Analysis of outcome and cancer stem cells status in patients with resectable pancreatic adenocarcinoma

RESUMO: Actualmente, a única possibilidade de cura para doentes com adenocarcinoma do pâncreas (PDAC) é a ressecção cirúrgica, no início deste estudo, perguntamo-nos se os predictores clínico-patológicos clássicos de prognostico poderiam ser validados em uma grande cohort de doentes com cancro do pâncreas ressecável e se outros predictores clínicos poderiam ter um papel na decisão de que doentes beneficiariam de ressecção cirúrgica. No capítulo 2, observamos que até 30% dos doentes morrem no primeiro ano após a ressecção cirúrgica, pelo que o nosso objectivo foi determinar factores pré-operatórios que se correlacionam com mortalidade precoce após ressecação cirúrgica com recurso a um instrumento estatisticamente validado, o Charlson-Age Comorbidity Index (CACI), determinamos que um CACI score superior a 4 foi preditivo de internamentos prolongados (p <0,001), complicações pós-operatórias (p = 0,042), e mortalidade em 1 ano pós- ressecção cirúrgica (p <0,001). Um CACI superior a 6 triplicou a mortalidade no primeiro ano pós-cirurgia e estes doentes têm menos de 50% de probabilidade de estarem vivos um ano após a cirurgia. No capítulo 3, o nosso objectivo foi identificar uma proteína de superfície que se correlacionasse estatisticamente com o prognostico de doentes com adenocarcinoma do pâncreas e permitisse a distinção de subgrupos de doentes de acordo com as suas diferenças moleculares, perguntamo-nos ainda se essa proteína poderia ser um marcador de células-estaminais. No nosso trabalho anterior observamos que as células tumorais na circulação sanguínea apresentavam genes com características bifenotípica epitelial e mesenquimal, enriquecimento para genes de células estaminais (ALDH1A1 / ALDH1A2 e KLF4), e uma super-expressão de genes da matriz extracelular (colagénios, SPARC, e DCN) normalmente identificados no estroma de PDAC. Após a avaliação dos tumores primários com RNA-ISH, muitos dos genes identificados, foram encontrados co-localizando em uma sub-população de células na região basal dos ductos pancreáticos malignos. Além disso, observamos que estas células expressam o marcador SV2A neuroendócrino, e o marcador de células estaminais ALDH1A1/2. Em comparação com tumores negativos para SV2, os doentes com tumores SV2 positivos apresentaram níveis mais baixos de CA 19-9 (69% vs. 52%, p = 0,012), tumores maiores (> 4 cm, 23% vs. 10%, p = 0,0430), menor invasão de gânglios linfáticos (69% vs. 86%, p = 0,005) e tumores mais diferenciados (69% vs. 57%, p = 0,047). A presença de SV2A foi associada com uma sobrevida livre de doença mais longa (HR: 0,49 p = 0,009) bem como melhor sobrevida global (HR: 0,54 p = 0,018). Em conjunto, esta informação aponta para dois subtipos diferentes de adenocarcinoma do pâncreas, e estes subtipos co-relacionam estatisticamente com o prognostico de doentes, sendo este subgrupo definido pela presença do clone celular SV2A / ALDH1A1/2 positivo com características neuroendócrinas. No Capítulo 4, a expressão de SV2A no cancro do pâncreas foi validado em linhas celulares primárias. Demonstramos a heterogeneidade do adenocarcinoma do pâncreas de acordo com características clonais neuroendócrinas. Ao comparar as linhas celulares expressando SV2 com linhas celulares negativas, verificamos que as linhas celulares SV2+ eram mais diferenciadas, diferindo de linhas celulares SV2 negativas no que respeita a mutação KRAS, proliferação e a resposta à quimioterapia. No capítulo 5, perguntamo-nos se o clone celular SV2 positivo poderia explicar a resistência a quimioterapia observada em doentes. Observamos um aumento absoluto de clones celulares expressando SV2A, em múltiplas linhas de evidência - doentes, linhas de células primárias e xenotransplantes. Embora, tenhamos sido capazes de demonstrar que o adenocarcinoma do pâncreas é uma doença heterogénea, consideramos que a caracterização genética destes clones celulares expressando SV2A é de elevada importância. Pretendemos colmatar esta limitação com as seguintes estratégias: Após o tratamento com quimioterapia neoadjuvante na nossa coorte, realizamos microdissecação a laser das amostras primarias em parafina, de forma a analisar mutações genéticas observadas no adenocarcinoma pancreático; em segundo lugar, pretendemos determinar consequências de knockdown da expressão de SV2A em nossas linhas celulares seguindo-se o tratamento com gemicitabina para determinação do papel funcional de SV2A; finalmente, uma vez que os nossos esforços anteriores com um promotor - repórter e SmartFlare ™ falharam, o próximo passo será realizar RNA-ISH PrimeFlow™ seguido de FACS e RNA-seq para caracterização deste clone celular. Em conjunto, conseguimos provar com várias linhas de evidência, que o adenocarcinoma pancreático é uma doença heterogénea, definido por um clone de células que expressam SV2A, com características neuroendócrinas. A presença deste clone no tecido de doentes correlaciona-se estatisticamente com o prognostico da doença, incluindo sobrevida livre de doença e sobrevida global. Juntamente com padrões de proliferação e co-expressão de ALDH1A1/2, este clone parece apresentar um comportamento de células estaminais e está associado a resistência a quimioterapia, uma vez que a sua expressão aumenta após agressão química, quer em doentes, quer em linhas de células primárias.