Chronic treatment of hypertensive patients with converting enzyme inhibitors.

It is widely accepted that pharmacologic reduction of the blood pressure of hypertensive patients reduces the risk of at least some of the major cardiovascular complications (1-5). All major studies were carried out before orally active converting enzyme inhibitors had become available. In other words, very effective antihypertensive drugs have been around for quite some time and have already proven their efficacy. Therefore, the considerable enthusiasm that has developed during the very recent years for the new converting enzyme inhibitors should be evaluated in the light of previously available antihypertensive drugs, the more so, as drugs cheaper than converting enzyme inhibiting agents are presently available. Thus, the increased expense when using this new class of antihypertensive compounds should be justified by a therapeutic gain. When evaluating a class of antihypertensive drugs such as converting enzyme inhibitors, there are basically three main considerations: What is their efficacy in long-term use? This includes the effect on blood pressure, on heart, on hemodynamics, and on blood flow distribution. What are the metabolic effects? What is the effect on sodium and potassium excretion? How are the serum lipids affected by its use? Are there any untoward effects related either to the chemical structure of the compound per se or rather to the approach? In particular, are there any central effects of the drug which can cause discomfort to the patient? The following discussion has the principal aim to review these aspects with chronic use of oral converting enzyme inhibiting agents without, however, even attempting to provide an exhaustive review of the subject.

Variability and resistance mutations in the hepatitis C virus NS3 protease in patients not treated with protease inhibitors

The goal of treatment of chronic hepatitis C is to achieve a sustained virological response, which is defined as exhibiting undetectable hepatitis C virus (HCV) RNA levels in serum following therapy for at least six months. However, the current treatment is only effective in 50% of patients infected with HCV genotype 1, the most prevalent genotype in Brazil. Inhibitors of the serine protease non-structural protein 3 (NS3) have therefore been developed to improve the responses of HCV-infected patients. However, the emergence of drug-resistant variants has been the major obstacle to therapeutic success. The goal of this study was to evaluate the presence of resistance mutations and genetic polymorphisms in the NS3 genomic region of HCV from 37 patients infected with HCV genotype 1 had not been treated with protease inhibitors. Plasma viral RNA was used to amplify and sequence the HCV NS3 gene. The results indicate that the catalytic triad is conserved. A large number of substitutions were observed in codons 153, 40 and 91; the resistant variants T54A, T54S, V55A, R155K and A156T were also detected. This study shows that resistance mutations and genetic polymorphisms are present in the NS3 region of HCV in patients who have not been treated with protease inhibitors, data that are important in determining the efficiency of this new class of drugs in Brazil.

New human kallikrein 14: enzymatic characterization and inhibitors development.

RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC En biologie, si une découverte permet de répondre à quelques questions, en général elle en engendre beaucoup d'autres. C'est ce qui s'est produit récemment dans le monde des kallicréines. De la famille des protéases, protéines ayant la faculté de couper plus ou moins spécifiquement d'autres protéines pour exercer un rôle biologique, la famille des kallicréines humaines n'était composée que de 3 membres lors du siècle dernier. Parmi eux, une kallicréine mondialement utilisée pour détecter le cancer de la prostate, le PSA. En 2000, un chercheur de l'hôpital universitaire Mont Sinaï à Toronto, le Professeur Eleftherios Diamandis, a découvert la présence de 12 nouveaux gènes appartenant à cette famille, situés sur le même chromosome que les 3 premières kallicréines. Cette découverte majeure a placé les spécialistes des kallicréines face à une montagne d'interrogations car les fonctions de ces nouvelles protéases étaient totalement inconnues. La kallicréine humaine 14 (hK14) présente un intérêt particulier, car elle se retrouve associée à différents cancers, notamment les carcinomes ovariens et mammaires. Cette association ne répond cependant pas à la fonction de cette protéase. L'objectif de ce travail de thèse était donc de découvrir, dans un premier temps, la spécificité de cette nouvelle kallicréine, c'est-à-dire le type de coupure qu'elle engendre au niveau des protéines qu'elle cible. Utilisant une technologie de pointe qui exploite la propriété des bactériophages à se répliquer dans les bactéries à l'infini, des dizaines de millions de combinaisons protéiques aléatoires ont été présentées à hK14, qui a pu sélectionner celles qui lui étaient favorables pour la coupure. Cette technique qualitative porte le nom de Phage Display Substrate. Une fois la sélection réalisée, il fallait transférer ces séquences coupées ou substrats dans un système permettant de donner une valeur quantitative à l'efficacité de coupure. Pour cela nous avons développé une technologie qui permet d'évaluer cette efficacité en utilisant des protéines fluorescentes de méduse, modifiées génétiquement, dont l'excitation de la première (CFP : cyan fluorescent protein) par la lumière à une certaine longue d'onde permet le transfert d'énergie à la seconde (YFP : yellow fluorescent protein), via un substrat qui les lie. Pour que ce transfert d'énergie se produise, il faut que les deux protéines fluorescentes soient proches, comme c'est le cas lorsqu'elles sont liées par un substrat. La coupure de ce lien provoque un changement de transfert d'énergie qui est quantifiable en utilisant un spectrofluoromètre. Cette technologie permet donc de suivre la réaction d'hydrolyse (coupure) des protéases. Afin de poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre la fonction biologique d'hK14 ainsi que son éventuelle implication dans le cancer, nous avons développé des inhibiteurs spécifiques d'hK14. Les séquences qui on été le plus efficacement coupées par hK14 ont été utilisées pour transformer deux types d'inhibiteurs classiques, qui circulent dans notre sang, en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Selon les résultats obtenus in vitro, ils pourront être évalués in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. RESUME Les protéases sont des enzymes impliquées dans des processus physiologiques mais aussi parfois pathologiques. La famille des kallicréines tissulaires humaines représente le plus grand groupe de protéases humaines, dont plusieurs pourraient participer au développement de certaines maladies. D'autre part, ces protéases sont apparues comme des marqueurs de pathogénicité potentiels, notamment dans les cas de cancers hormono-dépendants. La kallicréine humaine 14 a été récemment découverte et son implication dans quelques maladies, particulièrement dans le cas de tumeurs, semble probable. En effet, son expression génique est augmentée au niveau des tissus cancéreux de la prostate et du sein et son expression protéique s'est révélée plus élevée dans le sérum de patientes atteintes d'un cancer du sein ou des ovaires. Cependant, comme c'est le cas pour la plupart des kallicréines, sa fonction est encore inconnue. Afin de mieux connaître son rôle biologique et/ou pathologique, nous avons décidé de caractériser son activité enzymatique. Nous avons tout d'abord mis au point un système de substrats entièrement biologique permettant d'étudier in vitro l'activité des protéases. Ce système est basé sur le phénomène de FRET, à savoir le transfert d'énergie de résonance fluorescente qui intervient entre deux molécules fluorescentes voisines si le spectre d'émission de la protéine donneuse chevauche le spectre d'excitation de la protéine receveuse. Nous avons fusionné de manière covalente une protéine fluorescente bleue (CFP) et une jaune (YFP) en les liant avec diverses séquences. Par clivage de la séquence de liaison, une perte du transfert d'énergie peut être mesurée par un spectrofluoromètre. Cette technologie représente un moyen facile de suivre la réaction d'hydrolyse des protéases. Les conditions optimales de production de ces substrats CFP-YFP ont été déterminées, de même que les paramètres pouvant éventuellement influencer le FRET. Ce système possède une grande résistance à la protéolyse non spécifique et est applicable à un grand nombre de protéase. Contrairement aux substrats fluorogéniques, il permet d'étudier les acides aminés se trouvant des deux côtés du site de clivage. Ce système étant entièrement biologique, il est le reflet des interactions protéine-protéine et représente un outil biologique facile, bon marché et rapide pour caractériser les protéases. Dans un premier temps, hK14 a été mise en présence d' une banque de haute diversité de pentapeptides aléatoires présentée à la surface de phages afin d'identifier des substrats spécifiques. Ensuite, le système CFP-YFP a été employé pour trier les peptides sélectionnés afin d'identifier les séquences de substrats les plus sensibles et spécifiques pour hK14. Nous avons montré, qu'en plus de sa prévisible activité de type trypsine, hK14 possède aussi une très surprenante activité de type chymotrypsine. Les séquences les plus sensibles ont été choisies pour cribler la banque de donnée Swissprot, permettant ainsi l'identification de 6 substrats protéiques humains potentiels pour hK14. Trois d'entre eux, la laminine α-5, le collagène IV et la matriline-4, qui sont des composants de la matrice extracellulaire, ont démontré une grande susceptibilité à l'hydrolyse par hK14. De plus, la séparation éléctrophorétique a montré que la dégradation de la laminine α-5 et de la matriline-4 par hK14 devait se produire aux sites identifiés par la technologie du phage display. Pour terminer, nous avons transformé, par mutagenèse dirigée, deux serpines (inhibiteurs de protéases de type sérine) connues, AAT et ACT (alpha anti-trypsine et alpha anti-chymotrypsine), qui inhibent un vaste éventail d'enzymes humaines en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Ces inhibiteurs pourront être utilisés d'une part pour poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre l'implication d'hK14 dans des voies physiologiques ou dans le cancer et d'autre part pour les évaluer in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. SUMMARY Proteases consist of enzymes involved in physiological events, but also, in case of dysregulation, in pathogenicity. The human tissue kallikrein family represents the largest human protease cluster and includes several members that either could participate in the course of certain diseases or emerged as potential biological markers, especially in hormone dependent cancers. The human kallikrein 14 has been recently discovered and suggested implications in some disorders, particularly in tumors since its gene expression is up-regulated in prostate and breast cancer tissues and its protein expression increased in the serum of patients with breast and ovarian cancers. However, like most kallikreins, its function remains unknown. To better understand hK14 biological and/or pathological role, we decided to characterize its enzymatic activity. First of all, we developped a biological system suitable for in vitro study of protease activity. This system is based on the so-called FRET phenomenon, that is the Fluorescence Resonance Energy Transfer that occurs between two nearby fluorescent proteins if the emission spectrum of the donor overlaps the excitation spectrum of the acceptor. We fused covalently a cyan fluorescent protein (CFP) and a yellow fluorescent protein (YFP) with diverses sequences. Upon cleavage of the linker sequence by protease, the loss of energy transfer can be measured by a spectrofluorometer allowing an easy following of hydrolysis reaction. The optimal conditions to produce in bacterial system these CFP-YFP substrates were determined as well as the parameters that could eventually influence the FRET. This system demonstrated a high degree of resistance to non-specific proteolysis and applicability to various conditions corresponding to a great number of existing proteases. Other avantages are the possibility to study the amino acids located both sides of the cleavage site as well as the interest to work in a full biological system reflecting protein-protein interaction. A phage substrate library with exhaustive diversity was used prior to CFP-substrate-YFP system to isolate specific human kallikrein 14 substrates. After that the CFP-YFP system was used to sort peptides and identify highly sensitive and specific substrate sequences for hK14. We showed that besides its predictable trypsin-like activity, hK14 also possesses a surprising chymotrypsin-like activity. The screening of the Swissprot database was achieved with the most sensitive sequences and allowed the identification of 6 potential human protein substrates for hK14. Three of them, laminin α-5, collagen IV and matrilin-4, which are components of the extracellular matrix were incubated with hK14, by which they were efficiently hydrolyzed. Moreover, electrophoretic separation revealed that degradation of laminin α-5 and matrilin-4 by hK14 generated fragments with identical molecular size than the predicted N-terminal fragments that would result from hK14 specific cleavage, proving the value of phage display substrate to identify potential substrates. Finally, with site-directed mutagenesis, we transformed two well-known serpins (serine protease inhibitors), AAT and ACT (alpha anti-trypsin and alpha anti-chymotrypsin), which inhibit a vast spectrum of human enzymes into highly efficient and specific hK14 inhibitors. These inhibitors will be used to pursue experiments that could help understand hK14 implication in physiological pathways as well as in cancer biology and also to perform their in vivo evalution as potential cancer treatment.

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus resensitization by protein synthesis inhibitors : proposal for a mechanism

RESUME Staphylococcus aureus est un important pathogène à gram-positif, à la fois responsable d'infections nosocomiales et communautaires. Le S. aureus résistant à la méthicilline est intrinsèquement résistant aux bêta-lactamines, inhibiteurs de la synthèse de la paroi bactérienne, grâce à une enzyme nouvellement acquise, la protéine liant la pénicilline 2A, caractérisée par une faible affinité pour ces agents et pouvant poursuivre la synthèse de la paroi, alors que les autres enzymes sont bloquées. Ce micro-organisme a également développé des résistances contre quasiment tous les antibiotiques couramment utilisés en clinique. Parallèlement au développement de molécules entièrement nouvelles, il peut être utile d'explorer d'éventuelles caractéristiques inattendues de médicaments déjà existants, par exemple en les combinant, dans l'espoir d'un potentiel effet synergique. Comprendre les mécanismes de tels effets synergiques pourrait contribuer à la justification de leur utilisation clinique potentielle. Récemment, un effet synergique contre le S. aureus résistant à la méthicilline a été décrit entre la streptogramine quinupristine-datfopristine et les bêta-lactamines, aussi bien in vitro qu'in vivo. Le présent travail a pour but de proposer un modèle pour le mécanisme de cette interaction positive et de l'étendre à d'autres classes d'antibiotiques. Premièrement, un certain nombre de méthodes microbiologiques ont permis de mieux cerner la nature de cette interaction, en montrant qu'elle agissait spécifiquement sur le S. aureus résistant à la méthicilline et qu'elle était restreinte à l'association entre inhibiteurs de la synthèse des protéines et bêta-lactamines. Deuxièmement, L'observation de l'influence des inhibiteurs de la synthèse des protéines sur la machinerie de la paroi bactérienne, c'est-à-dire sur l'expression des protéines liant la pénicilline, responsables de la synthèse du peptidoglycan, a montré une diminution de la quantité de ta protéine liant la pénicilline 2, connue pour posséder une activité de transglycosylation, indispensable au bon fonctionnement de la protéine liant la pénicilline 2A, responsable de la résistance à la méthicilline. Troisièmement, l'analyse fine de la composition du peptidoglycan extrait de bactéries, avant ou après traitement par des inhibiteurs de la synthèse des protéines, a montré des altérations corrélant avec leur capacité à agir en synergie avec les bêta-lactamines contre S. aureus résistant à ta méthicilline. Ces altérations dans les muropeptides pourraient représenter une signature de la diminution de la quantité de la protéine liant la pénicilline 2. Le modèle mécanistique retenu considère que les inhibiteurs de la synthèse des protéines pourraient diminuer l'expression de la protéine Liant la pénicilline 2, indispensable à la résistance à la méthiciltine, et que ce déséquilibre dans les enzymes synthétisant la paroi bactérienne pourrait générer une signature dans les muropeptides. SUMMARY Staphylococcus aureus is a major gram-positive pathogen causing both hospital-acquired and community-acquired infections. Methicillin- resistant Staphylococcus aureus is intrinsically resistant to the cell wall inhibitors beta-lactams by virtue of a newly acquired cell-wall-building enzyme, tow-affinity penicillin-binding protein 2A, which can build the wall when other penicillin-binding proteins are blocked. Moreover, the microorganism has developed resistance to virtually all non-experimental antibiotics. In addition of producing entirely new molecules, it is useful to explore unexpected features of existing drugs, for example by using them in combination, expecting drug synergisms. Understanding the mechanisms of such synergisms would help justify their putative clinical utilization. Recently, a synergism between the streptogramin quinupristin-dalfopristin and beta-lactams was reported against methicillin-resistant S. aureus, both in vitro and in vivo. The present work intends to propose a model for the mechanism of this positive interaction and to extend it to other drug classes. First, microbiological experimentation helped better defining the nature of this interaction, restricting it to methicillin-resistant S. aureus, and to the association of protein synthesis inhibitors with beta-lactams. Second, the observation of inhibitors of protein synthesis influence on the cell-wall-building machinery, i.e. on the expression of penicillin-binding proteins responsible for peptidoglycan synthesis, showed a decrease in the amount of penicillin-binding protein 2, known to provide a transglycosylase activity for glycan chain elongation, indispensable for the functionality of the low-affinity penicillin-binding protein 2A responsible for methicillin resistance. Third, the fine analysis of the peptidoglycan composition purified from bacteria before or after treatment with inhibitors of protein synthesis showed alterations that correlated with their ability to synergize with beta-lactams against methicillin-resistant S. aureus. These muropeptide alterations could be the signature of decrease in the amount of penicillin-binding protein 2. The retained mechanistic model is that inhibitors of protein synthesis could decrease the expression of penicillin-binding protein 2, wich is indispensable for methicillin-resistance, and that this imbalance in cell-wall-building enzymes could generate a muropeptide signature.

