

The early IL-4 response to Leishmania major responsible for progressive disease in BALB/c mice is subject to the control of autocrine IL-2 production and regulatory CD4+C25+ T cells

Résumé : La majorité des souches de souris de laboratoire sont résistantes à l'infection par le parasite Leishmania major (L. major). A l'opposé, les souris de la souche BALB développent une maladie évolutive. La résistance et la sensibilité sont corrélées avec l'apparition de lymphocytes T CD4+ spécifiques du parasite, Th1 (de l'anglais T helper) ou Th2 respectivement. La réponse aberrante Th2 chez les souris de la souche BALB/c dépend, au moins en partie, de façon critique de la production rapide d'IL-4 suite à l'infection. Ce pic précoce d'IL-4 est produit par une population de lymphocytes T CD4+ restreinte aux molécules du MHC de classe II, exprimant les chaînes du récepteur des cellules T Vß4-Va8. Ces lymphocytes sont spécifiques d'un épitope de l'homologue Leishmania de la molécule RACK1 des mammifères, appelée LACK. Il a été clairement démontré que l'IL-4 rapidement produite par ces cellules T CD4+ Vß4-Va8 induit la maturation Th2 responsable de la sensibilité vis-à-vis de L. major. Des expériences ont été entreprises pour étudier la régulation de cette réponse précoce d'IL-4. Dans ce travail, nous avons documenté, dans les cellules provenant des ganglions de souris sensibles infectées par L. major, une augmentation de la transcription de l'ARNm de l'IL-2 qui précède la réponse précoce d'IL-4. La neutralisation de l'IL-2 durant les premiers jours d'infection induit la maturation des cellules Thl et la résistance vis-à-vis de L. major. Ces effets de l'anticorps anti-IL-2 neutralisant sont liés à sa capacité d'interférer avec la transcription rapide d'IL-4 des cellules CD4+ réactives à l'antigène LACK. Une augmentation similaire d'IL-2 survient chez les souris résistantes C57BL/6 qui sont incapables de générer la réponse précoce d'IL-4. Cependant, la protéiné LACK induit une transcription précoce d'IL-2 uniquement chez les souris sensibles. Des expériences de reconstitution utilisant des souris C.B.-17 SCID et des cellules T CD4+ réactives à LACK provenant de souris BALB/c IL-2-~démontrent un mode d'action autocrine de l'IL-2 sur la régulation de la réponse précoce d'IL4. Par conséquent, chez les souris C57BL/6, l'absence du pic précoce d'ARNm de l'IL-4 important pour la progression de la maladie paraît liée à l'incapacité des cellules T CD4+ réactives à LACK de produire de l'IL-2. Un rôle dans le contrôle de la production précoce d'IL-4 par les cellules T régulatrices CD4+CD25+ a été investigué en déplétant in vivo cette population de cellules. La déplétion induit une élévation du pic précoce de l'ARNm de l'IL-4 dans les ganglions drainant de souris BALB/c, ainsi qu'une exacerbation du cours de la maladie avec des taux augmentés d'IL-4 dans les ganglions. La réponse rapide d'IL-2 vis-à-vis de L. major est aussi significativement augmentée chez les souris BALB/c déplétées en cellules CD4+CD25+. De plus, nous avons démontré que le transfert de 10puissance(7) cellules provenant de la rate de souris BALB/c déplétées en cellules T régulatrices CD4+CD25+ rend les souris SCID sensibles à l'infection et permet la différentiation Th2. Au contraire, les souris SCID reconstituées avec 10' cellules de la rate de souris BALB/c contrôle sont résistantes à infection par L. major et développent une réponse Thl. Chez les souris SCID reconstituées avec des cellules de rate déplétées en cellules exprimant le marqueur CD25, le traitement avec un anticorps neutralisant l'IL-4 au moment de l'infection par L. major prévient le développement de la réponse Th2 et rend ces souris résistantes à l'infection. Ces résultats démontrent que les cellules T régulatrices CD4+CD25+ jouent un rôle dans la régulation du pic précoce d'IL-4 responsable du développement cellulaire Th2 dans ce modèle d'infection. Summary Mice from most strains are resistant to infection with Leishmania major (L. major). In contrast, BALB mice develop progressive disease. Resistance and susceptibility result from parasite-specific CD4+ Thl or Th2 cells, respectively. The aberrant Th2 response in BALB/c mice depends, at least in part, upon the production of IL-4 early after infection. The CD4+ T cells responsible for this early IL-4 response to L. major express a restricted TCR repertoire (Vß4-Va8) and respond to an I-Ad-restricted epitope of the Leishmania homologue of mammalian RACK1, designated LACK. The role of these cells and the IL-4 they produce for subsequent Th2 cell development and disease progression in BALB/c mice was demonstrated. Experiments have been undertaken to study the regulation of the rapid IL-4 production to L. major. In this report, we document an IL-2 mRNA burst, preceding the reported early IL-4 response, in draining lymph nodes of susceptible mice infected with L. major. Neutralization of IL-2 during the first days of infection redirected Thl cell maturation and resistance to L. major, through interference with the rapid IL-4 transcription in LACKreactive CD4+ cells. A burst of IL-2 transcripts also occurred in infected C57BL/6 mice that do not mount an early IL-4 response. However, although the LACK protein induced IL-2 transcripts in susceptible mice, it failed to trigger this response in resistant C57BL/6 mice. Reconstitution experiments using C.B.