Policetídeos isolados de Penicillium herquei

Neste trabalho estamos portando o isolamento dos policetídeos citreoserina (1), emodina (2), janthinona (3), dihidrocitrinona (4) e citrinina H-1 (5). Os compostos foram isolados por procedimentos cromatográficos e identificados por métodos espectrais de RMN 1D e 2D e EM. Os compostos 1, 2 e 3 foram testados sobre promastigotas de Leishmania brasiliensis.

Caracterização morfológica e fisiológica de isolados de Colletotrichum sp. causadores de antracnose em solanáceas

A antracnose é uma doença freqüente nas hortaliças solanáceas. O agente causal é reportado como o fungo Colletotrichum gloeosporioides. Neste trabalho caracterizou-se a morfologia e a fisiologia de Colletotrichum sp. obtidos de pimenta, pimentão e jiló. A caracterização morfológica se baseou no tamanho e forma dos conídios e na forma dos apressórios de 30 isolados. A caracterização fisiológica foi baseada no crescimento em diferentes temperaturas, utilização de diferentes fontes de carbono e sensibilidade ao fungicida benomyl. Quinze isolados foram cultivados em meio BDA, nas temperaturas de 10, 15, 20, 25, 28, e 30ºC. Trinta e dois isolados foram cultivados em meio mínimo acrescido de glicose, frutose, lactose, maltose, sacarose ou amido. Além disso, 43 isolados foram cultivados em meio BDA suplementado com 0, 1, 10 e 100 mig/mL de benomyl. Os isolados de jiló apresentaram menor sensibilidade ao benomyl e predominância de conídios fusiformes, com ápices afilados e menores dimensões, características semelhantes às citadas para C. acutatum. Os isolados de pimentão e pimenta apresentaram alta sensibilidade ao benomyl e predominância de conídios cilíndricos com ápices arredondados, características citadas para C. gloeosporioides. Apressórios de formato irregular, circular e ovalado foram observados independente do hospedeiro de origem do isolado. O amido foi a fonte de carbono que proporcionou maior desenvolvimento micelial para a maioria dos isolados. A temperatura ótima de desenvolvimento, para todos os isolados, foi próxima a 25ºC, exceto para um único isolado de pimenta, com maior desenvolvimento a 28ºC. A velocidade de crescimento micelial para todos os isolados, em todas as temperaturas testadas, foi semelhante à apresentada pelo isolado padrão de C. acutatum usado no teste. Os isolados de pimentão e pimenta foram os que mostraram maior variabilidade para as características estudadas. Finalmente, ficou demonstrado que C. acutatum também está associado à antracnose nessas solanáceas.

Caracterização molecular através da técnica fAFLP de isolados de Diaporthe citri

A citricultura é um mercado em expansão, principalmente no Estado de São Paulo, cuja importância na balança comercial já é reconhecida. Como em qualquer espécie cultivada, o crescimento das áreas de cultivo favorecem também o crescimento de problemas fitossanitários. Desta forma, as espécies de citros são afetadas por diversas doenças destacando-se entre elas a melanose, causada por Diaporthe citri (Wolf.), à qual a grande maioria das variedades comerciais são suscetíveis. O conhecimento da diversidade intra-específica é de grande importância, já que esta poderá auxiliar na seleção de variedades com resistência. O objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade genética em isolados de Diaporthe citri, originários de diferentes locais, variedades e partes da planta, utilizando marcadores moleculares. Marcadores do tipo AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) foram utilizados para caracterização de dez isolados do patógeno. Os DNAs genômicos extraídos da massa micelial foram utilizados nas reações de amplificação. A técnica fluorescent AFLP permitiu a distinção dos isolados estudados, tendo sido classificados em quatro grupos distintos. Contudo, estes grupos não foram formados em razão da região geográfica, parte da planta ou variedade.

