Localizzazione della topoisomerasi IB sui telomeri di S. cerevisiae e ruolo della sua attività catalitica sulle modificazioni istoniche

Il superavvolgimento del DNA nelle cellule, regolato dalle DNA Topoisomerasi, influenza molti processi biologici, quali la trascrizione, la replicazione, la ricombinazione ed il rimodellamento della cromatina. La DNA Topoisomerasi IB eucariotica, (Top1), è un enzima efficiente nella rimozione dei superavvolgimenti del DNA in vitro e la sua principale funzione cellulare è la rimozione dei superavvolgimenti positivi e negativi generati durante la trascrizione e la replicazione. Risultati recenti hanno fornito evidenze sperimentali del coinvolgimento di Top1 in meccanismi multipli di regolazione dell’espressione genica eucariotica, in particolare nella fase di inizio e maturazione dei trascritti. Tuttavia, le funzioni di Top1 non sono ancora state stabilite a livello globale. Pertanto, nella presente tesi di dottorato abbiamo risposto a questa domanda con l’analisi dei profili di trascrizione genica globale e con studi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in cellule di S. cerevisiae. Circa il 9% dei geni sono influenzati da Top1, e l’analisi dei profili di espressione mostra che Top1 wt aumenta l’utilizzo del glucosio e dei pathway per la produzione di energia, con specifica diminuzione della trascrizione dei geni telomerici e subtelomerici. Abbiamo inoltre dimostrato che Top1 wt, ma non il suo mutante inattivo, aumenta la velocità di crescita cellulare nelle cellule di lievito studiate. Le analisi di ChIP mostrano che, in confronto all’assenza dell’enzima, Top1 wt diminuisce l’acetilazione dell’istone H4, compresa quella specifica della lisina 16, nel telomero destro del cromosoma XIV mentre la mutazione che inattiva l’enzima aumenta in maniera marcata l’acetilazione dell’istone H4 e la di-metilazione della lisina 4 dell’istone H3. Top1 wt incrementa anche il reclutamento di Sir3 nelle regioni di confine della cromatina silenziata dello stesso telomero. Studi di immunoprecipitazione indicano che l’enzima interagisce direttamente con la struttura della cromatina telomerica poichè entrambe le proteine, quella wt e quella inattiva, sono localizzate sulle ripetizioni telomeriche dei cromosomi di lievito. Questi risultati dimostrano che Top1, una proteina non essenziale in lievito, ottimizza i livelli globali dei trascritti per una crescita più efficiente di cellule in fase esponenziale. Indagando il meccanismo che è alla base della specifica repressione dei geni telomerici, abbiamo dimostrato che Top1 favorisce delle modifiche posttraduzionali degli istoni che indicano una struttura della cromatina repressa nelle regioni telomeriche.

Analisi del circuito di regolazione responsabile del controllo trascrizionale dei geni Heat-Shock in Helicobacter pylori

Helicobacter pylori, un patogeno umano in grado di colonizzare la nicchia gastrica, è associato a patologie del tratto gastrointestinale di varia gravità. Per sopravvivere nell’ambiente ostile dello stomaco dell’ospite, e mettere in atto un’infezione persistente, il batterio si serve di una serie di fattori di virulenza che includono anche le proteine Heat Shock (chaperone). I principali geni codificanti le proteine chaperone in H. pylori sono organizzati in tre operoni trascritti dall’RNA polimerasi contenente il fattore sigma vegetativo σ80. La trascrizione di due dei tre operoni è regolata negativamente da due regolatori trascrizionali, HspR e HrcA, mentre il terzo operone è represso solo da HspR. Fino ad ora, studi molecolari per la comprensione del ruolo di ciascuna proteina nel controllo trascrizionale dei geni heat shock sono stati ostacolati dalla citotossicità ed insolubilità di HrcA quando espressa in sistemi eterologhi. In questo lavoro, è stata analizzata la sequenza amminoacidica di HrcA ed è stata confermata sperimentalmente la predizione bioinformatica della sua associazione con la membrana interna. La citotossicità e l’insolubilità di HrcA in E. coli sono state alleviate inducendone l’espressione a 42°C. Saggi in vitro con le proteine ricombinanti purificate, HspR e HrcA, hanno consentito di definire i siti di legame dei due repressori sui promotori degli operoni heat shock. Ulteriori saggi in vitro hanno suggerito che l’affinità di HrcA per gli operatori è aumentata dalla chaperonina GroESL. Questi dati contribuiscono parzialmente alla comprensione del meccanismo di repressione della trascrizione espletato da HrcA e HspR e permettono di ipotizzare il coinvolgimento di altri regolatori trascrizionali. L’analisi di RNA estratti dal ceppo selvatico e dai mutanti hrcA, hspR e hrcA/hspR di H.pylori su DNAmacroarrays non ha evidenziato il coinvolgimento di altri regolatori trascrizionali, ma ha permesso l’identificazione di un gruppo di geni indotti da HrcA e/ HspR. Questi geni sono coinvolti nella biosintesi e regolazione dell’apparato flagellare, suggerendo un’interconnessione tra la risposta heat shock e la motilità e chemiotassi del batterio.

Il nucleotide extracellulare UTP: induzione della migrazione di cellule staminali emopoietiche CD34+