-17 SCID mice and LACK-reactive CD4+ T cells from IL-2-/- BALB/c mice showed that triggering of the early IL-4 response required autocrine IL2. Thus, in C57BL/6 mice, the inability of LACK-reactive CD4+ T cells to express early IL-4 mRNA transcription, important for disease progression, appears due to an incapacity of these cells to produce IL-2. A role for CD4+CD25+ regulatory T cells in the control of this early IL-4 production was investigated by depleting in vivo this regulatory T cell population. Depletion induced an increase in the early burst of IL-4 mRNA in the draining lymph nodes of BALB/c mice, and exacerbated the course of disease with higher levels of IL-4 mRNA and protein in their lymph nodes. The rapid IL-2 response to L. major is also significantly enhanced in BALB/c mice depleted of CD4+CD25+ cells. We further showed that transfer of 10~ BALB/c spleen cells that were depleted of CD4+CD25+ regulatory T cells rendered SCID mice susceptible to infection and allowed Th2 differentiation while SCID mice reconstituted with 10 control BALB/c spleen cells were resistant to infection with L. major and developed a Thl response. Treatment with a mAb against IL-4 upon infection with L. major in SCID mice reconstituted with CD25-depleted spleen cells prevented the development of Th2 polarization and rendered them resistant to infection. These results demonstrate that CD4+CD25+ regulatory T cells play a role in regulating the early IL-4 mRNA and the subsequent development of a Th2 response in this model of infection.

De novo T cell generation and cell cycle analysis of CD4 and CD8 T cells during HIV-disease

RESUME POUR UN LARGE PUBLIC Parmi les globules blancs, les lymphocytes T 004 jouent un rôle primordial dans la coordination de la réponse immunitaire contre les pathogènes et les lymphocytes T CD8 dans leur élimination. Lors d'une infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1), non seulement les cellules T CD4 sont les principales cibles d'infections, mais aussi elles disparaissent progressivement tout au long de la maladie. Ce phénomène, appelé aussi épuisement des lymphocytes T CD4, est la principale cause provoquant le Syndrome d'Immunodéficience Acquise (SIDA). Malgré de grands efforts de recherche, nous ne sommes toujours pas en mesure de dire si ce phénomène est dû à un défaut dans la production de nouvelles cellules ou à une destruction massive de cellules en circulation. Dans cette étude, nous nous proposions, dans un premier temps, de comparer la production de nouvelles cellules T CD4 et CD8 chez des individus VIH-négatifs et positifs. Les cellules nouvellement produites portent un marqueur commun que l'on appelle TREC et qui est facilement mesurable. En considérant des paramètres cliniques, nous étions en mesure de déterminer le niveau de TRECs de cellules T CD4 et CD8 dans différentes phases de la maladie. De là, nous avons pu déterminer que le niveau de TREC est toujours plus bas dans les cellules T CD8 de patients VIH-positifs comparativement à notre groupe contrôle. Nous avons pu déterminer par une analyse ultérieure que cette différence est due à une forte prolifération de ces cellules chez les patients VIH-positifs, ce qui a pour effet de diluer ce marqueur. En revanche, la production de nouvelles cellules T CD4 chez des patients VIH-positifs est accentuée lors de la phase précoce de la maladie et largement réprimée lors de la phase tardive. Dans un second temps, nous avons effectué une analyse à grande échelle de l'expression de gènes associés à la division cellulaire sur des lymphocytes T CD4 et CD8 d'individus VIH-¬positifs et négatifs, avec comme contrôle des cellules proliférant in vitro. De cette étude, nous avons pu conclure que les cellules T CD8 de patients VIH-positifs étaient en état de prolifération, alors que les lymphocytes T CD4 présentaient des défauts majeurs conduisant à un arrêt de la division cellulaire. Nos résultats montrent que la capacité à produire de nouvelles cellules chez des patients VIH¬positifs reste active longtemps pendant la maladie, mais que l'incapacité des cellules T CD4 à proliférer peut enrayer la reconstitution immunitaire chez ces individus. ABSTRACT The hallmark of HIV-1 infection is the depletion of CD4 T cells. Despite extensive investigation, the mechanisms responsible for the loss of CD4 T cells have been elucidated only partially. In particular, it remains