Diseño e Implementación de un Laboratorio Virtual de Biotecnología.

Este trabajo describe el diseño y la implementación de un laboratorio virtual de biotecnología, en el que uno o más estudiantes pueden realizar una práctica de ingeniería genética. Esta práctica consiste en modificar genéticamente un árbol (chopo) para dotarlo de una mayor resistencia a enfermedades, especialmente las producidas por hongos. Como parte de este trabajo, se ha realizado un análisis sobre plataformas existentes para la creación de entornos virtuales, tales como Second Life, Bitmanagement Software Collaborate System, OpenSimulator, Open Wonderland; además se han presentado otros trabajos similares a éste existentes en la literatura científica. En este análisis, la plataforma OpenSimulator fue seleccionada por ser gratuita y de código libre, además, al estar basada en Second Life, hereda su facilidad para la creación de mundos virtuales. Una práctica de laboratorio se modela como un protocolo o secuencia de acciones que se deben llevar a cabo. Para validar las acciones del estudiante se ha implementado un objeto, llamado tutor, que verifica la correcta realización de la práctica, y proporciona pistas sobre la siguiente acción a ejecutar. Este objeto posee una programación genérica, que se puede reutilizar en el desarrollo de otras prácticas de laboratorio a través de sencillas modificaciones en su configuración. Finalmente, en este trabajo se presentan los modelos y especificaciones para la construcción del laboratorio virtual.

Podredumbre parda del melocotonero (Monilinia spp.) : detección, identificación de especies y contribución a la epidemiología de la enfermedad

Monilinia spp. (M. laxa, M. fructigena y M. fructicola) causa marchitez en brotes y flores, chancros en ramas y podredumbre de la fruta de hueso provocando pérdidas económicas importantes en años con climatología favorable para el desarrollo de la enfermedad, particularmente en variedades tardías de melocotonero y nectarino. En estos huéspedes en España, hasta el momento, la especie predominante es M. laxa y, en menor proporción, M. fructigena. La reciente introducción en Europa de la especie de cuarentena M. fructicola hace necesaria una detección e identificación rápida de cada una de las especies. Además, hay diversos aspectos de la etiología y epidemiología de la enfermedad que no se conocen en las condiciones de cultivo españolas. En un primer objetivo de esta Tesis se ha abordado la detección e identificación de las especies de Monilinia spp. causantes de podredumbre parda. El estudio de las bases epidemiológicas para el control de la enfermedad constituye el fin del segundo objetivo. Para la detección del género Monilinia en material vegetal por PCR, diferenciándolo de otros hongos presentes en la superficie del melocotonero, se diseñaron una pareja de cebadores siguiendo un análisis del ADN ribosomal. La discriminación entre especies de Monilinia se consiguió utilizando marcadores SCAR (región amplificada de secuencia caracterizada), obtenidos después de un estudio de marcadores polimórficos de ADN amplificados al azar (RAPDs). También fue diseñado un control interno de amplificación (CI) basado en la utilización de un plásmido con secuencias de los cebadores diferenciadores del género, para ser utilizado en el protocolo de diagnóstico de la podredumbre parda con el fin de reconocer falsos negativos debidos a la inhibición de PCR por componentes celulares del material vegetal. Se disponía de un kit comercial que permitía distinguir Monilinia de otros géneros y M. fructicola del resto de especies mediante anticuerpos monoclonales utilizando la técnica DAS-ELISA. En esta Tesis se probaron diferentes fuentes de material como micelio ó conidias procedentes de cultivos en APD, o el micelio de la superficie de frutas o de momias frescas, como formas de antígeno. Los resultados obtenidos con ELISA se compararon con la identificación por métodos morfológico-culturales y por PCR con los cebadores desarrollados en esta Tesis. Los resultados demostraron la posibilidad de una detección temprana en frutas frescas por este método, realzando las posibilidades de una diagnosis temprana para una prevención más eficaz de M. fructicola en fruta de hueso. El estudio epidemiológico de la enfermedad comenzó con la determinación de las principales fuentes de inóculo primario y su importancia relativa en melocotoneros y nectarinos del valle del Ebro. Para ello se muestrearon 9 huertos durante los años 2003 a 2005 recogiendo todas las momias, frutos abortados, gomas, chancros, y brotes necróticos en los árboles. También se recogieron brotes aparentemente sanos y muestras de material vegetal situados en el suelo. En estas muestras se determinó la presencia de Monilinia spp. Los resultados mostraron que la fuente principal de inóculo son las momias que se quedan en los árboles en las que la supervivencia del hongo tras el invierno es muy alta. También son fuentes de inóculo las momias del suelo y los brotes necróticos. De aquí se deriva que una recomendación importante para los agricultores es que deben eliminar este material de los huertos. Un aspecto no estudiado en melocotonero o nectarino en España es la posible relación que puede darse entre la incidencia de infecciones latentes en los frutos inmaduros a lo largo del cultivo y la incidencia de podredumbre en los frutos en el momento de la recolección y en postcosecha. Esta relación se había observado previamente en otros frutales de hueso infectados con M. fructicola en diversos países del mundo. Para estudiar esta relación se realizaron ensayos en cinco huertos comerciales de melocotonero y nectarino situados en el Valle del Ebro en cuatro estados fenológicos durante los años 2000-2002. No se observaron infecciones latentes en botón rosa, dándose la máxima incidencia en precosecha, aunque en algunos huertos se daba otro pico en el endurecimiento del embrión. La especie prevaleciente fue M. laxa. Se obtuvo una correlación positiva significativa entre la incidencia de infecciones latentes y la incidencia de podredumbre en postcosecha. Se desarrolló también un modelo de predicción de las infecciones latentes en función de la temperatura (T) y el periodo de humectación (W). Este modelo indicaba que T y W explicaban el 83% de la variación en la incidencia de infecciones latentes causadas por Monilinia spp. Por debajo de 8ºC no se predecían latentes, necesitándose más de 22h de W para predecir la ocurrencia de latentes con T = 8ºC, mientras que solo se necesitaban 5h de W a 25ºC. Se hicieron también ensayos en condiciones controladas para determinar la relación entre la incidencia de las infecciones latentes, las condiciones ambientales (T y W), la concentración de inóculo del patógeno (I) y el estado de desarrollo del huésped (S) y para validar el modelo de predicción desarrollado con los experimentos de campo. Estos ensayos se llevaron cabo con flores y frutos de nectarino procedentes de un huerto comercial en seis estados fenológicos en los años 2004 y 2005, demostrándose que la incidencia de podredumbre en postcosecha y de infecciones latentes estaba afectada por T, W, I y S. En los frutos se producían infecciones latentes cuando la T no era adecuada para el desarrollo de podredumbre. Una vez desarrollado el embrión eran necesarias más de 4-5h de W al día y un inóculo superior a 104 conidias ml-1 para que se desarrollase o podredumbre o infección latente. La ecuación del modelo obtenido con los datos de campo era capaz de predecir los datos observados en estos experimentos. Para evaluar el efecto del inóculo de Monilinia spp. en la incidencia de infecciones latentes y de podredumbre de frutos en postcosecha se hicieron 11 experimentos en huertos comerciales de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro durante 2002 a 2005. Se observó una correlación positiva entre los números de conidias de Monilinia spp. en la superficie de los frutos y la incidencia de infecciones latentes De los estudios anteriores se deducen otras dos recomendaciones importantes para los agricultores: las estrategias de control deben tener en cuenta las infecciones latentes y estimar el riesgo potencial de las mismas basándose en la T y W. Deben tener también en cuenta la concentración de esporas de Monilinia spp. en la superficie de los frutos para disminuir el riesgo de podredumbre parda. El conocimiento de la estructura poblacional de los patógenos sienta las bases para establecer métodos más eficaces de manejo de las enfermedades. Por ello en esta Tesis se ha estudiado el grado de diversidad genética entre distintas poblaciones de M. laxa en diferentes localidades españolas utilizando 144 marcadores RAPDs (59 polimórficos y 85 monomórficos) y 21 aislados. El análisis de la estructura de la población reveló que la diversidad genética dentro de las subpoblaciones (huertos) (HS) representaba el 97% de la diversidad genética (HT), mientras que la diversidad genética entre subpoblaciones (DST) sólo representaba un 3% del total de esta diversidad. La magnitud relativa de la diferenciación génica entre subpoblaciones (GST) alcanzaba 0,032 y el número estimado de migrantes por generación (Nm) fue de 15,1. Los resultados obtenidos en los dendrogramas estaban de acuerdo con el análisis de diversidad génica. Las agrupaciones obtenidas eran independientes del huerto de procedencia, año o huésped. En la Tesis se discute la importancia relativa de las diferentes fuentes evolutivas en las poblaciones de M. laxa. Finalmente se realizó un muestreo en distintos huertos de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro para determinar la existencia o no de aislados resistentes a los fungicidas del grupo de los benzimidazoles y las dicarboximidas, fungicidas utilizados habitualmente para el control de la podredumbre parda y con alto riesgo de desarrollar resistencia en las poblaciones patógenas. El análisis de 114 aislados de M. laxa con los fungicidas Benomilo (bencimidazol) (1Bg m.a ml-1), e Iprodiona (dicarboximida) (5Bg m.a ml-1), mostró que ninguno era resistente en las dosis ensayadas. Monilinia spp. (M. laxa, M. fructigena and M. fructicola) cause bud and flower wilt, canker in branches and stone fruit rot giving rise important economic losses in years with appropriate environmental conditions, it is particularly important in late varieties of peach and nectarine. Right now, M. laxa is the major species for peach and nectarine in Spain followed by M. fructigena, in a smaller proportion. The recent introduction of the quarantine organism M. fructicola in Europe makes detection and identification of each one of the species necessary. In addition, there are different aspects of disease etiology and epidemiology that are not well known in Spain conditions. The first goal of this Thesis was the detection and identification of Monilinia spp. causing brown rot. Study of the epidemiology basis for disease control was the second objective. A pair of primers for PCR detection was designed based on the ribosomal DNA sequence in order to detect Monilinia spp. in plant material and to discriminate it from other fungi colonizing peach tree surface. Discrimination among Monilinia spp. was successful by SCAR markers (Sequence Characterized Amplified Region), obtained after a random amplified polymorphic DNA markers (RAPDs) study. An internal control for the PCR (CI) based on the use of a mimic plasmid designed on the primers specific for Monilinia was constructed to be used in diagnosis protocol for brown rot in order to avoid false negatives due to the inhibition of PCR as consequence of remained plant material. A commercial kit based on DAS-ELISA and monoclonals antibodies was successfully tested to distinguish Monilinia from other fungus genera and M. fructicola from other Monilinia species. Different materials such as micelium or conidias from APD cultures, or micelium from fresh fruit surfaces or mummies were tested in this Thesis, as antigens. Results obtained by ELISA were compared to classical identification by morphologic methods and PCR with the primers developed in this Thesis. Results demonstrated the possibility of an early detection in fresh fruits by this method for a more effective prevention of M. fructicola in stone fruit. The epidemiology study of the disease started with the determination of the main sources of primary inoculum and its relative importance in peach trees and nectarines in the Ebro valley. Nine orchards were evaluated during years 2003 to 2005 collecting all mummies, aborted fruits, rubbers, cankers, and necrotic buds from the trees. Apparently healthy buds and plant material located in the ground were also collected. In these samples presence of Monilinia spp. was determined. Results showed that the main inoculum sources are mummies that stay in the trees and where fungus survival after the winter is very high. Mummies on the ground and the necrotics buds are also sources of inoculum. As consequence of this an important recommendation for the growers is the removal of this material of the orchards. An important issue not well studied in peach or nectarine in Spain is the possible relationship between the incidence of latent infections in the immature fruits and the incidence of fruit rot at harvesting and postharvesting. This relationship had been previously shown in other stone fruit trees infected with M. fructicola in different countries over the world. In order to study this relationship experiments were run in five commercial peach and nectarine orchards located in the Ebro Valley in four phenologic states from 2000 to 2002. Latent infections were not observed in pink button, the maxima incidence arise in preharvest, although in some orchards another increase occurred in the embryo hardening. The most prevalence species was M. laxa. A significant positive correlation between the incidence of latent infections and the incidence of rot in postharvest was obtained. A prediction model of the latent infections based on the temperature (T) and the wetness duration (W) was also developed. This model showed that T and W explained 83% of the variation in latent infection incidence caused by Monilinia spp. Below 8ºC latent infection was not predicted, more than 22h of W with T = 8ºC were needed to predict latent infection occurrence of, whereas at 25ºC just 5h of W were enough. Tests under controlled conditions were also made to determine the relationship among latent infections incidence, environmental conditions (T and W), inoculum concentration of the pathogen (I) and development state of the host (S) to validate the prediction model developed on the field experiments. These tests were made with flowers and fruits of nectarine coming from a commercial orchard, in six phenologic states in 2004 and 2005, showing that incidence of rot in postharvest and latent infections were affected by T, W, I and S. In fruits latent infections took place when the T was not suitable for rot development. Once developed the embryo, more than 4-5h of W per day and higher inoculums (104 conidia ml-1) were necessary for rot or latent infection development. The equation of the model obtained with the field data was able to predict the data observed in these experiments. In order to evaluate the effect of inoculum of Monilinia spp. in the incidence of latent infections and of rot of fruits in postharvest, 11 experiments in commercial orchards of peach and nectarine of the Ebro Valley were performed from 2002 to 2005. A positive correlation between the conidial numbers of Monilinia spp. in the surface of the fruits and the incidence of latent infections was observed. Based on those studies other two important recommendations for the agriculturists are deduced: control strategies must consider the latent infections and potential risk based on the T and W. Spores concentration of Monilinia spp. in the surface of fruits must be also taken in concern to reduce the brown rot risk. The knowledge of the population structure of the pathogens determines the bases to establish more effective methods of diseases handling. For that reason in this Thesis the degree of genetic diversity among different M. laxa populations has been studied in different Spanish locations using 144 RAPDs markers (59 polymorphic and 85 monomorphics) on 21 fungal isolates. The analysis of the structure of the population revealed that the genetic diversity within the subpopulations (orchards) (HS) represented 97% of the genetic diversity (HT), whereas the genetic diversity between subpopulations (DST) only represented a 3% of the total of this diversity. The relative magnitude of the genic differentiation between subpopulations (GST) reached 0.032 and the considered number of migrantes by generation (Nm) was of 15.1. The results obtained in dendrograms were in agreement with the analysis of genic diversity. The obtained groupings were independent of the orchard of origin, year or host. In the Thesis the relative importance of the different evolutionary sources in the populations from M. laxa is discussed. Finally a sampling of resistant isolates in different orchards from peach and nectarine of Ebro Valley was made to determine the existence of fungicide resistance of the group of benzimidazoles and the dicarboximidas, fungicides used habitually for the control of rot brown and with high risk of resistance developing in the pathogenic populations. The analysis of 114 isolated ones of M. laxa with the fungicides Benomilo (bencimidazol) (1Bg m.a ml-1), and Iprodiona (dicarboximida) (5Bg m.a ml-1), showed no resistant in the doses evaluated.