Variabilidade genética em isolados de Curtobacterium flaccumfaciens

A cultura do feijoeiro está sujeita à incidência de várias doenças que acarretam perdas significativas na produção, dentre as quais encontra-se a murcha-de-curtobacterium ou murcha bacteriana, causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Atualmente a murcha-de-curtobacterium tem se constituído em um novo problema para a cultura do feijoeiro em várias regiões brasileiras. A resistência genética tem sido o meio mais eficiente no controle da doença, porém a possibilidade da existência de variabilidade genética presente em isolados de Cff, pode ser uma conseqüência maléfica ao melhoramento visando a obtenção de cultivares de feijoeiro resistentes, especialmente na estabilidade e durabilidade da resistência. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética de 26 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens, 20 dos quais provenientes de feijoeiro (Cff), coletados em diferentes regiões do Brasil, quatro provenientes de coleções internacionais (Cff) e dois endofíticos de citros (C. flaccumfaciens). Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos, CffFOR2-CffREV4 e CF4-CF5, avaliando-se na especificidade em reação de PCR, para a caracterização dos 26 isolados. No estudo da variabilidade genética, utilizou-se da técnica rep-PCR e os iniciadores REP, ERIC e BOX. A partir do padrão eletroforético gerado pela amplificação dessas seqüências repetitivas no DNA genômico dos 26 isolados bacterianos, foram realizadas análises pertinentes (UPGMA SM) e obtenção de um dendograma. Considerando-se um índice de similaridade de 75%, os isolados foram distribuídos em quatro grupos distintos. Os isolados de Cff provenientes do Paraná e DF foram separados em grupos diferentes, enquanto que isolados endofíticos de citros não formaram um grupamento distinto dos de feijoeiro. Os isolados procedentes do Estados de São Paulo mostraram-se geneticamente heterogêneos, alguns se agruparam com o isolado de USA, Santa Catarina e de citros, enquanto outros agruparam-se com isolados provenientes da França e Paraná. A avaliação da especificidade dos dois pares de oligonucleotídeos, mostrou que os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 detectaram todos os 26 isolados. Os oligonucleotídeos CF4-CF5 apresentaram menor especificidade não detectando dois isolados de Cff de feijoeiro (2928) e (2936) e os isolados endofíticos de citros. Portanto como ferramenta para detecção de Cff em feijoeiro os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 revelaram ser os mais indicados.

Caracterização morfológica e identificação molecular de isolados de Fusarium graminearum associados à giberela do trigo e triticale no sul do Brasil

A giberela ou fusariose da espiga é uma das principais doenças do trigo e triticale no sul do Brasil. A espécie de fungo Fusarium graminearum é citada como agente causal da doença, muito embora, em outros países, outras espécies de Fusarium também estejam associadas à doença. No País, não existem relatos de levantamentos de espécies associadas à doença. O objetivo deste trabalho foi identificar espécies de Fusarium associados à giberela do trigo e triticale procedentes do sul do Brasil, com base na morfologia e no emprego da reação da polimerase em cadeia (PCR) baseada em oligonucletídeos específicos para espécies de Fusarium. A patogenicidade dos isolados em trigo foi avaliada em espigas de plantas cultivadas em casa de vegetação. Os 20 isolados monospóricos analisados, obtidos de espigas doentes e sementes, foram identificados como F. graminearum.

Diversidade de Phytophthora parasitica isolados de Citrus usando seqüências de nucleotídeos da região ITS-5.8S rDNA

Realizou-se estudo para caracterização e verificação da diversidade genética de Phytophthora parasitica, agente causador da gomose dos citros. Quatorze isolados de Phytophthora parasitica, provenientes do Estado de São Paulo, foram seqüenciados a partir das regiões internas transcritas (ITS1 e ITS2) do gene 5.8S. Obtiveram-se seqüências de 812 pb a 860 pb que foram comparadas com seqüências de outras espécies de Phytophthora spp depositadas no NCBI. Foram feitos estudos filogenéticos, utilizando-se o método "neighbor-joining" com 1000 "bootstrap" e construído o dendrograma mais representativo. Obtiveram-se os resultados de 98,88% a 100% de similaridade genética entre os 14 isolados paulistas, e 99,5% a 98,8% entre estes e a seqüência de P. nicotianae (gi| 8927482) obtida do GenBank NCBI.