controversial whether CD4 T cell depletion results from a defect in T cell production or from a massive peripheral destruction. In this study, de novo T cell generation has been investigated by measuring T cell receptor rearrangement excision circles (TRECs) on large cohorts of HIV-negative (N=120) and HIV-1 infected (N=298) individuals. Analysis of TREC levels was performed in HIV-infected subjects stratified by the stage of HIV disease based on CD4 T cell counts (early: >500 CD4 T cells/µl; intermediate: <500>200; late: <200) and by age (20 to 60 years, n = 259). Our data show that TREC levels in CD8 T cells were significantly lower in HIV-infected subjects at any stage of disease compared to the control group. In contrast, TREC levels in CD4 T cells were significantly higher in HIV-infected subjects at early stages disease while no significant differences were observed at intermediate stages of the disease and were severely reduced only at late stages of disease. To investigate further the status of cell cycle in peripheral CD4 and CD8 T cells in HIV-1 infections, we determined the pattern of gene expression with the microarray technology. In particular, CD4 and CD8 T cells of HIV-1 infected and HIV-negative subjects were analysed by Cell Cycle cDNA expression array. The patterns of gene expression were compared to in vitro stimulated CD4 and CD8 T cells and this analysis showed that CD8 T cells of HIV-1 infected subjects had a pattern of gene expression very similar to that of in vitro stimulated CD8 T cells thus indicating ongoing cell cycling. In contrast, CD4 T cells of HIV-1 infected subjects displayed a complex pattern of gene expression. In fact, CD4 T cells expressed high levels of genes typically associated with cell activation, but low levels of cell cycle genes. Therefore, these results indicated that activated CD4 T cells of HIV-1 infected subjects were in cell cycle arrest. Taking together these results indicate that thymus function is preserved for long time during HIV- 1 infection and the increase observed in early stage disease may represent a compensatory mechanism to the depletion of CD4 T cells. However, we provide evidence for a cell cycle arrest of peripheral CD4 T cells that may prevent potentially the replenishment of CD4 T cells. RESUME Les mécanismes responsables de la perte des lymphocytes T CD4 lors de l'infection pas VIH n'ont été élucidés que partiellement. Nous ne savons toujours pas si l'épuisement des lymphocytes T CD4 résulte d'un défaut dans la production de cellules ou d'une destruction périphérique massive. Dans cette étude, la production de cellules T a été étudiée en mesurant les cercles d'excision générés lors du réarrangement du récepteur au cellules T (TRECs) chez des individus VIH-négatifs (N=120) et VIH-1 positifs (N=298). L'analyse des niveaux de TREC a été faite chez sujets HIV-infectés en considérant les phases de la maladie sur la base des comptes CD4 (phase précoce: > 500 cellules CD4/µl; intermédiaire: < 500>200; tardive: < 200) et par âge. Nos données démontrent que les niveaux de TRECs des cellules T CD8 étaient significativement plus bas chez les sujets VIH-1 infectés, à tous les stades de la maladie comparativement au groupe contrôle. En revanche, les niveaux de TRECs des cellules T CD4 étaient significativement plus élevés chez les sujets VIH-1 infectés durant la phase précoce de la maladie, tandis qu'aucune différence significative n'était observée durant la phase intermédiaire et étaient très réduits dans la phase tardive. Dans une deuxième partie, nous avons utilisé la technique des biopuces à d'ADN complémentaire pour analyser la régulation du cycle cellulaire chez les lymphocytes T CD4 et CD8 périphériques lors d'une infection au VIH-1. Des profils d'expression ont été déterminés et comparés à ceux de cellules T CD4 et CD8 stimulées in vitro, démontrant que les cellules T CD8 des sujets VIH-positifs avaient un profil d'expression très semblable à celui des cellules stimulées in vitro en prolifération. En revanche, les lymphocytes T CD4 des sujets VIH-1 positifs avaient un profil d'expression de gène plus complexe. En fait, leur profil montrait une sur- expression de gènes associés à une activation cellulaire, mais une sous-expression de ceux induisant une division. Ainsi, ces résultats indiquent que les lymphocytes T CD4 d'individus VIH-positifs présentent des dérégulations qui conduisent à un arrêt du cycle cellulaire. Ces résultats montrent que la fonction thymique est préservée longtemps pendant l'infection au VIH-1 et que l'augmentation de la quantité de TRECs dans la phase précoce de la maladie peut représenter un mécanisme compensatoire à l'épuisement des cellules T CD4. Cependant, nous démontrons aussi un clair dysfonctionnement du cycle cellulaire chez les cellules T CD4 d'individus infectés par VIH-1 ce qui peut enrayer la reconstitution du système immunitaire.