Kazal-type serine proteinase inhibitors in the midgut of Phlebotomus papatasi

Sandflies (Diptera: Psychodidae) are important disease vectors of parasites of the genus Leishmania, as well as bacteria and viruses. Following studies of the midgut transcriptome of Phlebotomus papatasi, the principal vector of Leishmania major, two non-classical Kazal-type serine proteinase inhibitors were identified (PpKzl1 and PpKzl2). Analyses of expression profiles indicated that PpKzl1 and PpKzl2 transcripts are both regulated by blood-feeding in the midgut of P. papatasi and are also expressed in males, larva and pupa. We expressed a recombinant PpKzl2 in a mammalian expression system (CHO-S free style cells) that was applied to in vitro studies to assess serine proteinase inhibition. Recombinant PpKzl2 inhibited α-chymotrypsin to 9.4% residual activity and also inhibited α-thrombin and trypsin to 33.5% and 63.9% residual activity, suggesting that native PpKzl2 is an active serine proteinase inhibitor and likely involved in regulating digestive enzymes in the midgut. Early stages of Leishmania are susceptible to killing by digestive proteinases in the sandfly midgut. Thus, characterising serine proteinase inhibitors may provide new targets and strategies to prevent transmission of Leishmania.

Study of drug tolerance mechanisms and of the calcineurin pathway in the opportunistic pathogen "Candida albicans"