----------------------------- ABSTRACT: Currently, the only chance of cure for patients with pancreatic adenocarcinoma is surgical resection, at the beginning of my thesis studies, we asked if the classical clinicopathologic predictors of outcome could be validated in a large cohort of patients with early stage pancreatic cancer and if other clinical predictors could have a role on deciding which patients would benefit from surgery. In chapter 2, we found that up to 30% of patients die within the first year after curative intent surgery for pancreatic adenocarcinoma. We aimed at determining pre-operative factors that would correlate with early mortality following resection for pancreatic cancer using a statistically validated tool, the Charlson-Age Comorbidity Index (CACI). We found that a CACI score greater than 4 was predictive of increased length of stay (p<0.001), post-operative complications (p=0.042), and mortality within 1-year of pancreatic resection (p<0.001). A CACI score of 6 or greater increased 3-fold the odds of death within the first year. Patients with a high CACI score have less than 50% likelihood of being alive 1 year after surgery. In chapter 3 we aimed at identifying a surface protein that correlates with patient’s outcome and distinguishes sub-groups of patients according to their molecular differences and if this protein could be a cancer stem cell marker. The most abundant class of circulating tumor cells identified in our previous work was found to have biphenotypic features of epithelial to mesenchymal transition, enrichment for stem-cell associated genes (ALDH1A1/ALDH1A2 and KLF4), and an overexpression of extracellular matrix genes (Collagens, SPARC, and DCN) normally found in the stromal microenvironment of PDAC primary tumors. Upon evaluation of matched primary tumors with RNA-ISH, many of the genes identified were found to co-localize in a sub-population of cells at the basal region of malignant pancreatic ducts. In addition, these cells expressed the neuroendocrine marker SV2A, and the stem cell marker ALDH1A1/2. Compared to SV2 negative tumors, patients with SV2 positive tumors were more likely to present with lower CA 19-9 (69% vs. 52%, p = 0.012), bigger tumors (size > 4 cm, 23% vs. 10%, p= 0.0430), less nodal involvement (69% vs. 86%, p = 0.005) and lower histologic grade (69% vs. 57%, p = 0.047). The presence of SV2A expressing cells was associated with an improved disease free survival (HR: 0.49 p=0.009) and overall survival (HR: 0.54 p=0.018) and correlated linearly with ALDH1A2. Together, this information points to two different sub-types of pancreatic adenocarcinoma, and these sub-types correlated with patients’ outcome and were defined by the presence of a SV2A/ ALDH1A1/2 expressing clone with neuroendocrine features. In Chapter 4, SV2A expression in cancer was validated in primary cell lines. We were able to demonstrate pancreatic adenocarcinoma heterogeneity according to neuroendocrine clonal features. When comparing SV2 expressing cell lines with SV2 negative cell lines, we found that SV2+ cell lines were more differentiated and differ from SV2 negative cell lines regarding KRAS mutation, proliferation and response to chemotherapy. In Chapter 5 we aimed at determining if this SV2 positive clone could explain chemoresistance observed in patients. We found an absolute increase in SV2A expressing cells, with multiple lines of evidence, in patients, primary cell lines and xenografts. Although, we have been able to show evidence that pancreatic adenocarcinoma is a heterogeneous disease, our findings warrant further investigation. To further characterize SV2A expressing clones after treatment with neoadjuvant chemotherapy in our cohort, we have performed laser capture microdissection of the paraffin embedded tissue in this study and will analyze the tissue for known genetic mutations in pancreatic adenocarcinoma; secondly, we want to know what will happen after knocking down SV2A expression in our cell lines followed by treatment with gemcitabine to determine if SV2A is functionally important; finally, since our previous efforts with a promoter – reporter and SmartFlare™ have failed, we will utilize a novel PrimeFlow™ RNA-ISH assay followed by FACS and RNA sequencing to further characterize this cellular clone. Overall our data proves, with multiple lines of evidence, that pancreatic adenocarcinoma is a heterogeneous disease, defined by a clone of SV2A expressing cells, with neuroendocrine features. The presence of this clone in patients’ tissue correlates with patient’s disease free survival and overall survival. Together with patterns of proliferation and ALDH1A1/2 co-expression, this clone seems to present a stem-cell-like behavior and is associated with chemoresistance, since it increases after chemotherapy, both in patients and primary cell lines.