La letteratura scientifica degli ultimi anni si è arricchita di un numero sempre crescente di studi volti a chiarire i meccanismi che presiedono ai processi di homing di cellule staminali emopoietiche e del loro attecchimento a lungo termine nel midollo osseo. Tali fenomeni sembrano coinvolgere da un lato, l’interazione delle cellule staminali emopoietiche con la complessa architettura e componente cellulare midollare, e dall’altro la riposta ad un’ampia gamma di molecole regolatrici, tra le quali chemochine, citochine, molecole di adesione, enzimi proteolitici e mediatori non peptidici. Fanno parte di quest’ultimo gruppo anche i nucleotidi extracellulari, un gruppo di molecole-segnale recentemente caratterizzate come mediatori di numerose risposte biologiche, tra le quali l’allestimento di fenomeni flogistici e chemiotattici. Nel presente studio è stata investigata la capacità dei nucleotidi extracellulari ATP ed UTP di promuovere, in associazione alla chemochina CXCL12, la migrazione di cellule staminali umane CD34+. E’ così emerso che la stimolazione con UTP è in grado di incrementare significativamente la migrazione dei progenitori emopoietici in risposta al gradiente chemioattrattivo di CXCL12, nonché la loro capacità adesiva. Le analisi citofluorimetriche condotte su cellule migranti sembrano inoltre suggerire che l’UTP agisca interferendo con le dinamiche di internalizzazione del recettore CXCR4, rendendo così le cellule CD34+ maggiormente responsive, e per tempi più lunghi, al gradiente attrattivo del CXCL12. Saggi di homing competitivo in vivo hanno parallelamente mostrato, in topi NOD/SCID, che la stimolazione con UTP aumenta significativamente la capacità dei progenitori emopoeitci umani di localizzarsi a livello midollare. Sono state inoltre indagate alcune possibili vie di trasduzione del segnale attivate dalla stimolazione di recettori P2Y con UTP. Esperimenti di inibizione in presenza della tossina della Pertosse hanno evidenziato il coinvolgimento di proteine Gαi nella migrazione dipendente da CXCL12 ed UTP. Ulteriori indicazioni sono provenute dall’analisi del profilo trascrizionale di cellule staminali CD34+ stimolate con UTP, con CXCL12 o con entrambi i fattori contemporaneamente. Da questa analisi è emerso il ruolo di proteine della famiglia delle Rho GTPasi e di loro effettori a valle (ROCK 1 e ROCK 2) nel promuovere la migrazione UTP-dipendente. Questi dati sono stati confermati successivamente in vitro mediante esperimenti con Tossina B di C. Difficile (un inibitore delle Rho GTPasi) e con Y27632 (in grado di inibire specificatamente le cinasi ROCK). Nel complesso, i dati emersi in questo studio dimostrano la capacità del nucleotide extracellulare UTP di modulare la migrazione in vitro di progenitori emopoietici umani, nonché il loro homing midollare in vivo. L’effetto dell’UTP su questi fenomeni si esplica in concerto con la chemochina CXCL12, attraverso l’attivazione concertata di vie di trasduzione del segnale almeno parzialmente condivise da CXCR4 e recettori P2Y e attraverso il reclutamento comune di proteine ad attività GTPasica, tra le quali le proteine Gαi e i membri della famiglia delle Rho GTPasi.

Un’analisi statistico – economica dell’impatto delle norme WHO su nutrizione e salute

I comportamenti nutrizionali stanno assumendo sempre maggiore rilievo all’interno delle politiche comunitarie e questo sottolinea che la dieta sta avendo, negli ultimi anni, una maggiore importanza come fattore di causa e allo stesso tempo prevenzione nella diffusione di malattie croniche come il cancro, malattie cardiovascolari, diabete, osteoporosi e disturbi dentali. Numerosi studi mostrano infatti che i tassi di obesità sono triplicati nelle ultime due decadi e si è stimato che, se i livelli di obesità continueranno a crescere allo stesso tasso del 1990, nel 2010 il numero di persone obese raggiungerà i 150 milioni tra gli adulti e i 15 milioni tra bambini e adolescenti. I governi nazionali stanno quindi cercando di risolvere questo problema, a cui sono inoltre legati alti costi nazionali, tramite l’implementazione di politiche nutrizionali. Analisi di tipo cross-section sono già state evidenziate da studiosi come Schmidhuber e Traill (2006), i quali hanno effettuato un’analisi di convergenza a livello europeo per esaminare la distanza tra le calorie immesse da 426 prodotti diversi. In quest’analisi hanno così dimostrato la presenza di una similarità distinta e crescente tra i paesi europei per quanto riguarda la composizione della dieta. Srinivasan et al. invece hanno osservato la relazione esistente tra ogni singolo prodotto alimentare consumato e le norme nutrizionali dell’ Organizzazione Mondiale della Sanità (World Health Organization, WHO) Lo scopo di questa tesi è quello di evidenziare il problema a livello di aggregati nutritivi e di specifiche componenti nutrizionali come zucchero, frutta e verdura e non relativamente ad ogni singolo prodotto consumato. A questo proposito ci si è basati sulla costruzione di un indicatore (Recommendation Compliance Index) in modo da poter misurare le distanze tra la dieta media e le raccomandazioni del WHO. Lo scopo è quindi quello di riuscire a quantificare il fenomeno del peggioramento della dieta in diverse aree del mondo negli ultimi quattro decenni, tramite un’analisi panel, basandosi sui dati sui nutrienti consumati, provenienti dal database della FAO (e precisamente dal dataset Food Balance Sheets – FBS). Nella prima fase si introduce il problema dell’obesità e delle malattie croniche correlate, evidenziando dati statistici in diversi paesi europei e mondiali. Si sottolineano inoltre le diverse azioni dei governi e del WHO, tramite l’attuazione di campagne contro l’obesità e in favore di una vita più salutare e di una maggiore attività fisica. Nella seconda fase si è costruito un indicatore aggregato (Recommendation Compliance Index) in modo da analizzare le caratteristiche nella dieta dei diversi Paesi a livello mondiale rispetto alle norme del WHO. L’indicatore si basa sui dati ottenuti da FAOSTAT ed è calcolato per 149 paesi del database dell’FBS per il periodo 1961-2002. Nell’analisi si sono utilizzati i dati sulle percentuali di energia prodotta dalle varie componenti nutritive, quali grassi, grassi saturi e transaturi, zuccheri, carboidrati, proteine e le quantità di frutta e verdura consumate. Inoltre si è applicato un test statistico per testare se il valore del RCI è significativamente cambiato nel tempo, prendendo in considerazione gruppi di Paesi (Paesi OECD, Paesi in via di sviluppo e sottosviluppati). Si è voluto poi valutare la presenza o meno di un processo di convergenza, applicando l’analisi di σ-convergenza per osservare ad esempio se la variabilità è diminuita nel tempo in modo significativo. Infine si è applicato l’indicatore ad un livello micro, utilizzando il database del National Diet and Nutrition Survey, che raccoglie dati di macrocomponenti nutritive e misure antropometriche della popolazione inglese dai 16 ai 64 anni per il periodo 2000-2001. Si sono quindi effettuate analisi descrittive nonché analisi di correlazione, regressione lineare e ordinale per osservare le relazioni tra l’indicatore, i macronutrienti, il reddito e le misure antropometriche dell’ Indice di Massa Corporea (Body Mass Index, BMI) e del rapporto vita-fianchi (Waist-hip ratio, WHR).