ABSTRACT :Azole antifungal drugs possess fungistatic activity in Candida albicans making this human pathogen tolerant to these agents. The conversion of azoles into fungicidal agents is of interest since their fungistatic properties increase the ability of C. albicans to develop drug resistance. In C. albicans, the phosphatase calcineurin (calcineurin) is essential for antifungal drug tolerance. Up to now, the only known target of calcineurin is Crzl, which is a transcription factor (TF) involved in responses to ionic stress. Thus, most of the components of the calcineurin signaling remain to be identified in C. albicans.In this work, the calcineurin pathway was investigated in order to i) characterize the role of calcineurin in the biology of C. albicans, ii) identify putative targets of calcineurin and iii) characterize the phenomenon of tolerance to antifungal drugs. Towards these aims, four different approaches were used.First, using C. albicans microarrays, an attempt was made to identify a set of calcineurindependent genes (CDGs). Since CDGs were highly dependent upon the external stimulus used to activate calcineurin (Ca2+ or terbinafine), this stimulus bias was bypassed by the construction of strains expressing a truncated autoactive form of calcineurin (Cmp1tr) in a doxycyclinedependent manner. The characterization of Cmpltr was undertaken and results showed that it mimicked awild-type activated calcineurin for all tested phenotypes (i.e. Cnbl-dependence, inhibition by FK506, phosphatase 2B activity, ability to dephosphorylate Crzl and to regulate Crz1-and calcineurin-dependent genes, role in antifungal drug tolerance and susceptibility, role in colony formation on Spider agar). Cmp1tr was therefore considered as a valid tool to study the calcineurin signaling pathway. In silico analysis of CDGs allowed the identification of i) a significant overlap between CDGs and genes regulated by the Cyrl signalíng pathway, ii) putative interactions between calcineurin activation and cell wall reorganization and phospholipid transport, iii) a putative interactión between calcineurin and the regulation of translation and iv) a putative relation between calcineurin and proteasome regulation. Further in silico analyses of the promoters of Crz1-independent CDGs were performed to identify TFs (other than Crz1) that were likely to regulate CDGs and therefore to be a direct target of calcineurin. The analyses revealed that Rpn4 and Mnl1 were TFs likely to be regulated by calcineurin.Second, in order to better characterize azole tolerance, an attempt was made to i) confirm the role of Hsp90 in fluconazole tolerance with a doxycycline-dependent Hsp90 expression system and ii) assess its calcineurin-dependence. Hsp90 was found to be significantly involved in fluconazole tolerance. However, results were not in agreement with the hypothesis that Hsp90 mediates fluconazole tolerance by the only downstream effector calcineurin. Rather Hsp90 is interacting with numerous components for fluconazole tolerance.Third, a collection of C. albicans TFs mutants were screened for loss of tolerance to terbinafine and fluconazole in order to identify TFs involved in antifungal drug tolerance. Out of the 265 TFs mutants screened, only the upc2Δ/Δ mutant showed a loss of fluconazole and terbinafine tolerance. Interestingly, no relation between Upc2 and calcineurin activity was found. These results suggested that the tolerance to antifungal drugs must not be only considered as a calcineurin-dependent phenomenon in C. albicans.Fourth, using FRCS analyses, an attempt was made to identify putative signs of programmed cell death (PCD) in calcineurin mutant cells upon loss of tolerance to terbinafine. A high proportion of cells died from both RO5-dependent (which is a sign of PCD) and ROS-independent (which is a sign of loss of homeostasis) processes in the calcineurin mutant. While these results suggest that calcineurin represses both loss of homeostasis and PCD, the role of calcineurin in PCD is still an open question.In conclusion, this work allowed i) the identification of several putative calcineurin targets, ii) the discovery of several links between calcineurin and signaling pathways and important biological processes and iii) the identification of novel components of calcineurin-independent mechanisms that participate in tolerance to antifungal drugs in C. albicans.RÉSUME :Les azoles sont des antifongiques qui présentent une activité fongistatique contre Candida albicans et rendent cette levure tolérante à ces agents. La conversion des azoles en agents fongicides est d'intérêts car leurs propriétés fongistatiques favorisent le développement de résistance aux drogues chez C. albicans. La calcineurine (calcineurin) est une phosphatase essentielle pour la tolérance aux antifongiques chez C. albicans. La seule cible connue de la calcineurin est Crz1, un facteur de transcription (FT) impliqué dans la réponse aux stress ionique. Ainsi, la plupart des constituants de la voie de signalisation de la calcineurin restent encore à être identifiés chez C. albicans.Dans ce travail de thèse, la voie de signalisation de la calcineurin a été étudiée de sorte à i) caractériser le rôle de la calcineurin dans la biologie de C. albicans, ii) identifier de nouvelles cibles de la calcineurin et iii) caractériser le phénomène de tolérance aux antifongiques. A ce propos, quatre approches ont été entreprises.Premièrement, des puces à ADN de C. albicans ont été utilisées afin d'identifier les gènes dépendants de la calcineurin (GDCs). Les GDCs étant étroitement dépendants du stimulus utilisé pour activer la calcineurin, le biais «stimulus» a été évité via la construction d'une souche exprimant une forme tronquée et autoactive de la calcineurin (Cmp1tr), en présence de doxycycline. La caractérisation de Cmp1tr a été entreprise et les résultats ont montré qu'elle mimait une calcineurin sauvage et activée pour la plupart des phénotypes testés (i.e. dépendance à Cnb1, inhibition par le FK506, activité phosphatase 2B, déphosphorylation de Crz1 et régulation de gènes dépendant de la calcineurin, rôle dans la tolérance et la susceptibilité aux antifongiques, rôle dans la formation des colonies sur milieu Spider). Cmp1tr a donc été considéré comme un outil pertinent pour l'étude de la voie de signalisation de la calcineurin. Les analyses in silico des GDCs ont permis l'identification i) d'un chevauchement entre les GDCs èt les gènes régulés par la voie de signalisation de Cyrl, ii) d'une interaction entre la calcineurin et la réorganisation de la paroi cellulaire ainsi que le transport des phospholipides, iii) d'une interaction entre calcineurin et la régulation de la traduction et iv) une relation entre la calcineurin et la régulation du protéasome. De plus, une analyse in silico des promoteurs des GDCs avec une régulation indépendante de Crz1 a permis d'identifier deux FTs qui pourraient être des cibles directes de la calcineurin, Rpn4 et Mnll.Deuxièmement, afin de caractériser la tolérance aux azoles, il a été entrepris i) de confirmer le rôle de Hsp90 dans la tolérance au fluconazole en utilisant un système d'expression dépendant de la doxycycline et ii) de caractériser sa dépendance à la calcineurin. Hsp90 a été montré impliqué dans la tolérance aux azoles. Cependant, les résultats n'ont pas corroboré une hypothèse expliquant le rôle d'Hsp90 dans la tolérance aux antifongiques par son unique. interaction avec la calcineurin. Il a été proposé que le rôle d'Hsp90 dans la tolérance aux antifongiques soit dû à ces multiples interactions avec le protéome de C. albicans plutôt que par son interaction avec un partenaire unique.Troisièmement, une collection de mutant pour des FTs de C. albicans a été criblée pour une perte de tolérance au fluconazole ou à la terbinafine, de sorte à identifier les FTs impliqués dans la tolérance aux antifongiques. Sur les 265 FTs passés au crible, seul le mutant upc2Δ/Δ a montré une perte de tolérance au fluconazole et à la terbinafine. Aucune relation n'a été trouvée entre la calcineurin et l'activité d'Upc2. Ces résultats suggèrent que la perte de tolérance aux antifongiques ne doit pas être considérée comme un phénomène exclusivement lié à la voie de signalisation de la calcineurin.Quatrièmement, en utilisant la cytométrie de flux, la présence de signes de mort cellulaire programmée (MCP) a été recherchée lors de la perte de tolérance du mutant calcineurin incubé avec de la terbinafine. Une grande proportion de cellules mortes incluant ou non une production de ROS (un signe de MCP) a été détectée dans le mutant calcineurin. Ces résultats préliminaires suggèrent que la calcineurin réprime autant la perte d'homéostasie qu'elle régule l'entrée en MCP. Cependant d'autres analyses sont nécessaires pour démontrer clairement le rôle de la calcineurin dans la régulation de la MCP.En conclusion, ce travail de thèse a permis i) l'identification de plusieurs cibles possibles de la calcineurine, ii) la découverte de plusieurs interactions entre la calcineurine et d'autres voies de signalisation et processus biologiques importants et iii) de démontrer la présence de voies indépendantes de la calcineurine impliquées dans la tolérance aux antifongiques chez C. albicans.

Inhibition of rotavirus ECwt infection in ICR suckling mice by N-acetylcysteine, peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists and cyclooxygenase-2 inhibitors

Live attenuated vaccines have recently been introduced for preventing rotavirus disease in children. However, alternative strategies for prevention and treatment of rotavirus infection are needed mainly in developing countries where low vaccine coverage occurs. In the present work, N-acetylcysteine (NAC), ascorbic acid (AA), some nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) agonists were tested for their ability to interfere with rotavirus ECwt infectivity as detected by the percentage of viral antigen-positive cells of small intestinal villi isolated from ECwt-infected ICR mice. Administration of 6 mg NAC/kg every 8 h for three days following the first diarrhoeal episode reduced viral infectivity by about 90%. Administration of AA, ibuprofen, diclofenac, pioglitazone or rosiglitazone decreased viral infectivity by about 55%, 90%, 35%, 32% and 25%, respectively. ECwt infection of mice increased expression of cyclooxygenase-2, ERp57, Hsc70, NF-κB, Hsp70, protein disulphide isomerase (PDI) and PPARγ in intestinal villus cells. NAC treatment of ECwt-infected mice reduced Hsc70 and PDI expression to levels similar to those observed in villi from uninfected control mice. The present results suggest that the drugs tested in the present work could be assayed in preventing or treating rotaviral diarrhoea in children and young animals.

Dipeptidyl peptidase IV and its inhibitors: therapeutics for type 2 diabetes and what else?

The proline-specific dipeptidyl aminopeptidase IV (DPP IV, DPP-4, CD26), widely expressed in mammalians, releases X-Pro/Ala dipeptides from the N-terminus of peptides. DPP IV is responsible of the degradation of the incretin peptide hormones regulating blood glucose levels. Several families of DPP IV inhibitors have been synthesized and evaluated. Their positive effects on the degradation of the incretins and the control of blood glucose levels have been demonstrated in biological models and in clinical trials. Presently, several DPP IV inhibitors, the "gliptins", are approved for type 2 diabetes or are under clinical evaluation. However, the gliptins may also be of therapeutic interest for other diseases beyond the inhibition of incretin degradation. In this Perspective, the biological functions and potential substrates of DPP IV enzymes are reviewed and the characteristics of the DPP IV inhibitors are discussed in view of type 2 diabetes and further therapeutic interest.

Acetylcholinesterase inhibitors and healing of hip fracture in Alzheimer's disease patients: a retrospective cohort study.

OBJECTIVES This study was designed to assess effects of cholinergic stimulation using acetylcholinesterase inhibitors (AChEIs), a group of drugs that stimulate cholinergic receptors and are used to treat Alzheimer's disease (AD), on healing of hip fractures. METHODS A retrospective cohort study was performed using 46-female AD patients, aged above 75 years, who sustained hip fractures. Study analyses included the first 6-months after hip fracture fixation procedure. Presence of AChEIs was used as predictor variable. Other variables that could affect study outcomes: age, body mass index (BMI), mental state or type of hip fracture, were also included. Radiographic union at fracture site (Hammer index), bone quality (Singh index) and fracture healing complications were recorded as study outcomes. The collected data was analyzed by student's-t, Mann-Whitney-U and chi-square tests. RESULTS No significant differences in age, BMI, mental state or type of hip fracture were observed between AChEIs-users and nonusers. However, AChEIs-users had better radiographic union at the fracture site (relative risk (RR),2.7; 95%confidence interval (CI),0.9-7.8), better bone quality (RR,2.0; 95%CI,1.2-3.3) and fewer healing complications (RR,0.8; 95%CI,0.7-1.0) than nonusers. CONCLUSION In elderly female patients with AD, the use of AChEIs might be associated with an enhanced fracture healing and minimized complications.

Computational drug design strategies applied to the modelling of human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase inhibitors

Reverse transcriptase (RT) is a multifunctional enzyme in the human immunodeficiency virus (HIV)-1 life cycle and represents a primary target for drug discovery efforts against HIV-1 infection. Two classes of RT inhibitors, the nucleoside RT inhibitors (NRTIs) and the nonnucleoside transcriptase inhibitors are prominently used in the highly active antiretroviral therapy in combination with other anti-HIV drugs. However, the rapid emergence of drug-resistant viral strains has limited the successful rate of the anti-HIV agents. Computational methods are a significant part of the drug design process and indispensable to study drug resistance. In this review, recent advances in computer-aided drug design for the rational design of new compounds against HIV-1 RT using methods such as molecular docking, molecular dynamics, free energy calculations, quantitative structure-activity relationships, pharmacophore modelling and absorption, distribution, metabolism, excretion and toxicity prediction are discussed. Successful applications of these methodologies are also highlighted.

Differential effects of selective HDAC inhibitors on macrophage inflammatory responses to the Toll-like receptor 4 agonist LPS.

Broad-spectrum inhibitors of HDACs are therapeutic in many inflammatory disease models but exacerbated disease in a mouse model of atherosclerosis. HDAC inhibitors have anti- and proinflammatory effects on macrophages in vitro. We report here that several broad-spectrum HDAC inhibitors, including TSA and SAHA, suppressed the LPS-induced mRNA expression of the proinflammatory mediators Edn-1, Ccl-7/MCP-3, and Il-12p40 but amplified the expression of the proatherogenic factors Cox-2 and Pai-1/serpine1 in primary mouse BMM. Similar effects were also apparent in LPS-stimulated TEPM and HMDM. The pro- and anti-inflammatory effects of TSA were separable over a concentration range, implying that individual HDACs have differential effects on macrophage inflammatory responses. The HDAC1-selective inhibitor, MS-275, retained proinflammatory effects (amplification of LPS-induced expression of Cox-2 and Pai-1 in BMM) but suppressed only some inflammatory responses. In contrast, 17a (a reportedly HDAC6-selective inhibitor) retained anti-inflammatory but not proinflammatory properties. Despite this, HDAC6(-/-) macrophages showed normal LPS-induced expression of HDAC-dependent inflammatory genes, arguing that the anti-inflammatory effects of 17a are not a result of inhibition of HDAC6 alone. Thus, 17a provides a tool to identify individual HDACs with proinflammatory properties.

Regression of cardiac growth in kidney transplant recipients using anti-m-TOR drugs plus RAS blockers: a controlled longitudinal study.

BACKGROUND Left ventricular hypertrophy (LVH) is common in kidney transplant (KT) recipients. LVH is associated with a worse outcome, though m-TOR therapy may help to revert this complication. We therefore conducted a longitudinal study to assess morphological and functional echocardiographic changes after conversion from CNI to m-TOR inhibitor drugs in nondiabetic KT patients who had previously received RAS blockers during the follow-up. METHODS We undertook a 1-year nonrandomized controlled study in 30 non-diabetic KT patients who were converted from calcineurin inhibitor (CNI) to m-TOR therapy. A control group received immunosuppressive therapy based on CNIs. Two echocardiograms were done during the follow-up. RESULTS Nineteen patients were switched to SRL and 11 to EVL. The m-TOR group showed a significant reduction in LVMi after 1 year (from 62 ± 22 to 55 ± 20 g/m2.7; P=0.003, paired t-test). A higher proportion of patients showing LVMi reduction was observed in the m-TOR group (53.3 versus 29.3%, P=0.048) at the study end. In addition, only 56% of the m-TOR patients had LVH at the study end compared to 77% of the control group (P=0.047). A significant change from baseline in deceleration time in early diastole was observed in the m-TOR group compared with the control group (P=0.019). CONCLUSIONS Switching from CNI to m-TOR therapy in non-diabetic KT patients may regress LVH, independently of blood pressure changes and follow-up time. This suggests a direct non-hemodynamic effect of m-TOR drugs on cardiac mass.