Control of gene expression in melanocytes and RPE by conserved distal regulatory elements

Résumé Durant le développement embryonnaire, les cellules pigmentaires des mammifères se développent à partir de deux origines différentes : les melanocytes se développent à partir de la crête neurale alors que les cellules de la rétine pigmentaire (RP) ont une origine neuronale. Un grand nombre de gènes sont impliqués dans la pigmentation dont les gènes de la famille tyrosinase à savoir Tyr, Tyrp1 et Dct. Certaines études ont suggéré que les gènes de la pigmentation sont régulés de manière différentielle dans les mélanocytes et dans la RP. Dans ce travail, les gènes de la famille tyrosinase ont été étudiés comme modèle de la régulation des gènes de la pigmentation par des éléments régulateurs agissant à distance. II a été montré que le promoteur du gène Tyrp1pouvait induire l'expression d'un transgène uniquement dans la RP alors que ce gène est aussi exprimé dans les mélanocytes comme le montre le phénotype des souris mutantes pour Tyrp1. Ce résultat suggère que les éléments régulateurs du promoteur sont suffisants pour l'expression dans la RP mais pas pour l'expression dans les mélanocytes. J'ai donc cherché à identifier la séquence qui régule l'expression dans les mélanocytes. Un chromosome artificiel bactérien (CAB) contenant le gène Tyrp1 s'est avéré suffisant pour induire l'expression dans les mélanocytes, comme démontré par la correction du phénotype mutant. La séquence de ce CAB contient plusieurs régions très conservées qui pourraient représenter de nouveaux éléments régulateurs. Par la suite, j'ai focalisé mon analyse sur une séquence située à -I5 kb qui s'est révélée être un amplificateur spécifique aux mélanocytes comme démontré par des expériences de cultures cellulaire et de transgenèse. De plus, une analyse poussée de cet élément a révélé que le facteur de transcription Sox 10 représentait un transactivateur de cet amplificateur. Comme pour Tyrp1, la régulation du gène tyrosinase est contrôlée par différents éléments régulateurs dans les mélanocytes et la RP. Il a été montré que le promoteur de tyrosinase n'était pas suffisant pour une forte expression dans les mélanocytes et la RP. De plus, l'analyse de la région située en amont a révélé la présence d'un amplificateur nécessaire à l'expression dans les mélanocytes à la position -15 kb. Cet amplificateur n'est toutefois pas actif dans la RP mais agit comme un répresseur dans ces cellules. Ces résultats indiquent que certains éléments nécessaires à l'expression dans les deux types de cellules pigmentaires sont absents de ces constructions. Comme pour Tyrp1, j'ai en premier lieu démontré qu'un CAB était capable de corriger le phénotype albinique, puis ai inséré un gène reporter (lacZ) dans le CAB par recombinaison homologue et ai finalement analysé l'expression du reporter en transgenèse. Ces souris ont montré une expression forte du lacZ dans les mélanocytes et la RP, ce qui indique que le CAB contient les séquences régulatrices nécessaires à l'expression correcte de tyrosinase. Afin de localiser plus précisément les éléments régulateurs, j'ai ensuite généré des délétions dans le CAB et analysé l'expression du lacZ en transgenèse. La comparaison de séquences génomiques provenant de différentes espèces a permis par la suite d'identifier des régions représentant de nouveaux éléments régulateurs potentiels. En utilisant cette approche, j'ai identifié une région qui se comporte comme un amplificateur dans la RP et qui est nécessaire à l'expression de tyrosinase dans ce tissu. De plus, j'ai identifié les facteurs de transcription Mitf et Sox10 comme transactivateurs de l'amplificateur spécifique aux mélanocytes situé à -15 kb. L'identification et la caractérisation des ces