Caratterizzazione del legame di molecole di interesse farmaceutico alla sieroalbumina umana mediante biocromatografia e dicroismo circolare

Negli ultimi anni, un crescente numero di studiosi ha focalizzato la propria attenzione sullo sviluppo di strategie che permettessero di caratterizzare le proprietà ADMET dei farmaci in via di sviluppo, il più rapidamente possibile. Questa tendenza origina dalla consapevolezza che circa la metà dei farmaci in via di sviluppo non viene commercializzato perché ha carenze nelle caratteristiche ADME, e che almeno la metà delle molecole che riescono ad essere commercializzate, hanno comunque qualche problema tossicologico o ADME [1]. Infatti, poco importa quanto una molecola possa essere attiva o specifica: perché possa diventare farmaco è necessario che venga ben assorbita, distribuita nell’organismo, metabolizzata non troppo rapidamente, ne troppo lentamente e completamente eliminata. Inoltre la molecola e i suoi metaboliti non dovrebbero essere tossici per l’organismo. Quindi è chiaro come una rapida determinazione dei parametri ADMET in fasi precoci dello sviluppo del farmaco, consenta di risparmiare tempo e denaro, permettendo di selezionare da subito i composti più promettenti e di lasciar perdere quelli con caratteristiche negative. Questa tesi si colloca in questo contesto, e mostra l’applicazione di una tecnica semplice, la biocromatografia, per caratterizzare rapidamente il legame di librerie di composti alla sieroalbumina umana (HSA). Inoltre mostra l’utilizzo di un’altra tecnica indipendente, il dicroismo circolare, che permette di studiare gli stessi sistemi farmaco-proteina, in soluzione, dando informazioni supplementari riguardo alla stereochimica del processo di legame. La HSA è la proteina più abbondante presente nel sangue. Questa proteina funziona da carrier per un gran numero di molecole, sia endogene, come ad esempio bilirubina, tiroxina, ormoni steroidei, acidi grassi, che xenobiotici. Inoltre aumenta la solubilità di molecole lipofile poco solubili in ambiente acquoso, come ad esempio i tassani. Il legame alla HSA è generalmente stereoselettivo e ad avviene a livello di siti di legame ad alta affinità. Inoltre è ben noto che la competizione tra farmaci o tra un farmaco e metaboliti endogeni, possa variare in maniera significativa la loro frazione libera, modificandone l’attività e la tossicità. Per queste sue proprietà la HSA può influenzare sia le proprietà farmacocinetiche che farmacodinamiche dei farmaci. Non è inusuale che un intero progetto di sviluppo di un farmaco possa venire abbandonato a causa di un’affinità troppo elevata alla HSA, o a un tempo di emivita troppo corto, o a una scarsa distribuzione dovuta ad un debole legame alla HSA. Dal punto di vista farmacocinetico, quindi, la HSA è la proteina di trasporto del plasma più importante. Un gran numero di pubblicazioni dimostra l’affidabilità della tecnica biocromatografica nello studio dei fenomeni di bioriconoscimento tra proteine e piccole molecole [2-6]. Il mio lavoro si è focalizzato principalmente sull’uso della biocromatografia come metodo per valutare le caratteristiche di legame di alcune serie di composti di interesse farmaceutico alla HSA, e sul miglioramento di tale tecnica. Per ottenere una miglior comprensione dei meccanismi di legame delle molecole studiate, gli stessi sistemi farmaco-HSA sono stati studiati anche con il dicroismo circolare (CD). Inizialmente, la HSA è stata immobilizzata su una colonna di silice epossidica impaccata 50 x 4.6 mm di diametro interno, utilizzando una procedura precedentemente riportata in letteratura [7], con alcune piccole modifiche. In breve, l’immobilizzazione è stata effettuata ponendo a ricircolo, attraverso una colonna precedentemente impaccata, una soluzione di HSA in determinate condizioni di pH e forza ionica. La colonna è stata quindi caratterizzata per quanto riguarda la quantità di proteina correttamente immobilizzata, attraverso l’analisi frontale di L-triptofano [8]. Di seguito, sono stati iniettati in colonna alcune soluzioni raceme di molecole note legare la HSA in maniera enantioselettiva, per controllare che la procedura di immobilizzazione non avesse modificato le proprietà di legame della proteina. Dopo essere stata caratterizzata, la colonna è stata utilizzata per determinare la percentuale di legame di una piccola serie di inibitori della proteasi HIV (IPs), e per individuarne il sito(i) di legame. La percentuale di legame è stata calcolata attraverso il fattore di capacità (k) dei campioni. Questo parametro in fase acquosa è stato estrapolato linearmente dal grafico log k contro la percentuale (v/v) di 1-propanolo presente nella fase mobile. Solamente per due dei cinque composti analizzati è stato possibile misurare direttamente il valore di k in assenza di solvente organico. Tutti gli IPs analizzati hanno mostrato un’elevata percentuale di legame alla HSA: in particolare, il valore per ritonavir, lopinavir e saquinavir è risultato maggiore del 95%. Questi risultati sono in accordo con dati presenti in letteratura, ottenuti attraverso il biosensore ottico [9]. Inoltre, questi risultati sono coerenti con la significativa riduzione di attività inibitoria di questi composti osservata in presenza di HSA. Questa riduzione sembra essere maggiore per i composti che legano maggiormente la proteina [10]. Successivamente sono stati eseguiti degli studi di competizione tramite cromatografia zonale. Questo metodo prevede di utilizzare una soluzione a concentrazione nota di un competitore come fase mobile, mentre piccole quantità di analita vengono iniettate nella colonna funzionalizzata con HSA. I competitori sono stati selezionati in base al loro legame selettivo ad uno dei principali siti di legame sulla proteina. In particolare, sono stati utilizzati salicilato di sodio, ibuprofene e valproato di sodio come marker dei siti I, II e sito della bilirubina, rispettivamente. Questi studi hanno mostrato un legame indipendente dei PIs ai siti I e II, mentre è stata osservata una debole anticooperatività per il sito della bilirubina. Lo stesso sistema farmaco-proteina è stato infine investigato in soluzione attraverso l’uso del dicroismo circolare. In particolare, è stato monitorata la variazione del segnale CD indotto di un complesso equimolare [HSA]/[bilirubina], a seguito dell’aggiunta di aliquote di ritonavir, scelto come rappresentante della serie. I risultati confermano la lieve anticooperatività per il sito della bilirubina osservato precedentemente negli studi biocromatografici. Successivamente, lo stesso protocollo descritto precedentemente è stato applicato a una colonna di silice epossidica monolitica 50 x 4.6 mm, per valutare l’affidabilità del supporto monolitico per applicazioni biocromatografiche. Il supporto monolitico monolitico ha mostrato buone caratteristiche cromatografiche in termini di contropressione, efficienza e stabilità, oltre che affidabilità nella determinazione dei parametri di legame alla HSA. Questa colonna è stata utilizzata per la determinazione della percentuale di legame alla HSA di una serie di poliamminochinoni sviluppati nell’ambito di una ricerca sulla malattia di Alzheimer. Tutti i composti hanno mostrato una percentuale di legame superiore al 95%. Inoltre, è stata osservata una correlazione tra percentuale di legame è caratteristiche della catena laterale (lunghezza e numero di gruppi amminici). Successivamente sono stati effettuati studi di competizione dei composti in esame tramite il dicroismo circolare in cui è stato evidenziato un effetto anticooperativo dei poliamminochinoni ai siti I e II, mentre rispetto al sito della bilirubina il legame si è dimostrato indipendente. Le conoscenze acquisite con il supporto monolitico precedentemente descritto, sono state applicate a una colonna di silice epossidica più corta (10 x 4.6 mm). Il metodo di determinazione della percentuale di legame utilizzato negli studi precedenti si basa su dati ottenuti con più esperimenti, quindi è necessario molto tempo prima di ottenere il dato finale. L’uso di una colonna più corta permette di ridurre i tempi di ritenzione degli analiti, per cui la determinazione della percentuale di legame alla HSA diventa molto più rapida. Si passa quindi da una analisi a medio rendimento a una analisi di screening ad alto rendimento (highthroughput- screening, HTS). Inoltre, la riduzione dei tempi di analisi, permette di evitare l’uso di soventi organici nella fase mobile. Dopo aver caratterizzato la colonna da 10 mm con lo stesso metodo precedentemente descritto per le altre colonne, sono stati iniettati una serie di standard variando il flusso della fase mobile, per valutare la possibilità di utilizzare flussi elevati. La colonna è stata quindi impiegata per stimare la percentuale di legame di una serie di molecole con differenti caratteristiche chimiche. Successivamente è stata valutata la possibilità di utilizzare una colonna così corta, anche per studi di competizione, ed è stata indagato il legame di una serie di composti al sito I. Infine è stata effettuata una valutazione della stabilità della colonna in seguito ad un uso estensivo. L’uso di supporti cromatografici funzionalizzati con albumine di diversa origine (ratto, cane, guinea pig, hamster, topo, coniglio), può essere proposto come applicazione futura di queste colonne HTS. Infatti, la possibilità di ottenere informazioni del legame dei farmaci in via di sviluppo alle diverse albumine, permetterebbe un migliore paragone tra i dati ottenuti tramite esperimenti in vitro e i dati ottenuti con esperimenti sull’animale, facilitando la successiva estrapolazione all’uomo, con la velocità di un metodo HTS. Inoltre, verrebbe ridotto anche il numero di animali utilizzati nelle sperimentazioni. Alcuni lavori presenti in letteratura dimostrano l’affidabilita di colonne funzionalizzate con albumine di diversa origine [11-13]: l’utilizzo di colonne più corte potrebbe aumentarne le applicazioni.