Design of potent inhibitors of human RAD51 recombinase based on BRC motifs of BRCA2 protein: modeling and experimental validation of a chimera peptide.

We have previously shown that a 28-amino acid peptide derived from the BRC4 motif of BRCA2 tumor suppressor inhibits selectively human RAD51 recombinase (HsRad51). With the aim of designing better inhibitors for cancer treatment, we combined an in silico docking approach with in vitro biochemical testing to construct a highly efficient chimera peptide from eight existing human BRC motifs. We built a molecular model of all BRC motifs complexed with HsRad51 based on the crystal structure of the BRC4 motif-HsRad51 complex, computed the interaction energy of each residue in each BRC motif, and selected the best amino acid residue at each binding position. This analysis enabled us to propose four amino acid substitutions in the BRC4 motif. Three of these increased the inhibitory effect in vitro, and this effect was found to be additive. We thus obtained a peptide that is about 10 times more efficient in inhibiting HsRad51-ssDNA complex formation than the original peptide.

Histone deacetylase inhibitors impair antibacterial defenses of macrophages

Les déacetylases d'histones (HDACs) déacétylent non seulement les histones, ce qui a généralement pour effet d'augmenter la transcription et l'expression génique, mais également d'autres protéines comme par exemple des protéines de choc thermique (HSP90), la tubuline alpha, certains récepteurs aux stéroïdes ainsi que de nombreux facteurs de transcription (NF-kB p65, Sp1, etc.). Ainsi les HDACs participent au contrôle de nombreux processus cellulaires. Les inhibiteurs des HDACs (ou HDACi), de part leur capacité à induire la différenciation cellulaire et l'apoptose, sont parmi les anti-cancéreux les plus prometteurs en cours de développement pour dans le traitement des néoplasies solides et hématologiques. Récemment, l'activité anti-inflammatoire et immuno- modulatrice des HDACi a été mise en évidence et exploitée avec succès pour le traitement de pathologies auto-immunes dans des modèles précliniques. L'effet des HDACi sur la réponse immunitaire innée restant largement inconnu, nous avons entrepris la première étude d'envergure dans ce domaine. Dans un premier article, nous démontrons que les HDACi inhibent l'expression de nombreux gènes (récepteurs aux produits microbiens, cytokines, chimiokines, molécules d'adhésion et co-stimulatrices, facteurs de croissance, etc.) impliqués dans les défenses anti¬infectieuses in vitro. En accord avec ces données, les HDACi augmentent la mortalité d'animaux infectés dans des modèles de pneumonie et de candidose bénignes. De manière congruente, les HDACi protègent les animaux de mortalité induite par choc toxique et septique en inhibant la réponse inflammatoire exubérante qui caractérise ces pathologies (Roger T. et al., Blood 2011). Afin de caractériser plus en détails l'influence des HDACi sur la réponse immunitaire innée, nous avons également analysé l'impact de deux HDACi, l'acide valproïque (VPA) et la trichostatin A (TSA), sur les principaux mécanismes de défenses antimicrobiennes des macrophages. Dans un second article (Mombelli et al., Journal of Infectious Diseases 2011), nous rapportons que la VPA et la TSA diminuent la capacité des macrophages à phagocyter et à détruire les bactéries Gram-positives Staphylococcus aureus et Gram-négatives Escherichia coli. En accord avec ces données, les HDACi inhibent l'expression de molécules impliquées dans la phagocytose comme les récepteurs éboueurs (Msr 1 et CD14) et de type lectine (Dectin 1), ainsi que les récepteurs aux opsonines (intégrines). Par ailleurs, les HDACi interfèrent avec l'expression de différentes sous unités de la NADPH oxydase (gp91p"ox, p22 phox, p47 phox, p40 phox, p67 phox et Rac2) et de l'oxyde nitrique (NO) synthétase inductible (iNOS), qui sont responsables de la production de dérivés oxygénés (ROS) et nitrogénés (NO) essentiels à la destruction des microorganismes dans le phagolysosome. En résumé, cette étude décrit des mécanismes par lesquels les HDACi diminuent la capacité d'ingérer et de détruire les bactéries, et ainsi augmentent la susceptibilité aux infections. Globalement, nos données indiquent que les HDACi sont de puissants anti¬inflammatoires qui pourraient favoriser la survenue d'infections chez les patients cancéreux traités avec ces drogues, comme semble par ailleurs le suggérer des études cliniques rapportées dans la littérature. Nous proposons un suivi clinique infectieux strict chez les patients traités avec ces agents.