Crescimento in vitro de isolados de Armillaria sp. obtidos de Pinus elliottii var: elliottii sob várias temperaturas

A armilariose tem sido considerada a principal doença em Pinus no Brasil. Os sintomas e danos consistem no amarelecimento de acículas, declínio, podridão de raízes, exsudação de resina e morte. A temperatura é um dos fatores ambientais que influencia patógenos, doença de plantas ou ambos. Este trabalho avaliou o comportamento de três isolados de Armillaria sp. obtidos de P. elliottii var. elliottii, submetidos a uma faixa de temperatura de 16 a 26 ºC, utilizando a biomassa seca produzida em meio líquido como parâmetro de análise. Verificou-se que todos os isolados apresentaram máxima produção de biomassa a 22 ºC. Utilizando-se de regressão cúbica encontrou-se temperaturas de máximo crescimento entre 21,79 e 23,19 ºC. De acordo com os resultados, a melhor temperatura para crescimento dos isolados testados situou-se em 22 ºC.

Variabilidade biológica de isolados do Citrus leprosis virus (CiLV) oriundos de cultivares de laranjeira

A leprose, causada pelo Citrus leprosis virus (CiLV), é uma das principais doenças presentes em pomares cítricos fluminenses. O objetivo deste trabalho foi comparar o quadro sintomatológico desenvolvido por isolados de CiLV obtidos de cultivares comerciais de laranjeira (Lima, Pêra e Seleta), inoculados mecanicamente em Chenopodium amaranticolor, em três diluições. Após cinco a sete dias da inoculação foram observadas lesões necróticas, com pequeno halo clorótico quando observadas contra a luz. O maior número de lesões, nas três diluições, foi obtido do isolado de 'Seleta', seguido por 'Pêra' e 'Lima'. A melhor diluição utilizada para a observação das lesões foi de 1:10. Os resultados demonstram uma possível variabilidade biológica entre os isolados virais e/ou uma menor ou maior replicação viral, dependendo da cultivar, indicando um possível mecanismo de resistência da planta ao vírus.

Patogenicidade de isolados de Corynespora cassiicola a diferentes espécies de plantas

Corynespora cassiicola, relatado como um patógeno com ampla gama de espécies hospedeiras, tem causado danos em várias culturas de interesse comercial. Neste trabalho avaliou-se, em ambiente de casa-de-vegetação, a patogenicidade de 15 isolados de C. cassiicola originados de diferentes espécies hospedeiras, quando inoculados em 12 diferentes espécies vegetais. Os isolados de pepino foram os mais patogênicos. Além dos híbridos de pepino, estes infectaram outras seis espécies vegetais testadas. Já os isolados de trapoeraba e de alface foram os que apresentaram menor patogenicidade, pois além dos hospedeiros originais infectaram somente uma espécie hospedeira. A maioria dos isolados apresentou elevada inespecificidade. As espécies vegetais testadas reagiram de formas diferentes quando inoculadas com diferentes isolados. O mamoeiro apresentou maior suscetibilidade, sendo infectado por 12 dos 15 isolados. Contrariamente, a trapoeraba e o assa-peixe foram suscetíveis a três e dois isolados, respectivamente.