Effetto dell'erbicida Terbutilazina sulla crescita di flagellate marine in coltura

Il fitoplancton è costituito da organismi molto importanti per l'ambiente marino e molto diversificati sia dal punto di vista morfologico che fisiologico.Questi organismi sono normalmente soggetti ai cambiamenti stagionali e alle variazioni dell'ambiente dovute sia a fenomeni naturali che all'impatto antropico, sempre più rilevante. Con questa tesi si è voluto approfondire l'effetto di erbicidi comunemente usati dall'uomo in agricoltura su delle microalghe flagellate rappresentative del Mar Adriatico. L'inquinante scelto è la Terbutilazina, sostanza utilizzata per il diserbo del mais e diffusa in tutta l'area padano-venera, come dimostrano i dati dei campionamenti ARPA, che riportano la presenza di Terbutilazina e del suo prodotto di degradazione Desetil-Terbutilazina a concentrazioni superiori al limite fissato sia nelle acque superficiali che in quelle sotterranee. Anche in mare come riportato in letteratura (Carafa et. al 2009)è stato riscontrato a concentrazioni superiori al limite previsto dalla normativa vigente in Italia. In particolare il meccanismo d'azione di questo erbicida interferisce con la fotosintesi, agendo sulle proteine di membrana dei cloroplasti, rimpiazzando il chinone accettore di elettroni QB della proteina D1 del fotosistema II. Più specie di microalghe fatte crescere in colture 'batch' sono state testate a diverse concentrazioni di erbicida in condizione di luce nutrienti costanti. Questi esperimenti sono stati inoltre condotti a due diverse temperature (20 e 25°C) per studiare l'effetto di questo inquinante in correlazione con l'attuale aumento di temperatura in atto nel pianeta. In una prima fase di screening è stato valutato l'effetto della Terbutilazina su 9 specie di flagellate rappresentative dell'Adriatico, tramite misure dell'efficienza fotosintetica. Grazie a questa prima fase sono state individuate le microalghe e le relative concentrazioni di Terbutilazina da utilizzare negli esperimenti. Per gli esperimenti, sono state scelte le due specie algali Gonyaulax spinifera e Prorocentrum minimum sulle quali si è approfondito lo studio dell'effetto dell'inquinante alle due temperature, attraverso una serie di analisi volte ad individuare le risposte in termini di crescita e di fisiologia delle alghe quali: conteggio delle cellule, torbidità, efficienza fotosintetica, consumo di nutrienti, quantità di clorofilla e di polisaccaridi extracellulari prodotti. La scelta di queste microalghe è stata dettata dal fatto che Gonyaulax spinifera si è rivelata la microalga più sensibile a concentrazioni di erbicida più vicine a quelle ambientali fra tutte le alghe valutate, mentre Prorocentrum minimum è fra le dinoflagellate più frequenti e rappresentative del Mar Adriatico (Aubry et al. 2004), anche se non particolarmente sensibile; infatti P. minimum è stato testato ad una concentrazione di erbicida maggiore rispetto a quelle normalmente ritrovate in ambiente marino. Dai risultati riportati nella tesi si è visto come l'erbicida Terbutilazina sia in grado di influenzare la crescita e la fotosintesi di microalghe flagellate dell'Adriatico anche a concentrazioni pari a quelle rilevate in ambiente, e si è evidenziato che gli effetti sono maggiori alle temperature in cui le microalghe hanno una crescita meno efficiente. Questi studi hanno messo in evidenza anche l'utilità delle misure di fotosintesi tramite fluorimetro PAM nel valutare le risposte delle microalghe agli erbicidi triazinici. Inoltre la diversa risposta delle microalghe osservata, potrebbe avere conseguenze rilevanti sulle fioriture estive di fitoplancton in caso di presenza in mare di Terbutilazina, anche a concentrazioni non particolarmente elevate. Questo lavoro si inserisce in un contesto più ampio di ricerca volto alla modellizzazione della crescita algale in presenza di inquinanti ed in concomitanza con le variazioni di temperatura. Infatti i dati ottenuti insieme a misure di carbonio cellulare, non ancora effettuate, saranno utili per la messa a punto di nuove parametrizzazioni che si avvicinino maggiormente ai dati reali, per poi simulare i possibili scenari futuri variando le condizioni ambientali e le concentrazioni dell'inquinante studiato.

Caratterizzazione biomolecolare di listeria monocytogenes in suini regolarmente macellati

Listeria monocytogenes è un batterio patogeno responsabile di una malattia potenzialmente molto grave per l’uomo. L’infezione avviene soprattutto tramite l’ingestione di alimenti di origine animale contaminati, e può propagarsi per via transplacentare al feto. Il potenziale patogeno di L. monocytogenes è dovuto soprattutto a caratteristici fattori di virulenza con i quali alcuni ceppi sono in grado di attaccare la cellula dell’organismo ospite potendo aderire, invadere, moltiplicare e propagare alle cellule adiacenti. Il presente studio è rivolto al rilevamento tramite reazione polimerasica a catena (PCR) di alcuni fattori di virulenza di ceppi di L. monocytogenes isolati da campioni prelevati presso macelli suini, mediante l’identificazione dei geni responsabili della sintesi delle proteine di superficie che intervengono nel processo patogenetico, allo scopo di valutare la potenziale pericolosità di quelli isolati sia sulle carcasse, sia dal contenuto intestinale.

Detection and localization of GLUTs in spermatozoa from different domestic species

Sperm cells need hexoses as a substrate for their function, for both the maintenance of membrane homeostasis and the movement of the tail. These cells have a peculiar metabolism that has not yet been fully understood, but it is clear that they obtain energy from hexoses through glycolisis and/or oxidative phosphorylation. Spermatozoa are in contact with different external environments, beginning from the testicular and epididymal fluid, passing to the seminal plasma and finally to the female genital tract fluids; in addition, with the spread of reproductive biotechnologies, sperm cells are diluted and stored in various media, containing different energetic substrates. To utilize these energetic sources, sperm cells, as other eukaryotic cells, have a well-constructed protein system, that is mainly represented by the GLUT family proteins. These transporters have a membrane-spanning α-helix structure and work as an enzymatic pump that permit a fast gradient dependent passage of sugar molecules through the lipidic bilayer of sperm membrane. Many GLUTs have been studied in man, bull and rat spermatozoa; the presence of some GLUTs has been also demonstrated in boar and dog spermatozoa. The aims of the present study were - to determine the presence of GLUTs 1, 2, 3, 4 and 5 in boar, horse, dog and donkey spermatozoa and to describe their localization; - to study eventual changes in GLUTs location after capacitation and acrosome reaction in boar, stallion and dog spermatozoa; - to determine possible changes in GLUTs localization after capacitation induced by insulin and IGF stimulation in boar spermatozoa; - to evaluate changes in GLUTs localization after flow-cytometric sex sorting in boar sperm cells. GLUTs 1, 2, 3 and 5 presence and localization have been demonstrated in boar, stallion, dog and donkey spermatozoa by western blotting and immunofluorescence analysis; a relocation in GLUTs after capacitation has been observed only in dog sperm cells, while no changes have been observed in the other species examined. As for boar, the stimulation of the capacitation with insulin and IGF didn’t cause any change in GLUTs localization, as well as for the flow cytometric sorting procedure. In conclusion, this study confirms the presence of GLUTs 1, 2 ,3 and 5 in boar, dog, stallion and donkey spermatozoa, while GLUT 4 seems to be absent, as a confirmation of other studies. Only in dog sperm cells capacitating conditions induce a change in GLUTs distribution, even if the physiological role of these changes should be deepened.

Kernspektroskopie an N=40 und N=82 Nukliden

Der astrophysikalische r-Prozeß (schneller Neutroneneinfang), ist verantwortlich für die Nukleosynthese einer großen Zahl von Elementen, die schwerer als Eisen sind. Benutzt man das ''waiting-point''-Modell, so kann die Häufigkeitsverteilung der Elemente durch drei nukleare und drei stellare Input-Parameter beschrieben werden. Für einen gegebenen Satz von stellaren Parametern definiert die Neutronenseparationsenergie (Sn) den r-Prozeß-Pfad. Die beta-Zerfall-Halbwertszeit (T1/2) der Kerne im r-Prozeß-Pfad bestimmt die Häufigkeit des Vorläufers und bezieht man die Neutronenemissionswahrscheinlichkeit (Pn) mit ein, so auch die endgültige Häufigkeitsverteilung. Von besonderer Wichtigkeit sind die neutronenreichen ''waiting-point''-Isotope. Zum Beispiel sind die N=82 Isotope verantwortlich für den solaren A~130 Häufigkeits-Peak. Diese Arbeit befaßt sich mit der Identifizierung und der Untersuchung von Zerfallseigenschaften neutronenreicher Isotope des Mangan (A=61 bis 69) und Cadmium (A=130 bis 132). Neutronenreiche Nuklide zu erzeugen und zu detektieren ist ein komplizierter und zeitaufwendiger Prozeß, nichts desto trotz erfolgreich. Das Hauptproblem bei dieser Art von Experimenten ist der hohe isobare Untergrund. Aus diesem Grunde wurden speziell entwickelte Anregungsschemata für Mangan und Cadmium eingesetzt, um die gewünschten Isotope mittels Laser-Resonanzionisation chemisch selektiv zu ionisieren. Bei CERN/ISOLDE war es möglich im Massenbereich von 60^Mn bis 69^Mn neue Halbwertszeiten und Pn-Werte zu bestimmen. Für 64^Mn und 66^Mn konnten darüber hinaus erstmals noch partielle Zerfallsschemata aufgestellt werden. Es zeigte sich, daß die Ergebnisse teilweise recht überraschend waren, da sie nicht durch das QRPA-Modell vorhergesagt wurden. Mit Hilfe vergleichender Studien des Gesamttrends der Niveausystematiken der gg-Kerne von 26_Fe, 30_Zn, 32_Ge, 24_Cr und 28_Ni konnte ein Verschwinden der sphärischen N=40 Unterschale und die Existenz einer neuen Region mit signifikanter Deformation nachgewiesen werden, die vermutlich ihr ''Zentrum'' bei 64^Cr hat. Ebenfalls zeigen Studien der Niveausystematik bei 48Cd und der Vergleich mit 46_Pd, 54_Xe, 52_Te und 50_Sn, erste Hinweise eines Schalenquenchings bei N=82. Es wurde die Messung der Halbwertszeit von 130^Cd verbessert und die Halbwertszeiten von 131^Cd und 132^Cd erstmals bestimmt. Die neuen Daten können nur erklärt werden, wenn man bei der QRPA-Rechnung verbotene Übergänge mitberücksichtigt. Es genügt nicht, die Rechnung für reinen Gamow-Teller-Zerfall durchzuführen.

Untersuchungen zur Beteiligung der Preseniline an den molekularen Mechanismen der Amyloid-ß Entstehung

ZusammenfassungMorbus Alzheimer ist eine progressive, neurodegenerative Erkrankung, die weltweit die häufigste Form der Demenz darstellt und im mittleren bis späten Lebensabschnitt auftritt. Die neuropathologischen Merkmale beinhalten das Auftreten von extrazellulären Ablagerungen aus fibrillogenem Aß42 Peptiden in senilen Plaques und intraneuronalen Akkumulationen von hyperphosphoryliertem Tau in sogenannten neurofibrillären Bündeln. Obwohl die meisten Alzheimer Fälle sporadisch und Alters-assoziiert auftreten, gibt es eine autosomal dominant vererbte Form (FAD; Familial Alzheimer Disease), die schon in einem frühen Lebensabschnitt (ab 28 Jahren) ausbrechen kann. Diese aggressive Alzheimer Form wird durch Mutationen im Amyloid-Precursor-Protein-Gen (APP) oder den Presenilin-Genen (PS-1 und PS-2) ausgelöst. Die Presenilin (PS) Proteine sind entscheidend an der Entstehung von Aß beteiligt. So erhöhen FAD-assoziierte Mutationen in PS-1 und PS-2 die Bildung von Aß42. Außerdem verhindern sowohl homozygote PS-1 Null-Mutationen (PS-1-/-) in transgenen Mäusen, als auch dominant negative PS-1 Mutationen in Kulturzellen die Ab Bildung. Diese Belege sprechen für die zur Zeit favorisierte Amyloid Hypothese, in der die toxische Wirkung des Aß-Peptides in der Entstehung der Alzheimer Erkrankung eine zentrale Rolle einnimmt. Die y-Sekretase ist eine Protease, deren Aktivität für die Entstehung von Ab aus dem Vorläuferprotein APP essentiell ist. Damit bildet sie einen möglichen Ansatzpunkt, um grundlegend in den Prozeß der Ab Bildung einzugreifen. Die y-Sekretase ist allerdings noch nicht identifiziert oder kloniert. Es gibt Hinweise, daß die Preseniline y-Sekretase Aktivität besitzen könnten. Diese Theorie ist bis heute jedoch nicht eindeutig belegt. In dieser Arbeit sollten die molekularen Mechanismen der Ab Entstehung und insbesondere die Beteiligung der Preseniline an diesem Prozeß untersucht werden. Dazu wurde zunächst die subzelluläre Verteilung der endogenen Preseniline analysiert. Es konnte erstmalig ein Unterschied in der subzellulären Verteilung zwischen PS-1 und PS-2 festgestellt werden. PS-1 war vorwiegend im ER lokalisiert, wogegen PS-2 stark im Golgi-Apparat angereichert war. Im zweiten Teil der Arbeit wurde nach möglichen Interaktionen der Preseniline mit C-terminalen APP Fragmenten gesucht, die die Substrate der y-Sekretase darstellen. Es konnte gezeigt werden, daß die Preseniline mit einem 21 kDa großen C-terminalen APP Fragment interagieren. Dabei band die Mutante-Form der Preseniline mehr C-terminales APP Fragment als die Wildtyp-Form. Weiterhin wurde ein zellfreies System zur indirekten Bestimmung der y-Sekretase Aktivität etabliert. Mit Hilfe dieses Systems wird es möglich, Inhibitoren der y-Sekretase zu identifizieren. Die Spezifität des zellfreien Testsystems konnte dadurch deutlich gemacht werden, daß das PS-1, das schon in Zellkultur als essentielle Proteinkomponente zur Entstehung von Aß beschrieben wurde, auch in diesem zellfreien y-Sekretase System notwendig war. Allgemeine Proteaseinhibitoren, die alle bekannten Proteasemechanismen abdeckten, zeigten keinen Einfluß auf die de novo Bildung von Aß. Es konnte festgestellt werden, daß neben der y-Sekretase als Aß produzierende Protease auch Aß abbauende Proteasen vorlagen. Das pH-Optimum der y-Sekretase wurde im neutralen Bereich festgestellt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die y-Sekretase eine transmembrane oder zumindest membranassoziierte Protease ist, die keine cytosolischen Komponenten benötigt.

Erkennungssequenzen und strukturelle Elemente als Determinanten der regulierten Spaltung von Membranproteinen

Eine funktionell und strukturell diverse Gruppe von Transmembranproteinen wie beispielsweise Mediatoren und deren Rezeptoren können proteolytisch gespalten werden. Dieser Prozess wird als Shedding bezeichnet. Kürzlich konnte die proteolytische Aktivität identifiziert werden, die für die Prozessierung von proTNFa verantwortlich ist. Sie wurde TACE (TNF Alpha Converting Enzyme) genannt. In Experimenten mit TACE-/- Fibroblasten konnte ich herausfinden, dass das durch PMA induzierte Shedding des IL-6Rs stark reduziert war. Eine basale hydroxamatsensitive Freisetzung des IL-6Rs konnte allerdings noch detektiert werden. Um Unterschiede im Shedding von IL-6R und proTNFa zu untersuchen, generierte ich chimäre Proteine aus diesen beiden Proteinen, bei denen die Spaltstellenregionen gegeneinander vertauscht worden waren. TNFa Chimären zeigten nur sehr geringes Shedding. Im Gegensatz dazu wurden IL-6R Chimären, die die proTNFa Spaltstelle enthielten spontan gespalten. Die PMA-Induzierbarkeit war verloren gegangen. Daraufhin wurden verschiedene Chimären des unspaltbaren Proteins gp130 und der Spaltstellenpeptide aus TNFa, TGFa und IL-6R generiert. Hierbei wurde ein kurzes membranproximales Peptid aus gp130 gegen die Spaltstellen ausgetauscht. Diese Peptide übertrugen sowohl spontane ale auch PMA-induzierte Spaltbarkeit auf gp130. Um die minimalen Bedingungen für Shedding zu untersuchen, setzte ich verkürzte IL-6R Spaltstellenpeptide in gp130 ein. Die resultierenden Chimären waren empfänglich für reguliertes Shedding. Überaschenderweise konnten auch spaltbare Chimären durch das Ersetzen der membrannahem Region von gp130 durch die entsprechende Region aus dem ebenfalls nicht spaltbaren LIFR generiert werden.

Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie aus dem marinen Schwamm Geodia cydonium

Der evolutionär älteste Tierstamm der Metazoa, die Schwämme (Porifera), bietet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Selbst/Fremd-Erkennung an. Diese Unterscheidung wurde bei der Evolution von einzelligen zu mehrzelligen Tieren wichtig. Schwämme besitzen ein angeborenes Immunsystem. Ob sie auch Vorläufer der Immunrezeptoren aufweisen, sollte in dieser Arbeit untersucht werden. Einen ersten Schritt stellte die Identifizierung weiterer Gene mit Immunglobulin-ähnlichen Domänen dar. Mit der Isolierung der beiden 'Schwamm-Adhäsionsmoleküle' GCSAML und GCSAMS durch ein Homologiescreening ist dies gelungen. Die Beteiligung dieser Moleküle an einer Immunantwort wurde mit Hilfe von Transplantationsexperimenten untersucht. Die Gewebe von Autotransplantaten fusionierten, während es bei Allotransplantaten zu einer Abstoßung des eingesetzten Gewebes kam. Durch Immunfluoreszenz-Untersuchungen sowohl an Geodia cydonium- als auch an Suberites domuncula-Zellen konnte gezeigt werden, daß Moleküle mit Immunglobulin-ähnlichen Domänen an den Transplantationsprozessen beteiligt sind. Northern Blot-Analysen zeigten die Beteiligung speziell von GCSAML an der Autotransplantation. Western Blot-Analysen bestätigten diese Ergebnisse und weiteten sie auf Allotransplantationen aus. Beide GCSAM-Gene können der Immunglobulin-Superfamilie zugeordnet werden. GCSAML kann durch die Existenz des sogenannten ITIM-Motives weiter in die spezielle Klasse der inhibitorischen Rezeptoren gruppiert werden und stellt damit einen Vorläufer der Immunrezeptoren dar.

Effetto dei modulatori del sistema serotoninergico sulla trasduzione del segnale AMPc-dipendente nel mitilo

Lo sviluppo della medicina ha determinato un utilizzo sempre crescente di sostanze farmacologiche, le quali una volta escrete dagli organismi raggiungono le acque dei fiumi e dei laghi, per arrivare poi all’ambiente marino costiero, che ne risulta sempre maggiormente contaminato. Negli organismi non bersaglio esposti ai residui dei farmaci in ambiente, queste sostanze potrebbero indurre effetti simili a quelli specifici nel caso i bersagli molecolari siano stati conservati durante l’evoluzione, oppure avere effetti inattesi se i bersagli molecolari sono conservati ma hanno una differente funzione. Questo lavoro di tesi è volto a studiare i potenziali effetti indotti dalla fluoxetina (FX, farmaco antidepressivo inibitore dell’uptake della serotonina), e dal propranololo (PROP, farmaco bloccante sia dei recettori β-adrenergici che serotoninergici nell’uomo) nei mitili Mytilus galloprovincialis, esposti a tali sostanze, valutandone l’interazione con i meccanismi di trasduzione del segnale AMPc-dipendente. Sono stati valutati in particolare i livelli di AMPc e l’attività dell’enzima PKA, inoltre si è studiato se i farmaci influiscano con i meccanismi di regolazione del gene ABCB1, che codifica per la P-glicoproteina (Pgp), che ha il compito di estrudere all’esterno della cellula gli xenobiotici che vi sono entrati. Gli studi sono stati condotti dopo esposizione dei mitili in vivo ai due farmaci ed alla loro miscela per 7 giorni in acquario. I risultati hanno indicato che la FX causa una diminuzione statisticamente significativa dei livelli di AMPc, dell’attività della PKA e anche dell’espressione del gene ABCB1 rispetto al controllo, sia nel mantello che nella ghiandola digestiva. Nella ghiandola digestiva il PROP provoca una significativa riduzione dei livelli di AMPc, dell’attività della PKA e dell’espressione del gene ABCB1 rispetto ai valori di controllo. Nel mantello, invece, il PROP aumenta i livelli di AMPc e l’espressione del gene ABCB1, anche se non ha effetti significativi sull’attività della PKA. Per caratterizzare i recettori per la serotonina (5HT), e il possibile ruolo di antagonista giocato dal PROP, abbiamo inoltre trattato in vitro emociti di mitilo con la 5HT l’agonista fisiologico del recettore, usata da sola ed in presenza del PROP. I dati ottenuti dimostrano che negli emociti di mitilo sono espressi recettori 5HT1 accoppiati a proteine G inibitrici, e che il PROP blocca l’effetto della 5HT, agendo come antagonista dei recettori 5HT1. Nell’insieme i dati dimostrano che i farmaci possono avere effetti sugli organismi acquatici anche a concentrazioni molto basse come quelle ambientali. I dati della tesi non dimostrano che PROP e FX hanno effetti deleteri sulle popolazioni o le comunità dei molluschi, ma debbono essere considerati come indicatori della vulnerabilità degli animali a questi composti. Si è dimostrato per la prima volta che gli emociti di mitilo possiedono recettori di tipo 5HT1 correlati alla riduzione dei livelli intracellulari di AMPc, e soprattutto che il sistema AMPc/PKA è deputato alla regolazione dell’espressione dei geni ABCB1 codificanti per proteine del complesso Multi Xenobiotic Resistance.