Revestimientos Continuos Interiores de Varias Capas con Características de Barrera de Vapor e Higroscopicidad

El trabajo realizado ha pretendido desarrollar y caracterizar una solución de revestimiento continuo interior con características de barrera de vapor e higroscopicidad. El objetivo ha sido desarrollar una solución de revestimiento continuo interior, capaz de reducir el riesgo de condensación intersticial en los cerramientos, manteniendo la capacidad de regulación de la humedad del ambiente interior. ESTUDIO DE ANTECEDENTES 1 La condensación intersticial La condensación intersticial se produce cuando la presión de vapor sobrepasa la presión de vapor de saturación en una de las capas internas del cerramiento. El vapor de agua se transfiere de los locales de mayor presión de vapor a los de menor presión. Para la situación de condensación intersticial, en la estación de calentamiento, las presiones de vapor son más elevadas en el interior del edificio que en el exterior. Entonces existe una transferencia de vapor del interior hacia el exterior y es en ese trayecto cuando pueden producirse las condensaciones intersticiales si éste alcanza la temperatura de rocío. Las consecuencias de la condensación intersticial pueden ser varias, desde la degradación de los materiales, como la corrosión de elementos metálicos; la pudrición de productos orgánicos naturales, como la madera, variaciones dimensionales de las fábricas de ladrillo con posibilidad de deformación del cerramiento y de fisuración de los revestimientos continuos. Pueden también producirse fenómenos de corrosión física provocados por la congelación del agua en los elementos porosos del cerramiento. Los revestimientos continuos pueden también estar sujetos a vegetaciones parasitarias por el exterior del cerramiento o de hongos por el interior, por transferencia del agua condensada a las superficies del cerramiento. Los hongos pueden provocar enfermedades principalmente respiratorias o alergias, al alterar la calidad del aire. La condensación intersticial se produce principalmente en situaciones de bajas temperaturas y elevados grados de humedad especifica exterior. Pero las condiciones de temperatura y principalmente de humedad especifica interior tienen también gran influencia en esta situación patológica. Las condiciones de humedad relativa interior dependen de muchos factores como el tipo y uso del edificio, y en caso de vivienda, del número de ocupantes, de las actividades que se desarrollan, pero esencialmente de la temperatura interior y del grado de ventilación. Las soluciones constructivas también tienen influencia en el riesgo de condensaciones. Las soluciones de cerramientos con aislamientos por el interior y con capas impermeables al vapor por el exterior son las más problemáticas. En esta solución constructiva extrema, tenemos prácticamente todo el cerramiento cerca de las temperaturas exteriores, con gran concentración de vapor de agua. El tipo de aislamiento también es importante, los aislamientos con gran desequilibrio higrotérmico, como las lanas minerales, de fibra de madera, o de fibras textiles, caracterizados por el elevado aislamiento y la elevada permeabilidad al vapor, son los que presentan mayor riesgo. Éstos permiten el paso del vapor y producen un salto acentuado de la temperatura. Su colocación por el interior de los cerramientos incrementa aún más el riesgo de condensaciones. Estos materiales de aislamiento también se caracterizan por tener una menor energía primaria asociada a su fabricación. Por lo tanto merecen una atención especial en la búsqueda de soluciones sostenibles. Así mismo, también puede existir riesgo de condensaciones con aquellos aislamientos de menor permeabilidad al vapor, como los poliméricos o las espumas de vidrio, pero deficientemente aplicados, permitiendo el paso del vapor de agua por las juntas o en los encuentros con forjados, pilares o huecos. La condensación de agua en los aislamientos caracterizados por una elevada permeabilidad al vapor es la situación más problemática porque, además de poder conducir a la pudrición de aislamientos de origen orgánico (como los de fibra de madera), conduce a una disminución del aislamiento del cerramiento y al consecuente incremento del consumo de energía en la obtención del confort térmico. Existen un conjunto de reglas y de soluciones constructivas que pueden reducir el riesgo de condensaciones intersticiales como la colocación de materiales sucesivamente más permeables al vapor, o más aislantes, del interior al exterior. XXXIII Revestimientos exteriores discontinuos y ventilados y aislamientos aplicados por el exterior es la solución extrema de este principio. La aplicación de aislamientos impermeables al vapor es otra solución, siendo necesario que se garantice que las juntas de las placas del aislamiento sean estancas, así como los encuentros con los forjados, pilares y huecos. Otra solución es la aplicación de cerramientos dobles con cámara de aire ventilada, teniendo el cuidado de ventilar solamente la parte fría del cerramiento. Es necesario en estas situaciones, que se garantice que el aislamiento se encuentra aplicado en la cara exterior del ladrillo interior del cerramiento. También es importante controlar el grado de ventilación de la cámara para que no se produzca la pérdida de la resistencia térmica de la hoja de ladrillo exterior. La aplicación de barreras de vapor en la parte caliente del cerramiento es una solución que garantiza la reducción del flujo del vapor del interior hacia el exterior y consecuentemente contribuye a la reducción de la presión de vapor en su lado exterior y en la parte fría del cerramiento. 2 La normativa La normativa española, el Código Técnico de la Edificación de 2006, en su capítulo Ahorro de Energía, establece que no está permitida en ninguna situación, la condensación en el aislamiento. Todavía existiendo condensaciones en otras capas del cerramiento, en la estación de calentamiento, éstas no pueden ser mayores que la evaporación en la estación de enfriamiento. La misma normativa determina que si existe una barrera de vapor en la parte caliente del cerramiento no será necesario comprobar las condiciones anteriores. La normativa portuguesa, el Regulamento das Características do Comportamento Térmico dos Edifícios, de 2006, no tiene ninguna exigencia relativa a las condensaciones intersticiales. Sus autores defienden que en Portugal no es un fenómeno que pueda tener consecuencias graves en los elementos constructivos o en el consumo de energía. En la norma EN 13788 de 2001 están definidos los métodos más comunes de verificación de las condensaciones y de la evaporación y están basados en el Diagrama de Glaser. En base a esta norma es posible verificar el riesgo de condensaciones superficiales y la posibilidad de desarrollo de hongos en la superficie interior del cerramiento. Pero también permite evaluar el riesgo de condensaciones debido a la difusión de vapor de agua. En este método se considera que el agua incorporada en la construcción ha secado, y es aplicable en situaciones en que sean insignificantes los fenómenos de alteración de conductividad térmica con la humedad, la liberación y absorción de calor, alteración de las propiedades de los materiales con la humedad, succión capilar y transferencia de humedad líquida en los materiales, circulación de aire a través de grietas, y la capacidad higroscópica en los materiales. Me resulta extraño que la misma norma establezca que el método no debe ser utilizado para la comprobación de la existencia de condensaciones, sino solamente como método comparativo de diferentes soluciones constructivas o condiciones ambientales. Más recientemente, con la norma EN 15026 de 2007, se ha introducido una alteración en el método de verificación. Mientras que en base a la norma 13788 la verificación se realiza en régimen estacionario, y solamente considerando algunas propiedades de los materiales como la resistencia térmica (R) y el coeficiente de resistencia a la difusión de vapor de agua (μ), la norma EN 15026, determina que se realice en régimen variable y que otros fenómenos físicos sean considerados. Con respecto a la temperatura, el almacenamiento de calor en materiales secos o húmedos, la transferencia de calor con la transmitancia térmica dependiente de la cantidad de agua presente en los materiales, transferencia de calor latente por difusión de vapor de agua con cambio de fase. Con respecto a la humedad, el almacenamiento de humedad por adsorción y desorción de vapor de agua y fuerzas capilares. Transporte de humedad por difusión de vapor de agua, transporte de agua líquida por difusión de superficie y conducción capilar. 3 Barreras de vapor Las barreras de vapor se caracterizan por una reducida permeancia al vapor, que de acuerdo con la normativa española NBE 79 es inferior a 0,1g /MNs o resistencia superior a 10 MNs/g. (o permeancia inferior a 1,152 g/mmHg, o resistencia al vapor mayor que 0,86 mmHg∙m2∙día /g). Esta permeancia al vapor corresponde a una capa de aire de difusión equivalente (Sd) de 215 cm o 2,15 metros. XXXV Todos los materiales pueden alcanzar estos valores de resistencia al vapor siempre que se utilicen con grandes espesores, pero los que más interesan son los que puedan tener esa característica con pequeños espesores. Existen otras clasificaciones, como la del CSTC de la Bélgica que divide los materiales de acuerdo a su permeancia al vapor. Están definidas 4 categorías de barreras de vapor E1, E2, E3, E4. La categoría E1 para los materiales con - Sd entre 2 y 5 metros, E2 – con Sd entre 5 y 25 metros y 3 - con Sd entre 25 y 200 metros y finalmente E4 para valores de Sd superiores a 200 metros. Estos materiales pueden ser de diferentes tipos, y con diferentes aplicaciones. Las pinturas al esmalte o emulsiones bituminosas, los films de polietileno o de aluminio, y las membranas de betún o vinílicas son algunos ejemplos de productos con estas características y que se utilizan con ese fin. Su aplicación puede realizarse en la superficie interior del cerramiento como las pinturas al esmalte o en la cámara de aire como los otros tipos mencionados anteriormente. En todo caso deben ser colocados en la parte caliente del cerramiento, por el interior del aislamiento. Las pinturas al esmalte, los barnices, o las membranas vinílicas, cuando son aplicados sobre el revestimiento interior, presentan el problema de quitar la capacidad higroscópica del revestimiento, sea de yeso, mortero de cemento o incluso de madera. Las emulsiones de betún o las membranas de betún son generalmente aplicadas en la cara exterior de la hoja interior del cerramiento, cuando existe cámara de aire, por lo que necesitan ser aplicadas por el exterior del edificio y obligan a que la ejecución de la hoja de ladrillo de fuera sea hecha también por el exterior, con las condiciones de seguridad y de costo asociadas. Los films de aluminio o de polietileno presentan problemas de aplicación como la garantía de estanquidad, por no ser continuos, y por que el sistema de fijación poder no garantizarla. Las soluciones que parecen garantizar una mejor estanquidad y menor costo son las aplicaciones de barreras de vapor continuas y aplicadas por el interior del cerramiento, como la pintura al esmalte. Sin embargo, como ya se ha comentado con anterioridad, pueden reducir la capacidad higroscópica de los cerramientos y la inercia higroscópica de las construcciones. 