éléments régulateurs des gènes tyrosinase et Tyrp1confirme donc que la régulation différentielle des gènes dans les mélanocytes et la RP est liée à des éléments régulateurs séparés. Summary Pigment cells of mammals originate from two different lineages: melanocytes arise from the neural crest, whereas cells of the retinal pigment epithelium (RPE) originate from the optic cup of the developing forebrain. A large set of genes are involved in pigmentation, including the members of the tyrosinase gene family, namely tyrosinase, Tyrp1 and Dct. Previous studies have suggested that pigmentation genes are differentially regulated in melanocytes and RPE. In this work, the tyrosinase gene family was used as a model for studying the involvement of distal regulatory elements in pigment cell-specific gene expression. The promoter of the Tyrp1 gene has been shown to drive detectable transgene expression only to the RPE, even though the gene is also expressed in melanocytes as evident from Tyrp1-mutant mice. This indicates that the regulatory elements responsible for Tyrp1 gene expression in the RPE are not sufficient for expression in melanocytes. I thus searched for a putative melanocyte-specific regulatory sequence and demonstrate that a bacterial artificial chromosome (BAC) containing the Tyrp1 gene and surrounding sequences is able to target transgenic expression to melanocytes and to rescue the Tyrp1 b (brown) phenotype. This BAC contains several highly conserved non-coding sequences that might represent novel regulatory elements. I further focused on a sequence located at -15 kb which I identified as amelanocyte-specific enhancer as shown by cell culture and transgenic mice. In addition, further functional analysis identified the transcription factor Sox10 as being able to bind and transactivate this enhancer. As for Tyrp1, tyrosinase gene regulation is mediated by different cis-regulatory elements in melanocytes and RPE. It was shown that the tyrosinase promoter was not sufficient to confer strong and specific expression in melanocytes and RPE. Moreover, analysis of tyrosinase upstream sequence, revealed the presence of a specific enhancer at position -15 kb which was necessary to confer strong expression in melanocytes. This enhancer element however failed to act as an enhancer in the RPE, but rather repressed expression. This indicates that some regulatory elements required for tyrosinase expression in both RPE and melanocytes are still missing from these constructs. As for Tyrp1, I first demonstrated that a BAC containing the Tyr gene is able to rescue the Tyr c (albino) phenotype in mice, then I inserted a lacZ reporter gene in the BAC by homologous recombination, and finally analysed the pattern of lacZ expression in transgenic mice. These mice showed strong lacZ expression in both RPE and melanocytes, indicating that the BAC contains the regulatory sequences required for proper tyrosinase expression. In order to localize more precisely these regulatory elements, I have then generated several deletions in the BAC and analysed lacZ expression in transgenic mice. Multi-species comparative genomic analysis then allowed identifying conserved sequences that potentially represent novel regulatory elements. Using this experimental approach, I identified a region that behaves as a RPE-specific enhancer and that is required for tyrosinase expression in the retina] pigment epithelium. In addition, I identified the transcription factors Mitf and Sox l0 as being transactivators of the melanocyte-specific enhancer located at -l5 kb. The identification and characterization of these tyrosinase and Tyrp1 distal regulatory element supports the idea that separate regulatory sequences mediate differential gene expression in melanocytes and RPE.