Estudo da partição de fitase produzida por Aspergillus niger var. phoenicis utilizando bioconversão extrativa em sistemas de duas fases aquosas PEG/citrato

Existem diversos métodos tradicionais que são utilizados para extratir biomoléculas produzidas por fermentação convencional. Um método alternativo é o sistema de duas fases aquosas, o qual foi desenvolvido para a extração de bioprodutos. A bioconversão extrativa trata-se de um sistema de duas fases aquosas que integra cultivo microbiológico à produção e recuperação do bioproduto. Fitases são fosfatases específicas que estão envolvidas na catálise do ácido fitico. O objetivo deste trabalho foi estudar a partição da fitase produzida por A. niger var. phoenicis por bioconversão extrativa utilizando PEG/citrato. Realizou-se um planejamento fatorial completo 25, estudando as seguintes variáveis: massa molar do PEG, concentração do PEG, concentração de citrato, pH e agitação, onde obteve-se como variável-resposta o coeficiente de partição em atividade (KATIV). Neste trabalho conseguiu-se um coeficiente de partição de 25,77 utilizando MPEG (8000 g/mol), CPEG, (26,0% m/m), CCIT (20,0% m/m), pH (6,0) e agitação (100 rpm). Através dos resultados obtivos, pode-se concluir que a fitase utilizada no presente estudo apresenta uma tendência de particionar para a fase superior do sistema (K>1). A técnica de fermentação extrativa utilizando SDFA PEG/citrato demonstrou ser promissora para extração de fitase produzida por A. niger var. phoenicis, podendo ser aplicada na composição de rações comerciais.

Aproveitamento do Óleo das Amêndoas de Tucumã do Amazonas na Produção de Biodiesel