4 La importancia de la capacidad higroscópica El agua actúa como un pequeño imán y es atraída por varios materiales en estado líquido o gaseoso. Muchos materiales son capaces de contener moléculas de vapor de aire, llamándose este fenómeno adsorción y ocurre en los materiales llamados hidrófilos. La capacidad de los materiales de variar su contenido de humedad con la humedad relativa del aire se llama capacidad higroscópica. La capacidad higroscópica de los materiales de revestimiento es importante por permitir la adsorción y desadsorción de agua en estado de vapor y así permitir la regulación de la humedad del ambiente interior, adsorbiendo cuando la humedad relativa del aire es elevada y desorbiendo cuando la humedad relativa es baja. De acuerdo con los datos del Fraunhofer Institut y para valores de humedad por unidad de volumen (Kg/m3), el revestimiento de yeso no es el producto que presenta una mejor capacidad higroscópica, comparado por ejemplo con los revocos de cemento. Para valores de humedad relativa del 50%, el revestimiento de yeso presenta valores de contenido de humedad de 3,6 g/m3, el revoco de cemento 9,66 g/m3, y el revestimiento acrílico de acabado de 2,7 g/m3. Para una humedad relativa del 95% y por tanto aún en el rango higroscópico, los valores para los mismos morteros son de 19 g/m3, 113,19 g/m3 y 34,55 g/m3, respectivamente. Para una humedad relativa del 100% y por tanto en el rango por encima de la saturación capilar, en la saturación máxima, los valores son de 400 g/m3, 280 g/m3 y 100 g/m3 respectivamente. Solo para valores de humedad relativa del 100% es posible verificar un contenido de humedad del revestimiento de yeso superior al del revoco de cemento. La inercia higroscópica permite que las variaciones de la humedad relativa del aire en una habitación, tenga una atenuación de los picos diarios pudiendo contribuir para el confort y para la disminución de los costos energéticos a él asociados. Puede también XXXVII tener un efecto a largo plazo traducido en alteraciones de las medias mensuales en los meses de inicio y de fin de ciclos estacionales, de variación de la humedad relativa. Estos son los fundamentos que han llevado al desarrollo de soluciones de revestimientos continuos interiores con características de barrera de vapor e higroscopicidad. ESTUDIO EXPERIMENTAL El estudio experimental consta de dos partes: - permeabilidad al vapor e capacidad higroscópica de materiales y productos - adherencia de revestimientos predosificados de yeso a capas impermeables al vapor. 1- Materiales y métodos I. Permeabilidad al vapor y capacidad higroscópica de materiales y productos El desarrollo de esta solución de revestimiento ha comenzado por el estudio de las características de permeabilidad al vapor y de capacidad higroscópica de los materiales y productos utilizados en los revestimientos continuos de cerramientos. Los primeros ensayos han sido realizados en el periodo de docencia del Curso de Doctorado en la asignatura de Aplicaciones Actuales de Conglomerantes Tradicionales, del Profesor Luis de Villanueva Domínguez, y han permitido el primer contacto con los métodos de ensayos y el conocimiento de las normas aplicables. En el trabajo de investigación realizado en la asignatura, se ha ensayado la permeabilidad al vapor e la capacidad higroscópica de morteros de revestimiento, de conglomerantes tradicionales Los materiales y productos ensayados, en ese primer trabajo experimental, han sido, mortero de escayola y cal aérea, yeso de proyectar, mortero de cal aérea y arena, mortero de cal hidráulica y arena, mortero de cemento y arena, mortero de cemento y arena con aditivos impermeabilizantes y morteros impermeabilizantes a base de cemento. En el periodo de investigación del Curso de Doctorado han sido ensayados otros materiales y productos. También con la orientación del Catedrático Luis de Villanueva Domínguez se ha desarrollado el Trabajo Tutelado en el cual se han ensayado materiales y productos de revestimiento continuo de conglomerantes no tradicionales, yesos puros con adiciones naturales, yesos de proyectar con adiciones sintéticas y capas peliculares de diferente origen. De los productos de origen sintético se ha ensayado la permeabilidad al vapor y capacidad higroscópica de estucos acrílicos de relleno (Matesica), estucos acrílicos de acabado (Matesica), mortero sintético de relleno/acabado para exterior o interior (Matesica), mortero sintético de acabado para exterior (Weber), mortero epoxi de relleno y acabado para interior (Gobbetto), morteros de agarre (BASF y Matesica), mortero de reparación de cemento (Weber), mortero de reparación de yeso (Weber). Se ha ensayado también la permeabilidad al vapor de capas peliculares continuas de diferentes orígenes, como aceite de linaza hervido, cera de abeja diluida en esencia de trementina, emulsión bituminosa (Shell), emulsión bituminosa con polímero (BASF), imprimación epoxídica con cemento (BASF), pintura epoxídica (Matesica), pintura anticarbonatación (BASF), estuco Veneciano de cal (La Calce de la Brenta), estuco Veneciano sintético (Gobbetto) e impermeabilización líquida (Weber). Han sido ensayadas también la permeabilidad al vapor y la capacidad higroscópica de yesos puros (portugueses) sin adiciones y con aditivos naturales (cal aérea hidratada 1/1, cola de pescado y cola de conejo). Los yesos de proyectar han sido ensayados sin adiciones y con adiciones de látex SBR (BASF), acrílico (Weber) y epoxi (Matesica). II Adherencia de revestimientos predosificados de yeso a capas impermeables al vapor Como ya se ha dicho anteriormente, hasta una humedad relativa por debajo del 95%, el revestimiento de yeso tiene una capacidad higroscópica inferior al revoco de cemento y al revestimiento acrílico de acabado. Se ha elegido, de acuerdo con el profesor Luis de Villanueva Domínguez, este producto como capa higroscópica del esquema de revestimiento. Las cuestiones de tradición cultural, de abundancia de materia prima en la Península Ibérica, esencialmente en España, y los menores costos energéticos asociados a su fabricación, determinan el origen de esta decisión. Para la producción de 1 m3 de XXXIX cemento son necesarios 12600 MJ, mientras que para 1 m3 de yeso son necesarios solamente 2640 MJ. Pero el yeso presenta otras características mejores que los morteros de cemento, como la menor densidad, menor conductividad térmica y menor efusividad térmica. La mejor capacidad de absorción de agua en la fase líquida por capilaridad, que el mortero de cemento, es otra de las ventajas de los revestimientos de yeso que en situaciones de condensación superficial interior puede evitar el goteo. El paso siguiente ha sido ensayar la adherencia de un revestimiento predosificado de yeso a las capas que han presentado característica de barrera de vapor con espesores hasta 6 mm, así como en aquellas en que los fabricantes recomiendan menores espesores, como el mortero epoxi de relleno y acabado y el mortero sintético de acabado. Se ha utilizado un revestimiento de yeso predosificado de aplicación manual, portugués. La elección de un producto de aplicación manual se ha debido a la dificultad de obtener la aplicación por proyección en el local donde se han hecho las muestras, el taller de la Faculdade de Arquitectura da Universidade Técnica de Lisboa. Se ha aplicado con espesor de 2 cm sobre las capas de aceite de linaza hervido, emulsión de bituminosa, imprimación epoxídica con cemento, pintura epoxídica, impermeabilización líquida, mortero epoxi de relleno y acabado, mortero sintético de acabado. Verificando que ninguno de los materiales que han presentado características de barrera de vapor hasta espesores de 0,6 mm proporcionaban una adherencia al revestimiento de yeso capaz de garantizar el cumplimento de todas las exigencias, se ha decidido elegir los materiales impermeables al vapor más finos y con diferentes orígenes para desarrollar los estudios de mejora de la adherencia. Ha sido necesario desarrollar un conjunto de experimentos con el objetivo de incrementar la adherencia del revestimiento de yeso a estos soportes no absorbentes. La adherencia de los revestimientos continuos de conglomerantes tradicionales, como el yeso sobre soportes absorbentes, se basa en una adherencia mecánica. En este caso los cristales de yeso se van a formar dentro de la red capilar del ladrillo cerámico o del hormigón. Aplicando una barrera de vapor sobre ellos, se elimina esta posibilidad por aplicarse una barrera entre la estructura porosa del soporte (ladrillo u hormigón) y el revestimiento de yeso. Se tiene que producir otro tipo de adherencia, la adherencia química. Esta adherencia se basa en los enlaces químicos, de tipo secundario, como los puentes de hidrógeno o las fuerzas bipolares de Van der Waals. Aunque este tipo de adherencia es menor que la que se produce sobre soportes absorbentes, puede alcanzar valores considerables. Los materiales impermeables al vapor elegidos han sido el aceite de linaza hervido, la emulsión bituminosa y la imprimación epoxi con cemento. A estos materiales de origen natural, artificial e sintético, han sido aplicadas capas intermedias de arena de sílice, mortero de cemento y arena, mortero de agarre y un puente de adherencia de acuerdo con las recomendaciones de Eurogypsum. La capa de arena ha sido aplicada con la última mano aún fresca, mientras que las otras capas intermedias han sido aplicadas con las capas impermeables al vapor ya secas. Las capas intermedias aplicadas han sido: - al aceite de linaza hervido - arena de sílice y puente de adherencia. - a la emulsión bituminosa - arena de sílice, mortero de cemento y arena 1:1 y puente de adherencia - a la capa de imprimación epoxídica con cemento - arena de sílice, mortero de agarre y puente de adherencia. El revestimiento de yeso utilizado ha sido un yeso predosificado de aplicación manual, de origen español, y se ha aplicado con un espesor de 2 centímetros. Para la capa intermedia de puente de adherencia y siguiendo la recomendación del fabricante, se ha añadido un látex de SBR (con relación látex/agua de 1/2) al revestimiento de yeso. Otra experimentación realizada ha sido la adición del látex SBR al revestimiento de yeso y su aplicación directamente sobre cada una de las capas impermeables al vapor, y a cada una de las capas intermedias aplicadas sobre las capas impermeables al vapor. XLI La aplicación del látex en las proporciones de 1/2, de relación látex/agua, puede cambiar algunas propiedades del revestimiento de yeso en pasta, en relación a su aplicación, o tiempo de inicio o fin de fraguado, e incluso tener influencia en el costo final del revestimiento. Puesto que la adherencia del revestimiento de yeso con adición del látex a la capa intermedia de puente de adherencia ha sido muy superior a las exigencias más estrictas, se ha realizado un ensayo, pero sin la adición del látex. Este ensayo se ha realizado aplicando el revestimiento de yeso sobre las capas de puente de adherencia anteriormente aplicadas sobre las capas impermeables al vapor, descritas con anterioridad. Se ha aplicado ahora un revestimiento de yeso predosificado también de aplicación manual, pero de origen portugués. Para garantizar el cumplimiento integral de la exigencia de adherencia de 0,5 MPa, se ha hecho otro ensayo con una menor adición de látex de SBR al yeso predosificado. Se ha aplicado el látex con una relación látex/agua de 1/3 y 1/4. 2 Resultados y discusión I. Permeabilidad al vapor y capacidad higroscópica de materiales y productos En el primer ensayo de permeabilidad al vapor se concluyó que ninguno de los productos ensayados puede constituir barrera de vapor en espesores hasta 2 cm. y que lo que ha presentado mayor resistividad al vapor ha sido el mortero impermeabilizante de capa fina. Tendría que tener un espesor próximo a los 14,12 cm para poder constituir barrera de vapor. En los ensayos de capacidad higroscópica, realizados solamente para humedades relativas del 50% y 95% a temperaturas de 23ºC, el mortero de escayola y cal aérea y el yeso de proyectar han presentado una capacidad higroscópica bastante elevada, pero como el secado ha sido realizado a 100º C (lo que no es la temperatura adecuada para los productos a base de yeso por poder éstos sufrir una deshidratación y un cambio en su constitución) los resultados no pueden ser considerados. El mortero de impermeabilización de capa fina también ha presentado una buena capacidad higroscópica, mejor que el mortero de cemento y arena, y éste mejor que el mortero de cal hidráulica y arena, y éste mejor que el mortero de cal aérea y arena. La adición de aditivos impermeabilizantes no ha cambiado significativamente esta característica. Como resultado de los segundos ensayos se ha concluido que existen diferentes materiales y productos que pueden constituir barrera de vapor con diferentes espesores. Los productos estuco acrílico de relleno, estuco sintético de acabado, mortero sintético de acabado para exterior, mortero epoxi de relleno y acabado, han presentado características de barrera de vapor con espesores hasta 2 cm, sin embargo, son espesores superiores a los recomendados por los fabricantes de los productos. De los productos peliculares, han constituido barrera de vapor, el aceite de linaza hervido (con valores muy próximos), la emulsión bituminosa sin polímero, la imprimación epoxídica con cemento, la pintura epoxídica y la impermeabilización líquida. Todos los demás productos ensayados no han presentado esa característica cuando aplicados en tres manos. Los yesos puros con adiciones naturales y los yesos de proyectar con adiciones sintéticas no han presentado características de barrera de vapor en espesores hasta dos centímetros. El mejor resultado ha sido el del yeso puro con adición de cola de pescado, que ha presentado característica de barrera de vapor con espesor de 16,32 cm. En cuanto a la capacidad higroscópica de los materiales y productos, el ensayo ha sido repetido recientemente con las mismas muestras, porque en el ensayo realizado para el Trabajo Tutelado no fue posible una correcta caracterización. En ese ensayo solo se han obtenido los valores de capacidad higroscópica para valores de humedad del 50 % ± 3 a temperatura de 23 ºC ± 2 por no disponerse de los medios necesarios para un estudio más completo. En el ensayo realizado recientemente en el Laboratório Nacional de Engenharia Civil de Portugal (LNEC), se ha utilizado una cámara climática, con control de temperatura y humedad relativa, y se han obtenido los valores de capacidad higroscópica para valores de humedad relativa del 25%, 50%, 75% y 95% a temperatura constante de 23º C. XLIII En ese último ensayo se ha verificado que para humedades relativas del 50 %, los yesos predosificados de aplicación manual, portugueses y españoles, tienen diferentes capacidades higroscópicas. Los yesos españoles han presentado una capacidad higroscópica de 0,2 % y el portugués de 0,05 %. La adición de látex de SRB no ha reducido la capacidad higroscópica del yeso predosificado español. Los valores se han mantenido próximos para las relaciones látex/agua de 1/4, 1/3 y 1/2, con 0,2 %. Para valores de capacidad higroscópica por volumen se ha verificado que la adición de látex incrementa la capacidad higroscópica, estableciéndose que los valores para el yeso español sin látex han sido de 2,2 g/dm3 y para los yesos con adición de látex han sido de cerca de 2,5 g/dm3. Para este valor de humedad relativa otros productos han presentado mayor capacidad higroscópica, como el yeso puro con cola de pescado con 5,1 g/dm3.Para morteros ensayados con espesores de 0,6 cm, el mortero de reparación de yeso ha presentado un valor de capacidad higroscópica de 4,1 g/dm3 y el mortero de agarre (BASF) ha presentado el valor de 4,6 g/dm3. Para valores de humedad relativa del 95 %, la capacidad higroscópica presentada por el yeso predosificado español ha sido de 1 % y por el portugués ha sido de 0,27 %. La adición de látex tampoco aquí ha alterado la capacidad higroscópica. Las pequeñas diferencia registradas pueden deberse al diferente tiempo en que se han realizado los pesajes, por existir ya mucha agua libre. Para valores de capacidad higroscópica por volumen se ha verificado que la adición de látex incrementa la capacidad higroscópica, estableciéndose que los valores para el yeso español sin látex han sido de 10,6 g/dm3 y para los yesos con adición de látex han sido de cerca de 11,60 g/dm3 para látex/agua de 1/4, 13,77 g/dm3 para látex/agua de 1/3 y 12,20 g/dm3 para látex/agua de 1/2. Para este valor de humedad relativa, otros productos han presentado mayor capacidad higroscópica, y superiores al yeso predosificado de aplicación manual español. El yeso predosificado de proyectar con adición de látex acrílico (Weber), con 14,1 g/dm3, el yeso puro con cola de pescado con 17,8 g/dm3, el yeso puro cal aérea hidratada con 18,3 g/dm3. Para los morteros ensayados con espesores de 0,6 cm, el mortero de agarre Matesica con valor 17,7 g/dm3, el mortero de reparación de yeso con valores de 31,2 g/dm3 y el mortero de agarre BASF con valores de 48,8 g/dm3. Este ultimo valor debería ser verificado por haberse podido producir un error en la cantidad de agua suministrada. XLIV II Adherencia de revestimientos predosificados de yeso a capas impermeables al vapor Realizado el ensayo de adherencia del revestimiento de yeso predosificado aplicado sobre las capas que han constituido barrera de vapor con espesor hasta 6 mm, se ha verificado que los valores requeridos por la norma europea EN 13279 de 2005, con valores de adherencia ≥ 0,1 MPa o rotura cohesiva por el soporte, solo no han sido satisfechos por la pintura epoxídica y por el revestimiento sintético de acabado. Todavía los valores de adherencia no han alcanzado los valores exigidos por las exigencias complementarias del Laboratório Nacional de Engenharia de Portugal (LNEC) o las exigencias españolas. Las exigencias del LNEC, determinan una adherencia ≥ 0,5 MPa, o una ruptura cohesiva. Las exigencias españolas determinan que la adherencia debe ser determinada por la rotura del revestimiento. La solución de revestimiento que mejor resultado ha presentado ha sido la del revestimiento predosificado de yeso aplicado sobre la capa de aceite de linaza hervido, con una adherencia de 0,324 MPa. También se ha ensayado la aplicación de una capa intermedia de mortero de agarre entre las capas impermeables al vapor de imprimación epoxídica y pintura epoxídica. Los resultados obtenidos han sido de 0,21 MPa y de 0,25 MPa respectivamente. De los valores obtenidos en el ensayo de adherencia del revestimiento de yeso predosificado a las capas peliculares elegidas que han constituido barrera de vapor cuando aplicadas en tres manos, solo algunas de las soluciones con adición de látex al yeso han cumplido las exigencias más estrictas. Éstas han sido las capas impermeables al vapor constituidas por emulsión bituminosa e imprimación epoxi con cemento. Las capas intermedias de arena de sílice sobre la emulsión bituminosa y sobre la imprimación epoxi también han cumplido. Las capas intermedias de mortero de cemento sobre emulsión bituminosa, y mortero de agarre sobre imprimación epoxi con cemento también han cumplido. El puente de adherencia sobre emulsión bituminosa e imprimación epoxídica con cemento, han presentado valores muy elevados de adherencia del revestimiento de XLV yeso. Los valores obtenidos han sido tres veces superiores a las exigencias más estrictas. Los valores obtenidos en el ensayo de adherencia del revestimiento de yeso predosificado sobre el puente adherencia aplicado sobre las capas peliculares impermeables al vapor han sido muy cercanos a la exigencia del Laboratório Nacional de Engenharia Civil de Portugal. Presentan una media de 0,456 MPa. Los valores más bajos han sido para la solución de capa impermeable al vapor constituida por aceite de linaza hervido, con el valor de 0,418 MPa. El valor más elevado ha sido para la solución de capa impermeable al vapor constituida por imprimación epoxídica con cemento, con el valor de adherencia de 0,484 MPa. Los valores obtenidos con las capas impermeables al vapor constituidas por aceite de linaza hervido han presentado roturas siempre adhesivas, o en su capa, pero con valores muy diferentes. Los valores de mayor adherencia se han producido con las capas de aceite con mayor tiempo de secado. En el ensayo de adherencia del revestimiento de yeso predosificado con adición de látex con relación agua/látex de 1/3 y 1/4, aplicado sobre el puente de adherencia, aplicado sobre la capa de imprimación epoxi se ha verificado que la solución con relación látex/agua de 1/4 ha superado la exigencia de 0,5 MPa en un 50 %. Esto resultado quiere decir que es posible aplicar una relación de látex/agua aún inferior. PRINCIPALES CONCLUSIONES Como principales conclusiones del estudio experimental podemos decir que es posible obtener un revestimiento continuo interior impermeable al vapor e higroscópico. Se pueden obtener con capas impermeables al vapor de aceite de linaza hervido (debidamente seco), emulsión bituminosa o con imprimación epoxídica con cemento, aplicadas directamente sobre el ladrillo. Como capa higroscópica se puede aplicar un revestimiento de yeso predosificado, no obstante sea menos higroscópico que un revestimiento de mortero de cemento y arena (hasta humedades relativas del 95%). La adherencia entre la capa impermeable al vapor y el revestimiento de yeso predosificado, puede conseguirse con un puente de adherencia entre las dos capas anteriormente descritas. Si la adherencia del yeso no fuera capaz de cumplir las exigencias más estrictas (0,5 MPa) puede añadirse un látex de SBR al yeso en una relación de látex agua de 1/4. Esa adición permite una adherencia un 50 % superior a las exigencias más estrictas, por lo que se pueden ensayar relaciones aún menores de L/A. Estas adiciones no restan capacidad higroscópica al revestimiento, pudiendo incluso incrementarla (para humedades relativas del 25% al 95%) con beneficio para la inercia higroscópica del edificio donde fuese aplicado. Con respecto a la influencia de la solución de revestimiento propuesta en el riesgo de condensaciones intersticiales, se puede decir que no ha sido posible observar una diferencia significativa en las simulaciones realizadas, entre la aplicación del revestimiento y su no aplicación. Las simulaciones han sido realizadas con la aplicación informática Wufi 5 Pro, que respeta la normativa más reciente relativa a las condensaciones intersticiales. Comparando con la solución tradicional de aplicación de barrera de vapor en la cámara de aire, tampoco se han verificado grandes diferencias. Cabe destacar que esta solución tradicional no ha presentado diferencias en relación a la no aplicación de barrera de vapor. Estas simulaciones contradicen lo comúnmente establecido hasta ahora, que es considerar que la aplicación de barreras de vapor en la parte caliente del cerramiento reduce considerablemente el riesgo de condensaciones intersticiales. Estas simulaciones han sido realizadas considerando que la fracción de lluvia adherida al cerramiento seria la correspondiente a la solución constructiva y a su inclinación. En la definición del componente pared del cerramiento no existe la posibilidad de colocar la capa de pintura exterior. Considerando la hipótesis de que con la capa de pintura exterior, no existe absorción de agua de lluvia, en esta solución constructiva, los valores obtenidos han cambiado considerablemente. El contenido total de agua en el elemento ha sido menor en la solución con barrera de vapor en el revestimiento (pico máximo de 1 Kg/m2), seguido de la solución de barrera de vapor en la cámara de aire (pico máximo de 1,4 Kg/m2) y esto menor que la solución sin barrera de vapor (pico máximo de 1,8 Kg/m2). El contenido de agua en la lana de roca también ha sido menor en la solución con barrera de vapor en el revestimiento interior (pico máximo de 1,15 %), seguido de la solución con barrera de vapor en la cámara de aire (pico máximo de 1,5 %). y esto menor que la solución sin barrera de vapor (pico máximo de 1,62 %).