Multimodal MRI analysis of structural and functional networks in the human brain : application to two clinical studies : driving abilities under THC intoxication and early white matter changes in FXTAS

Les approches multimodales dans l'imagerie cérébrale non invasive sont de plus en plus considérées comme un outil indispensable pour la compréhension des différents aspects de la structure et de la fonction cérébrale. Grâce aux progrès des techniques d'acquisition des images de Resonance Magnetique et aux nouveaux outils pour le traitement des données, il est désormais possible de mesurer plusieurs paramètres sensibles aux différentes caractéristiques des tissues cérébraux. Ces progrès permettent, par exemple, d'étudier les substrats anatomiques qui sont à la base des processus cognitifs ou de discerner au niveau purement structurel les phénomènes dégénératifs et développementaux. Cette thèse met en évidence l'importance de l'utilisation d'une approche multimodale pour étudier les différents aspects de la dynamique cérébrale grâce à l'application de cette approche à deux études cliniques: l'évaluation structurelle et fonctionnelle des effets aigus du cannabis fumé chez des consommateurs réguliers et occasionnels, et l'évaluation de l'intégrité de la substance grise et blanche chez des jeunes porteurs de la prémutations du gène FMR1 à risque de développer le FXTAS (Fragile-X Tremor Ataxia Syndrome). Nous avons montré que chez les fumeurs occasionnels de cannabis, même à faible concentration du principal composant psychoactif (THC) dans le sang, la performance lors d'une tâche visuo-motrice est fortement diminuée, et qu'il y a des changements dans l'activité des trois réseaux cérébraux impliqués dans les processus cognitifs: le réseau de saillance, le réseau du contrôle exécutif, et le réseau actif par défaut (Default Mode). Les sujets ne sont pas en mesure de saisir les saillances dans l'environnement et de focaliser leur attention sur la tâche. L'augmentation de la réponse hémodynamique dans le cortex cingulaire antérieur suggère une augmentation de l'activité introspective. Une investigation des ef¬fets au niveau cérébral d'une exposition prolongée au cannabis, montre des changements persistants de la substance grise dans les régions associées à la mémoire et au traitement des émotions. Le niveau d'atrophie dans ces structures corrèle avec la consommation de cannabis au cours des trois mois précédant l'étude. Dans la deuxième étude, nous démontrons des altérations structurelles des décennies avant l'apparition du syndrome FXTAS chez des sujets jeunes, asymptomatiques, et porteurs de la prémutation du gène FMR1. Les modifications trouvées peuvent être liées à deux mécanismes différents. Les altérations dans le réseau moteur du cervelet et dans la fimbria de l'hippocampe, suggèrent un effet développemental de la prémutation. Elles incluent aussi une atrophie de la substance grise du lobule VI du cervelet et l'altération des propriétés tissulaires de la substance blanche des projections afférentes correspondantes aux pédoncules cérébelleux moyens. Les lésions diffuses de la substance blanche cérébrale peu¬vent être un marquer précoce du développement de la maladie, car elles sont liées à un phénomène dégénératif qui précède l'apparition des symptômes du FXTAS. - Multimodal brain imaging is becoming a leading tool for understanding different aspects of brain structure and function. Thanks to the advances in Magnetic Resonance imaging (MRI) acquisition schemes and data processing techniques, it is now possible to measure different parameters sensitive to different tissue characteristics. This allows for example to investigate anatomical substrates underlying cognitive processing, or to disentangle, at a pure structural level degeneration and developmental processes. This thesis highlights the importance of using a multimodal approach for investigating different aspects of brain dynamics by applying this approach to two clinical studies: functional and structural assessment of the acute effects of cannabis smoking in regular and occasional users, and grey and white matter assessment in young FMR1 premutation carriers at risk of developing FXTAS. We demonstrate that in occasional smokers cannabis smoking, even at low concentration of the main psychoactive component (THC) in the blood, strongly decrease subjects' performance on a visuo-motor tracking task, and globally alters the activity of the three brain networks involved in cognitive processing: the Salience, the Control Executive, and the Default Mode networks. Subjects are unable to capture saliences in the environment and to orient attention to the task; the increase in Hemodynamic Response in the Anterior Cingulate Cortex suggests an increase in self-oriented mental activity. A further investigation on long term exposure to cannabis, shows a persistent grey matter modification in brain regions associated with memory and affective processing. The degree of atrophy in these structures also correlates with the estimation of drug use in the three months prior the participation to the study. In the second study we demonstrate structural changes in young asymptomatic premutation carriers decades before the onset of FXTAS that might be related to two different mechanisms. Alteration of the cerebellar motor network and of the hippocampal fimbria/ fornix, may reflect a potential neurodevelopmental effect of the premutation. These include grey matter atrophy in lobule VI and modification of white matter tissue property in the corresponding afferent projections through the Middle Cerebellar Peduncles. Diffuse hemispheric white matter lesions that seem to appear closer to the onset of FXTAS and be related to a neurodegenerative phenomenon may mark the imminent onset of FXTAS.