A falta de disponibilidade de energia elétrica é um dos principais motivos pelo baixo Índice de Desenvolvimento Humano das comunidades isoladas localizadas na Amazônia. O biodiesel produzido a partir de óleos vegetais extraídos de espécies oleaginosas nativas de forma sustentada é uma das melhores alternativas energéticas para a região. O tucumã do amazonas, Astrocaryum aculeatum, é uma espécie de palmeira que produz um fruto muito apreciado na região, a partir do qual se obtém uma amêndoa com alto teor de óleo. Nesse estudo, foi avaliada a produção de biodiesel etílico, a partir de diferentes lotes de óleos de tucumã do amazonas, com índices de acidez baixos e elevados, pela transesterificação por catálise básica e ácida homogêneas, respectivamente. Na catálise ácida, foram testados HCl e H2SO4 como catalisadores nas concentrações de 0,0625 a 1,000 M, empregando etanol hidratado na proporção molar de 1:6 e a reação conduzida a 90 ºC por 24 h. Na catálise básica, foram testados NaOH e KOH, nas proporções de 0,5 a 2,0 %, empregando etanol anidro na proporção molar de 1:12 e a reação conduzida a 80 ºC por 2 h. O biodiesel obtido em cada experimento foi analisado por métodos físicos (massa específica) e cromatográficos (CLAE em fase reversa). Análises cromatográficas indicaram que as melhores conversões foram alcançadas por amostras de biodiesel com massas específicas inferiores a 0,87 g.cm-1. As amostras de biodiesel obtidas com melhor qualidade foram obtidas utilizando-se os catalisadores ácidos a 1,0 M com rendimentos superiores a 90%. No caso da catálise básica, obteve-se biodiesel de boa qualidade empregando-se o catalisador NaOH a 2,0%, porém com rendimento inferior a 60 %. Contudo, em ambos os casos, foi possível identificar um excelente potencial de produção de biocombustível, a partir do óleo das amêndoas de tucumã.

Clivagem e caracterização de frutalina recombinante produzida em Escherichia coli

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica)

Mineralizações associadas a shear zone networking na vertente oriental da Serra de Arga (Minho, Portugal)

Dissertação de mestrado em Ordenamento e Valorização de Recursos Geológicos

Degradação fotocatalítica de petróleo e seus derivados através da utilização de nanopartículas de dióxido de titânio puro e misturado com óxido de grafeno reduzido

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia de Materiais

Tipologia de Lesch em alcoolistas no Brasil

OBJETIVOS: Alcoolismo é uma doença heterogênea, com apresentações clínicas, resultados terapêuticos e recaídas variáveis, indicando vulnerabilidades biológicas diferentes. A Tipologia de Lesch distingue quatro categorias de alcoolismo: Tipo I - graves sintomas de abstinência; Tipo II - álcool como solução para conflitos; Tipo III - álcool para "tratamento" de desordens psiquiátricas; Tipo IV - alterações neurológicas antes do uso de álcool. Este estudo verificou a aplicabilidade de uma classificação do tipo clínico de alcoolismo pela Tipologia de Lesch em um ambulatório público brasileiro de atendimento especializado de alta demanda. MÉTODO: Estudo seccional descritivo, que classificou pacientes do ambulatório de alcoolismo do Hospital Universitário da Universidade Federal do Espírito Santo de acordo com a Tipologia de Lesch. RESULTADOS: A diferenciação pela Tipologia de Lesch foi facilmente conduzida em um serviço ambulatorial público de alta demanda. De 170 pacientes, 21,2% foram classificados como Tipo I; 29,4%, Tipo II; 28,8%, Tipo III e 20,6%, Tipo IV. Embora os diferentes tipos de alcoolismo tenham diferentes apresentações clínicas, o padrão de ingestão alcoólica, idade da primeira ingestão e tempo de abstinência não diferiram entre os tipos de alcoolismo. CONCLUSÃO: A distinção do tipo clínico de alcoolismo de acordo com a Tipologia de Lesch foi considerada aplicável em um ambulatório público brasileiro de grande demanda, sendo os dados encontrados semelhantes aos relatados em estudos realizados em diferentes países. A aplicação dessa classificação poderá definir mudanças nas estratégias de enfrentamento individualizadas do alcoolismo, sendo, entretanto, necessários estudos de seguimento para avaliar os resultados terapêuticos das mesmas.

“PhenoWorld”: a new multidimensional strategy for studying behaviour in rodents

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde

Fendas de secagem em vigas de madeira: causas, efeitos na capacidade resistente e métodos de reparação

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Civil

Remoção fotocatalítica de micropoluentes em meios porosos funcionalizados

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Civil

HOXA9 as a key regulator in glioma initiation, aggressiveness and response to therapy

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde

Síntese e testes in vitro de novas pirimido[5,4-d] pirimidinas em células resistentes do cancro coloretal