Funktionale Analyse des CpY/DmX Gens aus Chironomus und Drosophila melanogaster

Zusammenfassung: Funktionale Analyse des CpY/DmX Gens aus Chironomus und Drosophila melanogaster Bei CpY und DmX handelt es sich um homologe neuartige Gene aus den Dipteren Chironomus piger und Drosophila melanogaster. CpY und DmX bestehen aus 15 Exons, die für eine mRNA von ca. 11,5 kb kodieren.Das Gen hat eine genomische Länge von ca. 15 kb. Die abgeleiteten Genprodukte sind durch eine hohe Anzahl von WD-Repeats gekennzeichnet.WD-Proteine besitzen in der Regel regulatorische Funktionen in allen möglichen Bereichen. Ein Strukturvergleich mit homologen Genen legt die Vermutung nahe, daß sich sowohl am N- als auch am C-Terminus eine WD-Propellerstruktur befindet. CpY aus Chironomus piger ist in einem hromosomalen Abschnitt lokalisiert, der den Kern eines evolvierendenGeschlechtschromosoms darstellt. Dieses Gen besitzt im Gegensatz zu DmX geschlechtsspezifisch in Introns integrierte Transposons und wird quantitativ geschlechtsspezifisch gespleißt. DmX ist auf dem X-Chromosom im Bereich 5D6-5E1 lokalisiert, es konnte jedoch kein geschlechtsspezifisches Expressionsmuster diagnostiziert werden. Die Transkriptionsanalyse ergab,daß DmX während der Oogenese und der gesamten Embryonalentwicklung transkribiert wird. Dabei wird neben einer ubiquitären Grundexpression DmX in einer gewebespezifischen Weise exprimiert. Die DmX-Transkriptewandern offensichtlich - wie die CpY-Transkripte - in großer Menge in die reifende Oozyte. Bei DmX/CpY könnte es sich also um ein maternales Effektgen handeln. Während der Embryogenese können zunächst DmX-Transkripte am posterioren Pol nachgewiesen werden. Danach färben die vorderen und hinteren Mitteldarmvorläufer, dann spezifische Zellen im ZNS und in reifen Embryonen das gesamte ZNS, Sinnesorgan-Anlagen im Kopf, sowie der Enddarm. Das dem DmX benachbarte Gen DmSPX, welchen mit diesem einen gemeinsamen 174 bp großen bidirektionalen Promoter besitzt, zeigt ein von DmX unterschiedliches Transkriptionsmuster. Mit einer Reihe von Keimbahntransformationen konnten die für eine ordnungsgemäße Expression hinreichenden regulatorischen Bereiche identifiziert werden. In Versuchen, mittels verschiedener 'Antisense'-Strategien einen Phänotyp zu generieren, konnte kein spezifischer Phänotyp nachgewiesen werden. Durch die erfolgreiche Keimbahntranformationeines Rettungsvektors, welcher ein intaktes DmX-Gen enthält, konnte der Phänotyp von EMS-DmX-Mutanten identifiziert werden: Nach anfänglich normaler Embryonalentwicklung werden die Larven im Laufe des L1-Stadiums schlaff und inaktiv, jedoch nicht paralytisch und stellen Bewegung und Nahrungsaufnahme ein. Kurz nachdem wildtypische Larven das L2-Stadium erreichen, sterben die Mutanten ab. Der Phänotyp wei'st starke Ähnlichkeit zu Synaptotagmin I-Mutanten und zu alpha-Adaptin-Mutanten auf. Das Transkriptionsmuster ähnelt dem von alpha-Adaptin und AP50. Alle diese Gene spielen in der Endozytose eine Rolle

Caratterizzazione dei parametri fisiologici di microalghe utilizzabili nei processi di fitodepurazione

La depurazione è un processo finalizzato a ridurre in modo significativo le sostanze inquinanti presenti nelle acque reflue prima del loro rilascio in ambiente. L’uso delle alghe in impianti di depurazione di acque reflue prende il nome di ficorimedio e potrebbe rappresentare un’alternativa o una integrazione alla depurazione tradizionale dei reflui per il fatto che le alghe operano la rimozione di nutrienti e metalli pesanti dalle acque e al tempo stesso possono fornire biomassa utilizzabile come nuova fonte di energia. Lo scopo principale di questo lavoro è stato di saggiare la capacità depurativa di microalghe idonee per la depurazione dei reflui, questo è stato fatto tramite due esperimenti. Il primo esperimento è stato realizzato in modo tale da simulare un sistema continuo di crescita di Scenedesmus sp. andando a ricreare le stesse condizioni di un sistema all’aperto come negli open ponds, in particolare prelevando periodicamente una parte di biomassa e sostituendola con terreno nuovo. Sono state applicate tre diverse condizioni per analizzare quale metodo permetteva di ottenere maggiori valori di produttività di biomassa e per valutare come questa si diversifica nel tempo nella sua componente biochimica, inoltre si è valutata anche la componente fisiologica, attraverso la misura dell’efficienza fotosintetica. Nel successivo esperimento è stata utilizzata una popolazione algale naturale, proveniente dalla vasca di sedimentazione terziaria del depuratore di Ravenna, e fatta crescere nell’effluente primario. L’esperimento era volto a comprendere i processi di successione delle microalghe in un sistema aperto attraverso uno studio della composizione delle specie nel tempo e a confrontare la crescita e l’efficienza di fitodepurazione della popolazione mista con quelle di Scenedesmus sp. Nelle colture di Scenedesmus sp. in semicontinuo si è visto che il tempo di residenza idraulica minore determina una concentrazione di biomassa inferiore a quella che si ottiene nelle colture con tempi di residenza idraulica maggiori. La produttività dei polisaccaridi (g/L/day) risulta più elevata all’aumentare dei tempi di residenza idraulica, mentre per le proteine l’andamento è inverso. I valori di efficienza fotosintetica evidenziano fenomeni di fotoinibizione nella coltura con minor tempo di residenza idraulica senza che vi sia un danno dell’apparato fotosintetico. L’esperimento basato sulla crescita di una popolazione naturale in coltura batch ha mostrato che la velocità di crescita e la densità di biomassa raggiunta sono di poco inferiori a quelle della monocoltura di Scenedesmus sp. La popolazione è in grado di rimuovere i nutrienti presenti nell’effluente primario dopo 7 giorni, in un tempo maggiore rispetto a quello impiegato da Scenedesmus sp. Questo esperimento ha evidenziato che, sebbene Scenedesmus sp. fosse presente in scarsa quantità all’inizio dell’esperimento, la sua concentrazione aumenta nel tempo dimostrando così di essere maggiormente competitiva rispetto alle altre microalghe presenti nella coltura e di resistere a grazers e patogeni. I risultati ottenuti in questo studio sono importanti per la conduzione di esperimenti di ficodepurazione su scala più ampia e ha permesso di comprendere come la biomassa algale si caratterizza nel tempo andando a simulare le condizioni di crescita in un sistema continuo.