Caracterização, compatibilidade e ocorrência de reprodução sexual entre isolados de Pyricularia grisea de diferentes hospedeiros

A brusone, causada por Pyricularia grisea (teleomorfa Magnaphorthe grisea), possui uma ampla gama de hospedeiros. No Brasil, arroz, trigo, triticale e cevada são as culturas que sofrem quedas significativas de produtividade devido ao ataque desse patógeno. Além desses cereais, outras gramíneas também têm apresentado sintomas dessa doença. Os objetivos dessa pesquisa foram: a) caracterizar sexualmente isolados de P. grisea desses hospedeiros baseado na determinação do "mating type", fertilidade, sexualidade, compatibilidade sexual, b) analisar o grau de compatibilidade sexual entre isolados de brusone de trigo e de outras gramíneas, c) estudar a ocorrência da reprodução sexual em isolados de trigo. Os resultados obtidos através de ensaios "in vitro" constataram: 1) compatibilidade sexual de P. grisea do trigo com Bromus catharticus, Phalaris canariensis e X. triticosecal; 2) desbalanço entre porcentagem de MAT1-1 e MAT1-2, com predominância de MAT1-1 na população de P. grisea do trigo; 3) existência de um campo de isolados de trigo com baixa habilidade de cruzamento; 4) baixa possibilidade de ocorrência de reprodução sexual de P. grisea em campos de trigo, mesmo com existência de ambos "mating type" num mesmo campo.

Caracterização morfofisiológica de isolados do gênero Cylindrocladium

Com o objetivo de caracterizar o "complexo" gênero anamórfico Cylindrocladium, dezoito isolados foram cultivados em meios de cultura distintos, mantidos sob diferentes temperaturas, além de ter conídios e vesículas terminais analisados morfologicamente para identificação correta das culturas. Inoculações em diferentes hospedeiros foram, também, realizadas para avaliação do comportamento patogênico dos isolados estudados. Com relação aos caracteres morfológicos, pôde-se observar que ocorrem alterações nas dimensões de conídios e na morfologia da vesícula terminal devido, provavelmente, à mudança do substrato de cultivo. Porém, a variabilidade natural nas características dessas estruturas é tão elevada que dificulta a identificação correta dos isolados. Em uma mesma cultura, por exemplo, foram observadas vesículas terminais de diferentes morfologias. Pôde-se constatar que existem diferenças patogênicas e fisiológicas entre os isolados, uma vez que houve a formação de grupos distintos quando tais características foram consideradas. Estas diferenças, provavelmente, sejam devidas à constituição genética distinta existente entre os isolados.

Análise da diversidade genética de isolados de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum do algodoeiro

A mancha angular do algodoeiro, causada por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam), é uma doença de importância econômica e pode causar perdas apreciáveis no rendimento. A doença pode ser controlada por resistência varietal desde que haja conhecimento sobre a variabilidade das populações do patógeno. A variabilidade genética e a estabilidade patogênica entre os isolados deste patógeno não foram suficientemente estudadas, principalmente considerando a introdução de novas cultivares e a expansão da cultura. O objetivo do presente estudo foi avaliar a variabilidade genética entre os 61 isolados de Xam, provenientes de diversas cultivares e regiões do Brasil, através de ensaios moleculares. Análises de ERIC e REP-PCR demonstraram dois grupos distintos de Xam associados a região geográfica de origem. Não foram observadas diferenças nos perfis dos isolados através de PCR-RFLP da região 16S-23S rDNA. A região espaçadora 16S-23S rDNA de três linhagens de Xam foi analisada através de clonagem e sequenciamento e seis diferenças nas seqüências foram encontradas. A técnica de RAPD revelou um maior nível de polimorfismo, distinguindo 6 grupos de Xam a 85% de similaridade. Os resultados indicam a existência de variabilidade muito restrita entre os isolados analisados.