Dissertação de mestrado em Química Medicinal

Qualidade da vinculação e dos relacionamentos significativos na gravidez

O estudo apresentado neste artigo destinou-se a investigar a qualidade da vinculação e das relações significativas na gravidez. Mais precisamente, teve por objectivos (1) determinar as características sociais e demográficas e as condições anteriores de existência que se associam e permitem prever um estilo de vinculação (in)seguro e (2) estimar o impacto do estilo de vinculação na qualidade do relacionamento e do apoio por parte do companheiro e de uma outra pessoa significativa, na gravidez. Uma amostra de 130 grávidas (66 adolescentes e 64 adultas) foi avaliada no último trimestre de gestação quanto ao estilo de vinculação e à qualidade do relacionamento e do apoio por parte do companheiro e de uma outra pessoa significativa (com base na Attachment Style Interview, ASI; Bifulco, Figueiredo, Guedeney, Gorman, Hays et al., 2004; Bifulco, Moran, Ball & Bernazzani, 2002a; Bifulco, Moran, Ball & Lillie, 2002b). A amostra foi recolhida na Maternidade de Júlio Dinis (Porto) e é bastante heterogénea do ponto de vista social e demográfico, em características como: a idade, o nível educacional, o estado civil, o estatuto ocupacional e o tipo de agregado familiar, embora fundamentalmente constituída por grávidas primíparas. Os resultados mostram que um estilo inseguro de vinculação pode ser previsto na sequência de separação ou divórcio parental durante a infância ou adolescência e quando a grávida está desempregada, e que a gravidez na adolescência se associa ao estilo de vinculação desligado. Mostram ainda que um estilo inseguro de vinculação permite prever um pior relacionamento na gravidez, quer com o companheiro, quer com a outra pessoa significativa, principalmente a presença de relações discordantes com o companheiro e de relações apáticas com a outra pessoa significativa. As estratégias emaranhadas afectam a relação com o companheiro (em aspectos como menos confiança, menos suporte emocional e mais interacção negativa), mas não a relação com a outra pessoa significativa; enquanto as estratégias desligadas afectam a relação com a outra pessoa significativa (em aspectos como menos actividades partilhadas e menos interacção positiva), mas não a relação com o companheiro, e as estratégias amedrontadas afectam o relacionamento, tanto com o companheiro (em aspectos como menor sentimento de ligação) quanto com a outra pessoa significativa (em aspectos como menos confiança). De acordo com a Teoria da Vinculação, conclui-se que condições adversas de existência (anteriores e actuais) propiciam vinculação insegura e que o estilo de vinculação interfere na qualidade do relacionamento com o companheiro e com outras pessoas significativas, nomeadamente na capacidade da grávida recorrer a apoio.

Avaliação da dosagem direta do colesterol-LDL em amostras de sangue de 10.664 pacientes em comparação com o uso da fórmula de Friedewald

OBJETIVO: Avaliar a dosagem direta do colesterol LDL (LDL-C) por um método homogêneo, em comparação com a estimativa pela fórmula de Friedewald, em uma grande população heterogênea. MÉTODOS: As dosagens do colesterol total (ColT) e dos triglicerídeos (Trig) foram realizadas por métodos enzimáticos tradicionais. As dosagens do HDL-C e do LDL-C foram realizadas por métodos diretos, sem precipitação, e a estimativa da fração LDL-C calculada pela fórmula de Friedewald. RESULTADOS: Por análise de regressão linear, os dois métodos apresentaram coeficientes de correlação extremamente significativos (p<0,001). Entretanto, a fórmula de Friedewald apresentou um bias positivo em relação ao método direto, mais pronunciado com níveis de ColT > 201 mg/dL. Este bias positivo também ocorreu com relação a níveis de Trig < 150 mg/dL. Com níveis de Trig entre 151-200 mg/dL e entre 201-300 mg/dL, não foi observado bias entre os dois métodos. Por outro lado, com níveis de Trig entre 301-400 mg/dL, este bias da fórmula de Friedewald tornou-se negativo. CONCLUSÃO: Foi possível demonstrar que a fórmula de Friedewald não apresenta um desempenho homogêneo para a estimativa do LDL-C em amostras com diferentes níveis de Trig, em comparação com o método direto, podendo causar dúvidas na classificação quanto ao risco de desenvolver doença arterial coronariana.

Avaliação da expressão de mediadores imunitários em amostras de cetáceos capturados acidentalmente em Portugal Continental

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária