Capacidade de invasão, persistência intracelular e atividade citotóxica de cepas de Aeromonas spp. em modelo celular in vitro e ex vivo

As Aeromonas são consideradas patógenos em potenciais para o homem e animais e estão amplamente distribuídas no ambiente sendo a água e os alimentos importantes veículos de transmissão. Muitos estudos têm demonstrado que a patologia causada pela infecção por Aeromonas é complexa e envolvem inúmeros fatores de virulência, dentre eles a aderência, invasão, enterotoxinas, hemolisinas, exoenzimas, sideróforos, flagelos, formação de biofilme e mecanismos de secreção. No presente estudo, analisamos os mecanismos de patogênese mediados por A. caviae e A. hydrophila, avaliando a participação desses microrganismos nos processos de adesão, invasão, persistência intracelular e citotoxidade celular. Foram utilizados ensaios quantitativos in vitro para testar associação, invasão e persistência intracelular em linhagens celulares HEp-2 e/ou T84. A interação de tecidos intestinais de coelho cultivados in vitro (IVOC) com três cepas de A. caviae originárias de fezes diarréicas também foi avaliada. Observamos que 10 (62,5%) das 16 cepas de Aeromonas spp. de diferentes origens, submetidas aos testes de invasão quantitativos foram capazes de invadir células HEp-2 e T84 em 6 horas de incubação. As cepas positivas nos testes de invasão foram submetidas ao teste quantitativo de persistência em células HEp-2 e sobreviveram no ambiente intracelular por 48 e/ou 72 horas sem multiplicação. A interação de três cepas de A. caviae com a mucosa intestinal de coelho ex vivo resultou em aderência, produção de muco e alterações como, intensa vacuolização e drástica desorganização estrutural que levaram a destruição das microvilosidades intestinais. Este estudo demonstrou que subconjuntos de cepas de A. caviae e A. hydrophila de diversas origens, foram capazes de invadir, persistir ou destruir linhagens celulares in vitro. Nosso estudo também evidenciou que cepas de A. caviae causaram expressivas alterações morfológicas que resultaram na destruição de epitélios intestinais de coelho ex vivo. Finalmente, nossos resultados contribuíram para reforçar o potencial patogênico de cepas de Aeromonas, em especial, as de origem vegetal e clínica.

Filogeografia e evolução molecular de lagostas sapateiras (Scyllarides spp.) da América do Sul

Nos últimos anos, duas espécies de lagostas sapateiras, Scyllarides brasiliensis e S. deceptor, vêm se destacando nos desembarques pesqueiros de lagostas do Atlântico Sul Ocidental. Para espécies comercialmente importantes, o desenvolvimento de estudos que permitam conhecer a variabilidade e entender a dinâmica populacional é fundamental. Assim, o objetivo do primeiro capítulo desta tese foi avaliar a diversidade genética e a estrutura populacional dessas duas lagostas ao longo de aprox. 2.800 km da costa da América do Sul. Para as análises, foram empregados marcadores mitocondriais (citocromo oxidase I: COI; e a região controle: RC) e marcadores nucleares (13 loci de microssatélites desenvolvidos nesta tese). As duas espécies apresentaram altos níveis de variabilidade (S. deceptor: N = 200, mtDNA: h > 0,841, π > 0,005; microssatélites: He = 0,685; S. brasiliensis: N = 211, He = 0,554), distribuídos homogeneamente entre as localidades (S. deceptor: ΦST < -0,004, ΦCT < 0,016, FST global = 0,001, Dest global = 0,003, FCT < 0,002, P > 0,05, K = 1; S. brasiliensis: FST global = 0,004, Dest global = 0,001, FCT < 0,004, P > 0,05, K = 1). A ausência de estruturação nas duas espécies pode estar relacionada a características biológicas que promovem a conectividade entre localidades geograficamente distantes, como alta fecundidade e alto potencial de dispersão das larvas planctônicas. Além disso, os dados mitocondriais sugerem que a história demográfica de S. deceptor foi marcada por eventos de expansão populacionais e geográficos possivelmente relacionados às condições ambientais favoráveis dos episódios interglaciais do Pleistoceno Médio-Tardio. Diversos estudos têm mostrado que os fenômenos de inserção de regiões mitocondriais no DNA nuclear (NuMts) e heteroplasmia limitam a correta amplificação e identificação dos marcadores mitocondriais. Em estudos filogenéticos e de genética de populações, a presença inadvertida de sequências de diversas origens viola o principio de ortologia, o que pode resultar em inferências evolutivas erradas. Assim, o objetivo do segundo capítulo desta tese foi identificar e caracterizar os possíveis NuMts e sequências heteroplásmicas de três regiões mitocondriais (COI, RC e o gene da subunidade maior do RNA ribossomal: 16S) em quatro espécies do gênero Scyllarides (S. aequinoctialis, S. brasiliensis, S. deceptor e S. delfosi). A clonagem e sequenciamento de extratos de DNA genômico e DNA enriquecido com mtDNA revelaram que os genomas destas espécies podem exibir NuMts (que divergem entre 0,6 e 17,6% do mtDNA) e heteroplasmia (que divergem < 0,2% do mtDNA prevalente). Os NuMts surgiram possivelmente de vários eventos independentes de integração ao núcleo ao longo da história evolutiva do gênero Scyllarides. Dependendo do seu grau de similaridade com o mtDNA, a presença de NuMts nas análises filogenéticas no nível de gênero pode causar superestimativa do número de espécies e alterações nos comprimentos dos ramos e nas relações filogenéticas entre espécies.

The effects of urbanization on populations of grass shrimp Palaemonetes spp. in small, high salinity estuaries

High salinity estuaries in the southeastern U.S. have experienced increased inputs of contaminants from nonpoint source (NPS) urban runoff and decreases in habitat due to filling of wetlands and dock/bulkhead construction. Urbanization may pose significant risks to estuarine fauna, particularly crustaceans. The grass shrimp of the genus Palaemonetes, is one of the dominant species found in estuarine tidal creeks, accounting for greater than 50% of all macropelagic fauna on an annual basis. Spatial analytical and geographic information system techniques were used to determine which factors influenced the Palaemonetes population structures in a South Carolina bar-built estuary surrounded by urban development. Impacts from land use practices were investigated using concentric circular buffers around study sites. Factors investigated included sediment-associated polycyclic aromatic hydrocarbons concentration, land use classification, percent impervious surfaces, and other selected urban factors. Geographic information system and statistical modeling showed quantitative relationships between land use class and impacts on Palaemonetes density. The study suggests that habitat loss is a major factor influencing grass shrimp densities. Multiple regression modeling suggests a significant relationship between habitat alterations and Palaemonetes densities.

固氮蓝藻（Nostoc spp.）基因组文库的构建及固氮酶结构基因克隆

分离自新疆干旱荒漠地区的固氮蓝藻Nostoc spp.被证明具有较高的乙炔还原活性和特异抗逆性。为了保存Nostoc spp.的优良遗传性状和今后研究所需，我们以EMBL4噬菌体为载体，以Sau3AI部分酶解的15-22kb DNA片段为供体，构建了Nostoc spp.的基因组文库。以克氏肺炎杆菌和Anabaena sp. PCC7120的nifHDK DNA片段为探针，通过三轮噬菌斑原位杂交，成功地从基因文库中分离到了六个重组噬菌体阳性克隆。Southern杂交验证插入片段含有Nostoc spp.的固氮酶结构基因序列，并对其限制酶切图谱作了初步分析。