Variabilidade genética de Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae

A mancha bacteriana, causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, é uma das mais importantes doenças do maracujazeiro, podendo limitar a produção dessa frutífera em algumas regiões do País. O uso de resistência genética e controle químico, juntamente com o emprego de medidas de exclusão, são as práticas de controle da doença mais recomendadas. Para o desenvolvimento de variedades resistentes é necessário conhecer tanto a variabilidade genética do hospedeiro quanto do patógeno. Nesse trabalho foi estudada a variabilidade de cinqüenta isolados patogênicos de Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, coletados em quatro diferentes locais no estado de São Paulo. No estudo da variabilidade genética foram usados dados de marcadores moleculares RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), os quais foram usados para o cálculo do coeficiente de similaridade de Dice entre os isolados, análise de variância molecular (AMOVA) entre e dentro das populações e agrupamento dos isolados pelo método UPGMA. Para análise da agressividade foram usados cinco isolados, mais divergentes, baseado no dendrograma. O coeficiente de similaridade variou entre 0,6887 e 0,9688. Na análise de agrupamento, os isolados foram separados em sete grupos e não houve relação evidente entre local de coleta com a composição dos grupos. Na análise da variância molecular (AMOVA) verificou-se que a maior parte da variabilidade genética está dentro das populações (89,4%) e apenas 10,6%, entre populações. Os resultados da análise de agrupamento e da AMOVA indicam que existe grande fluxo gênico entre isolados bacterianos nas regiões analisadas. No teste de patogenicidade verificou-se diferença significativa de agressividade entre os isolados. Os resultados demonstram a importância do conhecimento da variabilidade genética e da agressividade na seleção dos isolados para serem utilizados em testes de resistência genética no desenvolvimento de variedades resistentes.

Variabilidade genética entre isolados de Colletotrichum gossypii do algodoeiro

O algodoeiro é atacado por Colletotrichum gossypii (CG) e C. gossypii var. cephalosporioides (CGC). Ambos os patógenos são transmitidos pela semente e sua distinção morfológica é extremamente difícil e inconsistente. Tentativas foram feitas no presente trabalho para verificar a variabilidade genética entre CG e CGC através de RAPD-PCR, ERIC- e REP-PCR e PCR-RFLP da região ITS rDNA. Foram utilizados 53 isolados coletados de sementes e folhas de plantas de diferentes cultivares nos estados do Paraná, São Paulo, Mato Grosso, Minas Gerais, e Paraiba, entre 1999 e 2003. Baseado em testes de patogenicidade, vinte e um isolados foram classificados como CG e 32 como CGC. Os resultados obtidos por RAPD-PCR, utilizando-se oito primers, revelaram dois grupos distintos sendo que o primeiro foi formado por 94% dos isolados de sementes e o segundo por 95% dos isolados de folhas. Na análise de ERIC- e REP-PCR, resultados semelhantes a RAPD foram obtidos, sendo que o primeiro grupo foi formado por 93% dos isolados provenientes das sementes e o segundo por 78% dos isolados provenientes das folhas. Quando o produto de amplificação da região ITS rDNA foi digerido com oito enzimas de restrição, um perfil de bandas semelhante para todos os isolados foi obtido. Resultados de RAPD, ERIC- e REP-PCR demonstraram que existem diferenças genéticas entre os isolados provenientes das sementes e aqueles provenientes de parte aérea, e esses dois grupos foram claramente distintos. Estudos futuros devem ser realizados utilizando outras técnicas moleculares para a obtenção de marcadores capazes de distinguir entre isolados de CG e CGC.

Caracterização biológica e molecular de isolados do Citrus tristeza virus com potencial para utilização em programas de pré-imunização

O experimento teve como objetivo caracterizar biológica e molecularmente os isolados de CTV, obtidos de árvores de laranja Pêra em pomares das regiões Norte e Noroeste do Paraná, visando selecionar isolados fracos do Citrus tristeza virus com capacidade protetiva para pré-imunização. Os resultados apontaram sintomas fracos a moderados de caneluras e revelaram similaridade genética da maioria dos isolados analisados e o isolado fraco controle, sugerindo que as plantas selecionadas estão infectadas por haplótipos fracos de CTV, com potencial para serem utilizadas como plantas matrizes.