Determinación de la capacidad parasitaria de la microbiota fúngica y de sus extractos acuosos en las semillas de cardo (Cynara cardunculus L.)

El presente estudio evalúa el efecto que 6 diferentes géneros hongos aislados a partir de semillas de 54 diferentes cultivares de cardo y sus extractos acuosos tienen sobre la germinación y nascencia de las semillas. Se han realizado pruebas de patogenicidad con dos aislados de cada uno de los seis géneros de mayor frecuencia del inventario (Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Cladosporium y Alternaria), así como de los extractos producidos tras 3, 7 y 11 días de incubación de los micetos. Los resultados de las inoculaciones con los micetos muestran efectos negativos sobre los porcentajes de germinación, con reducciones en la germinación que fueron máximas tras las inoculaciones con Rhizopus stolonifer (29% de disminución) y Fusarium verticillioides (23%). Los porcentajes de emergencia disminuyen tras duplicar la concentración del inóculo, aumentando además drásticamente el número de plántulas dañadas sobre el total de las emergidas. En el significativo caso de la inoculación con Cladosporium la duplicación del inóculo disminuyó la germinación hasta en un 31% respecto al testigo. Las plántulas emergidas tras las inoculaciones con los extractos obtenidos a partir de cultivos líquidos de los hongos ensayados presentaban los mismos síntomas de atrofias y daños sobre raíz y coleóptilo que los descritos para cada hongo. Los extractos acuosos de los géneros estudiados disminuyen también la germinación. Los resultados nos muestran la diferente capacidad parasitaria de cada una de las especies estudiadas apreciándose además diferencias según los diferentes periodos de agitación de los hongos y permiten asegurar que la producción de toxinas está regulada por el hongo, y que no aumenta linealmente con el crecimiento miceliar.

Biogeografía de especies de Fusarium en el litoral mediterráneo de España

El trabajo presentado estudia la presencia de Fusarium oxysporum, F.solani(sensulato), F. equiseti y F.acuminatum en puntos del litoral de Almería, Alicante, Gerona e Islas Baleares (Menorca, Ibiza, Espalmador). Se analizaron tanto arenas de las playas (zonas intermareal y supramareal) como fondos marino situados a 27,9 y 7,2 metros de profundidad en Almería y a 10 m de profundidad en las Islas Baleares. Exceptuando el litoral de Gerona, en el resto de los enclaves se presentaron varias especies de Fusarium que se aislaron de las arenas de las playas, confirmando así resultados obtenidos con anterioridad. Lo más novedoso fue encontrar especies de Fusarium a diferentes profundidades marinas. En Almería F.oxysporum y F.equisti se aislaron a 27,9 y7,2 m profundidad. F. acuminatum se aisló de la muetra recogida a 27m de profundidad. En las islas Baleares, a10m de profundidad, se aislaron F. oxysporum, F. solani (sensulato), F.equiseti y F.acuminatum. El efecto antrópico, el comportamiento como "airborne" o los arrastres de aguas por las ramblas y torrentes podría explicar la presencia de estas especies en los hábitats mencionados. La permanencia de estas especies en los hábitats mencionados, especialmente en la zona intermareal de las playas y en los fondos marinos donde soportan elevadas presiones osmóticas por la alta salinidad del agua del mar Mediterráneo, permitirá estudios específicos sobre el comportamiento de estos hongos en medios muy salinos. Otros hongos aislados de arenas de playa y fondos marinos fueron: Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Dreschlera, Gliocladium Humicola, Penicillium, Phialophora, Rhizopus, Stemphylium, Trichoderma, Trichocladium y Ulocladium. Muchos de ellos fueron aislados del fondo marino, testimoniando así que estos hábitats no son exclusivos de Fusarium.

Evaluación de la patogeneicidad de la microbiota fúngica asociada a cinco variedades autóctonas españolas de judión (Phaseolus coccineus L.)

Se caracterizó la micoflora presente en las semillas de 5 cultivares de judión (Phaseolus coccineus L.) procedentes de una explotación dedicada a la agricultura ecológica de Oteruelo del Valle (Parque natural de Rascafría, Madrid) y de 5 variedades incluidas en el Catálogo Común de variedades Comerciales de la Unión Europea. Se analizaron un total de 3200 semillas de todos los lotes cosechadas en la campaña 2005-2006. Para ello se colocaron 5 semillas de cada muestra en placas de Petri con medio agar de patata glucosado (PDA) y 6 semillas por muestra en cámara húmeda, realizándose 20 repeticiones en cada caso, analizándose de esta manera al menos 220 semillas por muestra. Para conocer la presencia del género Fusarium se realizaron análisis específicos con todas las muestras, utilizando para ello medio selectivo para Fusarium realizándose lecturas periódicas y anotando el número de especies presentes en cada semilla. Se identificaron un total de 11 especies fúngicas diferentes. la presencia de los diferentes géneros varió entre los cultivares estudiados, siendo mucho menor, aunque no ausente en las semillas comerciales. Entre la microbiota fúngica aislada cabe destacar, por su potencial patogeneicidd o por su capacidad para la producción de micotoxinas o metabolitos secundarios, especies de los géneros Aspergillus, Alternaria o Rhizoctonia. En una segunda parte del estudio se evaluó el efecto que dichos hongos tienen sobre la germinación y nascencia de las semillas, realizándose pruebas de patogeneicidad sobre un total de 200 semillas de Phaseolus vulgaris variedad Calgary. Las inoculaciones se realizaron con cada uno de los dos aislados de los seis géneros de mayor importancia cuantitativa del inventario(Aspergillus, Penicillium Ulocladium, Rhizopus, Cladosporium y Alternaria) Los resultados de las inoculaciones muestran efectos negativos sobre los porcentajes de germinación en todos los tratamientos estudiados y muestran la diferente capacidad parasitaria de cada una de las especies estudiadas sobre Phaseolus vulgaris.

Microbiota asociada a la enfermedad de la punta negra del trigo duro. Efectos del riego, el abonado nitrogenado y la variedad cultivada en la incidencia de la enfermedad

La enfermedad fúngica de la punta negra del trigo se caracteriza por provocar en las semillas afectadas un oscurecimiento de la zona del embrión que en ocasiones puede extenderse hacia la hendidura central dejando el grano completamente ennegrecido. Su incidencia en el cultivo de trigo es extremadamente variable y depende en gran medida de las condiciones ambientales, así pues, condiciones de alta humedad pueden incrementar a punta negra. Su presencia en el trigo duro repercute en el rendimiento semolero. Además la pasta elaborada a partir de semilla enferma presenta manchas negras y adquiere color y olor desagradable. Esta enfermedad es poco conocida a nivel europeo, sin embargo existen numerosos estudios para conocer su etiología y los factores que afectan a su aparición en países como Nueva Zelanda, Australia, Estados Unidos o Canadá. El presente trabajo pretende dar a conocer esta patología en España, determinando la influencia del riego, el abonado nitrogenado y la variedad cultivada en la incidencia de la enfermedad. Para ello se ha contado con un diseño experimental basado en 10 cultivares sembrados en parcelas con dos tratamientos de riego y dos de abonado nitrogenado. El análisis de las semillas infectadas en cámara húmeda y medios de cultivo PDA y K reveló 12 géneros fúngicos diferentes, de los cuales Alternaria alternata y Fusarium proliferatum estaban presentes en todas las muestras. El estudio del riego y abonado nitrogenado mostró diferencias significativas en la incidencia de punta negra pero fueron los 10 cultivares incluidos en el ensayo los que mayor importancia cobraron desde el punto de vista de la aparición de la enfermedad. El genotipo resultó determinante a la hora de establecer los niveles de afectación ya que las muestras encuadradas botánicamente como Triticum turgidum subsp. Turgidum convar. Turgidum presentaron una mayor susceptibilidad. las prueas de patogenicidd con los tres principales hongos asociados a la punta negra dieron resultados negativos para la germinación-nascencia de las plántulas de trigo duro inoculadas.

Comentario al I Concurso Internacional de recolección mecanizada de cebolla

En muchos países de Europa y América se está recolectando la cebolla de un modo mecánico o, por lo menos, se está en vías de hacerlo, ya que la recolección manual de este producto resulta costosísima (aproximadamente, del 30 al 40 por 100 de los costes totales de producción, es decir, alrededor de unas 35.000 pesetas por hectárea). Los operarios arrancan las cebollas por tirón, para lo cual es necesario que esto el terreno en sazón, ya que si no las hojas se rompen al estirar y la recolección resulta más penosa. Una vez arrancadas las cebollas, se depositan encima del caballón original, con objeto de que se sequen, y al cabo de unos días (dos o tres) se separan los rabos con un hocino y se meten en sacos o se cargan en un remolcador. Otra modalidad consiste en cortar el rabo al mismo tiempo que se arranca, aunque existe el peligro de una infección ulterior por hongos.

Implementación de una práctica virtual de biotecnología: la transformación bacteriana

En este documento se realiza la implementación de la fase "Transformación Bacteriana" en el "Laboratorio Virtual de Biotecnología Agroforestal" de la Universidad Politécnica de Madrid. Esta fase representa una continuación de un trabajo previo, en el que se implementó el laboratorio virtual y se diseñó una arquitectura para el desarrollo de las fases posteriores. La Transformación Bacteriana es la tercera fase del proceso de modificación genética de un chopo para dotarle de resistencia frente a ciertos hongos y tiene como objetivo la introduccion de un plásmido modificado genéticamente en la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Para el desarrollo de esta fase se determinaron las acciones que debían de ser agregadas al tutor automático y, además, se programaron los scripts de ciertos objetos 3D ya existentes y se modelaron en 3D nuevos instrumentos y maquinarias necesarios para la realización de la práctica. Por otra parte, luego de la etapa de pruebas de las dos primeras fases, se concluyó que se debían de resolver algunos problemas de usabilidad del visor Firestorm. Gracias a que este visor es un proyecto de código abierto, fue posible corregir los problemas identificados. La resolución de estos problemas se explica como parte del presente trabajo.

¿Contienen los preparados microbiológicos para usos en hortícolas lo que indican sus etiquetas?

La homologación en los países más industrializados es un obstáculo para la comercialización de biopesticidas. Para evitar tan complejo proceso, el término bioestimulantes parece ser la denominación que los acoge con menos complicación de registro. En esta comunicación se recoge el análisis de 9 preparados microbiológicos remitidos por empresas distribuidoras y por técnicos de cooperativas. La pregunta fue siempre la misma: ¿contienen lo que indica la etiqueta del envase?. Ocho de los preparados indicaban en su etiqueta un número concreto (concentración) de unidades formadoras de colonias de un hongo antagonista (materia activa) y una indicaba la concentración de un hongo endomicorrícico. Los análisis se ajustaron a los tipos de hongos prescritos en investigación para éstos. Los resultados pusieron en evidencia que en ninguno de los casos su contenido microbiológico se ajustaba a lo indicado en la etiqueta. En la mayoría, existían otros microorganismos no expresados en la etiqueta, en igual o mayor concentración que el hongo indicado.

Dinámica vegetal desde el tardiglaciar en la cuenca del Duero: interacciones con clima, fuego e impacto humano

La cuenca del Duero constituye un vasto territorio ibérico cuyo paisaje se encuentra actualmente muy alterado por la mano del hombre y es prácticamente imposible localizar alguna manifestación de su cubierta vegetal natural. Aunque la historia de la vegetación en los sectores central y oriental es relativamente bien conocida, en su mitad occidental los registros paleoecológicos estudiados hasta la fecha son prácticamente inexistentes. Esto hace que se desconozca la respuesta de la vegetación a las diferentes oscilaciones climáticas que se han producido desde el Último Máximo Glaciar, cuál fue el impacto de las diferentes culturas sobre el medio, cuándo se produjo una alteración profunda de la vegetación natural y cuál ha sido la historia de los incendios. Este último aspecto, el papel e importancia de los incendios, reviste un especial interés en la península Ibérica dada su situación geográfica y climática dentro de la cuenca Mediterránea, donde el fuego es un factor ecológico de primer nivel. Las distintas técnicas paleoecológicas son las más adecuadas para abordar todas estas preguntas. De este modo, los avatares de la vegetación a través del tiempo se han reconstruido mediante el análisis polínico y de macrofósiles, el impacto humano se ha trazado utilizando indicadores polínicos ligados a actividades antrópicas y esporas de hongos coprófilos, estudiándose los incendios a partir del registro de partículas microscópicas de carbón. La alta resolución temporal y taxonómica alcanzada en estos análisis, así como la amplia superficie abarcada con los yacimientos estudiados, hacen que la información obtenida sea altamente detallada y complete el conocimiento que se tiene sobre la cuenca del Duero. El Tardiglaciar se registra por primera vez en la Meseta Norte Ibérica en la secuencia de Ayoó de Vidriales, donde una vegetación esteparia prácticamente desarbolada domina durante los periodos fríos. Durante el interestadial Bølling/Allerød la expansión forestal (pinos, abedules) fue muy leve y tardía y fue interrumpida bruscamente por el Dryas Reciente. Al final del Dryas Reciente o al inicio del Holoceno se produjo una acusada y rápida expansión de los bosques. Esta dinámica sugiere que no hubo refugios glaciares importantes en esta zona de la Meseta durante el “Mystery Interval”, aparentemente el periodo más frío y seco. Los incendios fueron muy escasos, aumentando de forma muy brusca al inicio del Holoceno por el aumento de biomasa y las condiciones relativamente cálidas y secas. A partir de los registros de Ayoó y El Maíllo se consolida la importancia del gradiente oceanicidad-continentalidad en el Sistema Central y la Meseta Norte, que se manifiesta principalmente en la dominancia más prolongada de los pinares hacia el interior. Además, otra de las principales contribuciones de la presente tesis es proporcionar evidencia sobre la sucesión de distintos tipos de bosques en el noroeste de la Meseta, precisando el marco temporal en el que suceden. Así, se ha constatado que hubo un máximo desarrollo del bosque caducifolio durante el Holoceno medio en Ayoó de Vidriales y una baja incidencia del fuego que sugieren que el clima fue más húmedo que en el Holoceno inicial. El estudio de macrofósiles leñosos ha permitido detectar procesos que con el análisis polínico habrían pasado desapercibidos, como la persistencia hasta el Holoceno final de Pinus sylvestris en la sierra del Teleno y la sustitución de P. sylvestris por P. pinaster en la sierra de Francia durante el Holoceno inicial. También el estudio de los carbones procedentes de los arenales de Tierra de Pinares han proporcionado la prueba definitiva de la naturalidad de los pinares de P. pinaster. El impacto humano se detecta temprano en las secuencias del oeste de la cuenca del Duero, durante el Neolítico, aunque ha sido mucho más acusado desde la Edad del Hierro (ca 2700-2500 años cal BP). Para la detección del impacto humano temprano ha sido clave el análisis de esporas de hongos coprófilos, cuyo análisis fue incorporado en la secuencia de Ayoó de Vidriales. Una de sus principales consecuencias fue el establecimiento de comunidades de matorral (brezales, piornales) sobre amplias extensiones del occidente de la cuenca del Duero, vinculado al recrudecimiento de los regímenes de incendios. A pesar de que los incendios han sido ecológicamente importantes desde el inicio del Holoceno, los cambios introducidos por el hombre en sus regímenes sobrepasaron la resiliencia de los bosques originales, lo cual condujo a su sustitución sostenida por matorrales. ABSTRACT The Duero Basin constitutes a vast Iberian territory which is currently strongly disturbed due to human activities, so it is very difficult to find any remnant of the natural vegetation. Vegetation history for the eastern and western sectors of the Basin is relatively well-known but, in contrast, there is an almost complete lack of palaeoecological record in the western area. Consequently, there exists a profound ignorance about vegetation responses to the climatic oscillations occurred since the Last Glacial Maximum, the environmental impact of the different cultures, when a severe disturbance of the natural vegetation took place and fire history. The last question, the role and importance of fire, has a special interest in the Iberian Peninsula due to its geographic and climatic framework, the Mediterranean Basin, where fire is a major ecological factor. The diverse palaeoecological techmiques are the most suitable tools to address all these questions. Thus, vegetation shifts through time have been reconstructed using pollen and macrofossil analyses, human impact has been tracked by means of anthropogenic pollen indicators and dung fungal spores, while fire history has been studied from the quantification of microscopic charcoal particles. The high taxonomic and time resolution attained along with the extensive surface covered by the studied sites provide detailed information very useful to complete the knowledge on landscape dynamics in the Duero Basin. The Lateglacial is recorded for the first time in the Northern Iberian Plateau in the sequence from Ayoó de Vidriales, showing that almost treeless steppic vegetation dominated during the cold periods. Tree expansion (pines, birches) was late and slight during the Bølling/Allerød interstadial and was sharply interrupted by the Younger Dryas (YD) climatic reversal. By the end of the YD or the onset of the Holocene, a rapid forest expansion occurred. This forest dynamics suggests an absence of important glacial refugia for trees in this area of the Plateau during the Mystery Interval, apparently the coldest and driest period. Fires were fairly rare, increasing abruptly at the beginning of the Holocene due to the relatively warm and dry climate and the accumulation of biomass. The records from Ayoó and El Maíllo reinforce the role of the oceanicity-continentality gradient in the vegetation history of the Iberian Central Range and the Iberian Northern Plateau, reflected mainly in the longer dominance of pine forests towards inland areas. Further, another important contribution of this PhD Thesis is providing evidence on the succession of different forest types in the northestern fringe of the Plateau, specifying the chronological framework. A maximum of deciduous forest development and low fire activity have been detected in Ayoó de Vidriales during the mid-Holocene, suggesting that climate was wetter than in the early Holocene. The study of woody macrofossils has allowed detecting processes which would have remained unnoticed using pollen analysis alone, such as the persistence of Pinus sylvestris until the late Holocene in the Teleno Mountains and the early Holocene replacement of P. sylvestris with P. pinaster in the sierra de Francia range. The study of macroscopic charcoal fragments from palaeosols of the Tierra de Pinares has also provided the definitive proof of naturalness for the P. pinaster stands gorwing over this area at present. Early human impact, during the Neolithic, has been detected in the sequences from the western sector of the Duero Basin, although human disturbance has been more severe from the Iron Age onwards (ca 2700-2500 cal yr BP). The analysis of coprophilous fungi incorporated in the sequence of Ayoó de Vidriales has played a key role in recognizing that early human impact. One of the main consequences of human disturbance was the establishment of shrubland communities (heaths, brooms) over huge areas of the western Duero Basin, linked to severe and/or frequent fires. Despite fires has been ecologically important since the onset of the Holocene, human-induced changes in fire regimes have exceeded the resilience of original forests leading to a sustained replacement with shrublands.

El papel de las micorrizas en la agricultura.

Las micorrizas son hongos simbióticos que colonizan las raíces de más de un 80% de las especies vegetales. Su presencia, entre otros factores, favorece un aumento de la absorción de nitrógeno y fósforo, reduce el estrés salino y el hídrico y aumenta la resistencia a determinados patógenos de sus plantas huésped. Son capaces también de incrementar el establecimiento, nodulación y capacidad de fijación de nitrógeno de las leguminosas. Es decir, pueden aumentar los rendimientos de los cultivos en los que se hallan. Su efecto sobre los gases de efecto invernadero es variable debido a los múltiples procesos en los que intervienen. Por lo tanto, el estudio de su ecología y funcionamiento en los ecosistemas agrarios es esencial para la mejora del crecimiento y productividad de los cultivos.

Mejora de la eficacia de Penicillium oxalicum como agente de biocontrol en enfermedades de plantas hortícolas

Actualmente, la reducción de materias activas (UE) y la implantación de la nueva Directiva comunitaria 2009/128/ que establece el marco de actuación para conseguir un uso sostenible de los plaguicidas químicos y la preferencia de uso de métodos biológicos, físicos y otros no químicos, obliga a buscar métodos de control menos perjudiciales para el medio ambiente. El control biológico (CB) de enfermedades vegetales empleando agentes de control biológico (ACB) se percibe como una alternativa más segura y con menor impacto ambiental, bien solos o bien como parte de una estrategia de control integrado. El aislado 212 de Penicillium oxalicum (PO212) (ATCC 201888) fue aislado originalmente de la micoflora del suelo en España y ha demostrado ser un eficaz ACB frente a la marchitez vascular del tomate. Una vez identificado y caracterizado el ACB se inició el periodo de desarrollo del mismo poniendo a punto un método de producción en masa de sus conidias. Tras lo cual se inició el proceso de formulación del ACB deshidratando las conidias para su preservación durante un período de tiempo mayor mediante lecho fluido. Finalmente, se han desarrollado algunos formulados que contienen de forma individual diferentes aditivos que han alargado su viabilidad, estabilidad y facilitado su manejo y aplicación. Sin embargo, es necesario seguir trabajando en la mejora de su eficacia de biocontrol. El primer objetivo de esta Tesis se ha centrado en el estudio de la interacción ACB-patógeno-huésped que permita la actuación de P.oxalicum en diferentes patosistemas. Uno de los primeros puntos que se abordan dentro de este objetivo es el desarrollo de nuevas FORMULACIONES del ACB que incrementen su eficacia frente a la marchitez vascular del tomate. Las conidias formuladas de PO212 se obtuvieron por la adición conjunta de distintos aditivos (mojantes, adherentes o estabilizantes) en dos momentos diferentes del proceso de producción/secado: i) antes del proceso de producción (en la bolsa de fermentación) en el momento de la inoculación de las bolsas de fermentación con conidias de PO212 o ii) antes del secado en el momento de la resuspensión de las conidias tras su centrifugación. De las 22 nuevas formulaciones desarrolladas y evaluadas en plantas de tomate en ensayos en invernadero, seis de ellas (FOR22, FOR25, FOR32, FOR35, FOR36 y FOR37) mejoran significativamente (P=0,05) el control de la marchitez vascular del tomate con respecto al obtenido con las conidias secas de P.oxalicum sin aditivos (CSPO) o con el fungicida Bavistin. Los formulados que mejoran la eficacia de las conidias secas sin aditivos son aquellos que contienen como humectantes alginato sódico en fermentación, seguido de aquellos que contienen glicerol como estabilizante en fermentación, y metil celulosa y leche desnatada como adherentes antes del secado. Además, el control de la marchitez vascular del tomate por parte de los formulados de P. oxalicum está relacionado con la fecha de inicio de la enfermedad. Otra forma de continuar mejorando la eficacia de biocontrol es mejorar la materia activa mediante la SELECCIÓN DE NUEVAS CEPAS de P. oxalicum, las cuales podrían tener diferentes niveles de eficacia. De entre las 28 nuevas cepas de P. oxalicum ensayadas en cámara de cultivo, sólo el aislado PO15 muestra el mismo nivel de eficacia que PO212 (62-67% de control) frente a la marchitez vascular del tomate en casos de alta presión de enfermedad. Mientras que, en casos de baja presión de enfermedad todas las cepas de P. oxalicum y sus mezclas demuestran ser eficaces. Finalmente, se estudia ampliar el rango de actuación de este ACB a OTROS HUÉSPEDES Y OTROS PATÓGENOS Y DIFERENTES GRADOS DE VIRULENCIA. En ensayos de eficacia de P. oxalicum frente a aislados de diferente agresividad de Verticillium spp. y Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici en plantas de tomate en cámaras de cultivo, se demuestra que la eficacia de PO212 está negativamente correlacionada con el nivel de enfermedad causada por F. oxysporum f. sp. lycopersici pero que no hay ningún efecto diferencial en la reducción de la incidencia ni de la gravedad según la virulencia de los aislados. Sin embargo, en los ensayos realizados con V. dahliae, PO212 causa una mayor reducción de la enfermedad en las plantas inoculadas con aislados de virulencia media. La eficacia de PO212 también era mayor frente a aislados de virulencia media alta de F. oxysporum f. sp. melonis y F. oxysporum f. sp. niveum, en plantas de melón y sandía, respectivamente. En ambos huéspedes se demuestra que la dosis óptima de aplicación del ACB es de 107 conidias de PO212 g-1 de suelo de semillero, aplicada 7 días antes del trasplante. Además, entre 2 y 4 nuevas aplicaciones de PO212 a la raíces de las plantas mediante un riego al terreno de asiento mejoran la eficacia de biocontrol. La eficacia de PO212 no se limita a hongos patógenos vasculares como los citados anteriormente, sino también a otros patógenos como: Phytophthora cactorum, Globodera pallida y G. rostochiensis. PO212 reduce significativamente los síntomas (50%) causados por P. cactorum en plantas de vivero de fresa, tras la aplicación del ACB por inmersión de las raíces antes de su trasplante al suelo de viveros comerciales. Por otra parte, la exposición de los quistes de Globodera pallida y G. rostochiensis (nematodos del quiste de la patata) a las conidias de P. oxalicum, en ensayos in vitro o en microcosmos de suelo, reduce significativamente la capacidad de eclosión de los huevos. Para G. pallida esta reducción es mayor cuando se emplean exudados de raíz de patata del cv. 'Monalisa', que exudados de raíz del cv. 'Desirée'. No hay una reducción significativa en la tasa de eclosión con exudados de raíz de tomate del cv. 'San Pedro'. Para G. rostochiensis la reducción en la tasa de eclosión de los huevos se obtiene con exudados de la raíz de patata del cv. 'Desirée'. El tratamiento con P. oxalicum reduce también significativamente el número de quistes de G. pallida en macetas. Con el fin de optimizar la aplicación práctica de P. oxalicum cepa 212 como tratamiento biológico del suelo, es esencial entender cómo el entorno físico influye en la capacidad de colonización, crecimiento y supervivencia del mismo, así como el posible riesgo que puede suponer su aplicación sobre el resto de los microorganismos del ecosistema. Por ello en este segundo objetivo de esta tesis se estudia la interacción del ACB con el medio ambiente en el cual se aplica. Dentro de este objetivo se evalúa la INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA, DISPONIBILIDAD DE AGUA Y PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS SUELOS (POROSIDAD, TEXTURA, DENSIDAD...) SOBRE LA SUPERVIVENCIA Y EL CRECIMIENTO DE PO212 en condiciones controladas elaborando modelos que permitan predecir el impacto de cada factor ambiental en la supervivencia y crecimiento de P. oxalicum y conocer su capacidad para crecer y sobrevivir en diferentes ambientes. En las muestras de suelo se cuantifica: i) la supervivencia de Penicillium spp. usando el recuento del número de unidades formadoras de colonias en un medio de cultivo semi-selectivo y ii) el crecimiento (biomasa) de PO212 mediante PCR en tiempo real. En los resultados obtenidos se demuestra que P. oxalicum crece y sobrevive mejor en condiciones de sequía independientemente de la temperatura y del tipo de suelo. Si comparamos tipos de suelo P. oxalicum crece y sobrevive en mayor medida en suelos areno-arcillosos con un bajo contenido en materia orgánica, un mayor pH y una menor disponibilidad de fósforo y nitrógeno. La supervivencia y el crecimiento de P. oxalicum se correlaciona de forma negativa con la disponibilidad de agua y de forma positiva con el contenido de materia orgánica. Sólo la supervivencia se correlaciona también positivamente con el pH. Por otro lado se realizan ensayos en suelos de huertos comerciales con diferentes propiedades físico-químicas y diferentes condiciones ambientales para ESTUDIAR EL ESTABLECIMIENTO, SUPERVIVENCIA Y DISPERSIÓN VERTICAL Y MOVILIDAD HORIZONTAL DE PO212. P. oxalicum 212 puede persistir y sobrevivir en esos suelos al menos un año después de su liberación pero a niveles similares a los de otras especies de Penicillium indígenas presentes en los mismos suelos naturales. Además, P. oxalicum 212 muestra una dispersión vertical y movilidad horizontal muy limitada en los diferentes tipos de suelo evaluados. La introducción de P. oxalicum en un ambiente natural no sólo implica su actuación sobre el microorganismo diana, el patógeno, si no también sobre otros microorganismos indígenas. Para EVALUAR EL EFECTO DE LA APLICACIÓN DE P. oxalicum SOBRE LAS POBLACIONES FÚNGICAS INDIGENAS PRESENTES EN EL SUELO de dos huertos comerciales, se analizan mediante electroforesis en gradiente desnaturalizante de poliacrilamida (DGGE) muestras de dichos suelos a dos profundidades (5 y 10 cm) y a cuatro fechas desde la aplicación de P. oxalicum 212 (0, 75, 180 y 365 días). El análisis de la DGGE muestra que las diferencias entre las poblaciones fúngicas se deben significativamente a la fecha de muestreo y son independientes del tratamiento aplicado y de la profundidad a la que se tomen las muestras. Luego, la aplicación del ACB no afecta a la población fúngica de los dos suelos analizados. El análisis de las secuencias de la DGGE confirma los resultados anteriores y permiten identificar la presencia del ACB en los suelos. La presencia de P. oxalicum en el suelo se encuentra especialmente relacionada con factores ambientales como la humedad. Por tanto, podemos concluir que Penicillium oxalicum cepa 212 puede considerarse un óptimo Agente de Control Biológico (ACB), puesto que es ecológicamente competitivo, eficaz para combatir un amplio espectro de enfermedades y no supone un riesgo para el resto de microorganismos fúngicos no diana presentes en el lugar de aplicación. ABSTRACT Currently, reduction of active (EU) and the implementation of the new EU Directive 2009/128 which establishing the framework for action to achieve the sustainable use of chemical pesticides and preference of use of biological, physical and other non-chemical methods, forces to look for control methods less harmful to the environment. Biological control (CB) of plant diseases using biological control agents (BCA) is perceived as a safer alternative and with less environmental impact, either alone or as part of an integrated control strategy. The isolate 212 of Penicillium oxalicum (PO212) (ATCC 201888) was originally isolated from the soil mycoflora in Spain. P. oxalicum is a promising biological control agent for Fusarium wilt and other tomato diseases. Once identified and characterized the BCA, was developed a mass production method of conidia by solid-state fermentation. After determined the process of obtaining a formulated product of the BCA by drying of product by fluid-bed drying, it enables the preservation of the inoculum over a long period of time. Finally, some formulations of dried P. oxalicum conidia have been developed which contain one different additive that have improved their viability, stability and facilitated its handling and application. However, further work is needed to improve biocontrol efficacy. The first objective of this thesis has focused on the study of the interaction BCA- pathogen-host, to allow P.oxalicum to work in different pathosystems. The first point to be addressed in this objective is the development of new FORMULATIONS of BCA which increase their effectiveness against vascular wilt of tomato. PO212 conidial formulations were obtained by the joint addition of various additives (wetting agents, adhesives or stabilizers) at two different points of the production-drying process: i) to substrate in the fermentation bags before the production process, and (ii) to conidial paste obtained after production but before drying. Of the 22 new formulations developed and evaluated in tomato plants in greenhouse tests, six of them (FOR22 , FOR25 , FOR32 , FOR35 , FOR36 and FOR3) improved significantly (P = 0.05) the biocontrol efficacy against tomato wilt with respect to that obtained with dried P.oxalicum conidia without additives (CSPO) or the fungicide Bavistin. The formulations that improve the efficiency of dried conidia without additives are those containing as humectants sodium alginate in the fermentation bags, followed by those containing glycerol as a stabilizer in the fermentation bags, and methylcellulose and skimmed milk as adherents before drying. Moreover, control of vascular wilt of tomatoes by PO212 conidial formulations is related to the date of disease onset. Another way to further improve the effectiveness of biocontrol is to improve the active substance by SELECTION OF NEW STRAINS of P. oxalicum, which may have different levels of effectiveness. Of the 28 new strains of P. oxalicum tested in a culture chamber, only PO15 isolate shows the same effectiveness that PO212 (62-67 % of control) against tomato vascular wilt in cases of high disease pressure. Whereas in cases of low disease pressure all strains of P. oxalicum and its mixtures effective. Finally, we study extend the range of action of this BCA TO OTHER GUESTS AND OTHER PATHOGENS AND DIFFERENT DEGREES OF VIRULENCE. In efficacy trials of P. oxalicum against isolates of different aggressiveness of Verticillium spp. and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in tomato plants in growth chambers, shows that the efficiency of PO212 is negatively correlated with the level of disease caused by F. oxysporum f. sp. lycopersici. There is not differential effect in reducing the incidence or severity depending on the virulence of isolates. However, PO212 cause a greater reduction of disease in plants inoculated with virulent isolates media of V. dahlia. PO212 efficacy was also higher against isolates of high and average virulence of F. oxysporum f. sp. melonis and F. oxysporum f. sp. niveum in melon and watermelon plants, respectively. In both hosts the optimum dose of the BCA application is 107 conidia PO212 g-1 soil, applied on seedlings 7 days before transplantation into the field. Moreover, the reapplication of PO212 (2-4 times) to the roots by irrigation into the field improve efficiency of biocontrol. The efficacy of PO212 is not limited to vascular pathogens as those mentioned above, but also other pathogens such as Oomycetes (Phytophthora cactorum) and nematodes (Globodera pallida and G. rostochiensis). PO212 significantly reduces symptoms (50 %) caused by P. cactorum in strawberry nursery plants after application of BCA by dipping the roots before transplanting to soil in commercial nurseries. Moreover, the exposure of G. pallida and G. rostochiensis cysts to the conidia of P. oxalicum, in in vitro assays or in soil microcosms significantly reduces hatchability of eggs. The reduction in the rate of G. pallida juveniles hatching was greatest when root diffusates from the `Monalisa´ potato cultivar were used, followed by root diffusates from the `Désirée´ potato cultivar. However, no significant reduction in the rate of G. pallida juveniles hatching was found when root diffusates from the ‘San Pedro” tomato cultivar were used. For G. rostochiensis reduction in the juveniles hatching is obtained from the root diffusates 'Desirée' potato cultivar. Treatment with P. oxalicum also significantly reduces the number of cysts of G. pallida in pots. In order to optimize the practical application of P. oxalicum strain 212 as a biological soil treatment, it is essential to understand how the physical environment influences the BCA colonization, survival and growth, and the possible risk that can cause its application on other microorganisms in the ecosystem of performance. Therefore, the second objective of this thesis is the interaction of the BCA with the environment in which it is applied. Within this objective is evaluated the INFLUENCE OF TEMPERATURE, WATER AVAILABILITY AND PHYSICAL-CHEMICAL PROPERTIES OF SOILS (POROSITY, TEXTURE, DENSITY...) ON SURVIVAL AND GROWTH OF PO212 under controlled conditions to develop models for predicting the environmental impact of each factor on survival and growth of P. oxalicum and to know their ability to grow and survive in different environments. Two parameters are evaluated in the soil samples: i) the survival of Penicillium spp. by counting the number of colony forming units in semi-selective medium and ii) growth (biomass) of PO212 by real-time PCR. P. oxalicum grows and survives better in drought conditions regardless of temperature and soil type. P. oxalicum grows and survives more in sandy loam soils with low organic matter content, higher pH and lower availability of phosphorus and nitrogen. Survival and growth of P. oxalicum negatively correlates with the availability of water and positively with the organic content. Only survival also correlated positively with pH. Moreover, trials are carried out into commercial orchards soils with different physic-chemical properties and different environmental conditions TO STUDY THE ESTABLISHMENT, SURVIVAL, VERTICAL DISPERSION AND HORIZONTAL SPREAD OF PO212. P. oxalicum 212 can persist and survive at very low levels in soil one year after its release. The size of the PO212 population after its release into the tested natural soils is similar to that of indigenous Penicillium spp. Furthermore, the vertical dispersion and horizontal spread of PO212 is limited in different soil types. The introduction of P. oxalicum in a natural environment not only involves their action on the target organism, the pathogen, but also on other indigenous microorganisms. TO ASSESS THE EFFECT OF P. oxalicum APPLICATION ON SOIL INDIGENOUS FUNGAL COMMUNITIES in two commercial orchards, soil samples are analyzed by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis polyacrylamide (DGGE). Samples are taken from soil at two depths (5 and 10 cm) and four dates from the application of P. oxalicum 212 (0, 75, 180 and 365 days). DGGE analysis shows that differences are observed between sampling dates and are independent of the treatment of P. oxalicum applied and the depth. BCA application does not affect the fungal population of the two soil analyzed. Sequence analysis of the DGGE bands confirms previous findings and to identify the presence of BCA on soils. The presence of P. oxalicum in soil is especially related to environmental factors such as humidity. Therefore, we conclude that the 212 of strain Penicillium oxalicum can be considered an optimum BCA, since it is environmentally competitive and effective against a broad spectrum of diseases and does not have any negative effect on soil non-target fungi communities.

La estimación de los árboles añosos en el Inventario Forestal Nacional

El estudio de los árboles añosos es fundamental para la estimación de la biodiversidad puesto que son nicho ecológico de numerosas especies indicadoras de aves, insectos, líquenes, hongos y briofitos. Sin embargo, no existen definiciones claras para su identificación en los Inventarios Forestales Nacionales debido a que la variable edad no es muestreada en la mayoría de los países y los datos que se recogen no son homogéneos. El objetivo de este trabajo es presentar una metodología aplicable en Inventarios Forestales Nacionales que permita determinar cuándo un árbol es añoso a partir de la medición de su diámetro normal. Esta metodología se fundamenta en modelos mixtos no lineales edad dominante-diámetro a través de los cuales se determinan diámetros límite específicos para cada especie. Se exponen ejemplos de dos especies de pinos de la península ibérica, uno de ámbito mediterráneo, Pinus halepensis Mill.y otro de ámbito eurosiberiano, las poblaciones atlánticas de Pinus pinaster Aiton. Este estudio posibilita la consideración de los árboles añosos en la toma de decisiones en los planes de gestión forestal.

Evolución temporal de las comunidades microbianas ruminales y los parámetros fermentativos en fermentadores Rusitec

Los fermentadores Rusitec (Czerkawski y Breckenridge, 1977) son uno de los tipos de fermentadores más ampliamente utilizados para simular in vitro la fermentación ruminal y permiten realizar estudios de larga duración (semanas). Sin embargo, debido a la prolongada extensión en el tiempo de este tipo de estudios se producen cambios cuantitativos y cualitativos en las poblaciones de microorganismos. Existen algunos estudios que han puesto de manifiesto la disminución de la población de protozoos a lo largo del período de incubación (Carro et al., 1995; Martínez et al., 2011), pero no existe información sobre otras poblaciones microbianas, a pesar de que uno de los requisitos que deberían cumplir los sistemas in vitro es mantener poblaciones microbianas representativas de las existentes en el rumen de los animales. Por ello, el objetivo del presente trabajo fue estudiar la evolución en el tiempo de la abundancia de bacterias, hongos, protozoos y arqueas, así como de los parámetros ruminales en fermentadores Rusitec.