Aplicação de técnicas de biologia molecular no estudo da diversidade genética

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Grau de Mestre por Licenciados Pré-Bolonha, em Biotecnologia

Estrutura Genética de Populações de Glossina palpalis gambiensis (Diptera: Glossinidae) na República da Guiné-Bissau

Glossina palpalis gambiensis é o principal vector de Tripanossomose Humana Africana (THA) na África Ocidental e a mosca tsé-tsé mais comum na Guiné-Bissau. Apesar da sua ampla distribuição, nenhum caso de THA tem sido reportado no país desde finais dos anos 70 do século XX. Populações naturais do Grupo palpalis demonstraram diferentes níveis de variação intraespecífica que podem influenciar a sua capacidade vectorial. Portanto, o conhecimento exacto acerca da identidade das espécies e estrutura populacional é essencial para prever o possível restabelecimento e propagação da transmissão de THA na Guiné-Bissau. A variação genética foi analisada em amostras de Glossina palpalis gambiensis de cinco regiões da Guiné-Bissau, com recurso a microssatélites. Três das regiões pertencem à parte continental e duas representam a parte insular do país. No total, 261 moscas tsé-tsé do sexo feminino foram genotipadas para 11 loci microssatélites. Baixos níveis de diferenciação genética foram observados entre as populações de G. p. gambiensis da Guiné-Bissau (FST = 0,006, P = 0,002). Este resultado está de acordo com a análise de agrupamentos, que revelou a presença de um único cluster agrupando todas as amostras, independentemente da origem geográfica. De um modo geral, estes resultados sugerem uma baixa subestruturação populacional em G. p. gambiensis nesta região. Análises de equilíbrio mutação-deriva sugerem ainda a ocorrência de expansão populacional recente. As evidências genéticas sugerem consideráveis níveis de fluxo genético entre as populações continentais e entre as populações insulares e continentais da Guiné-Bissau. No caso do restabelecimento de focos de transmissão de THA, a possibilidade de disseminação do protozoário Trypanosoma, através da dispersão activa das moscas tsé-tsé, deve ser tida em conta no planeamento de estratégias de controlo vectorial na Guiné-Bissau. PALAVRAS-CHAVE: Glossina, Tripanossomose Humana Africana, microssatélites, diferenciação genética.

Diversidade genética e resistência natural ao Maraviroc em estirpes do vírus da imunodeficiência humana Tipo 1 (HIV-1) em circulação em utilizadores de drogas por via endovenosa na Grande Lisboa

RESUMO: O maraviroc (MVC) é o único anti-retroviral antagonista do co-receptor CCR5 licenciado e interage com as ansas transmembranares de CCR5, induzindo uma alteração da sua conformação e impedindo a interacção com gp120. O MVC é activo apenas contra estirpes R5 de HIV-1, sendo utilizado em terapia de recurso. Neste trabalho, foi estudada a diversidade genética da região C2V3C3 do gene env de estirpes de HIV-1 de oxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa, pesquisando-se também a presença de polimorfismos genéticos naturais. Foram utilizadas 52 amostras de plasma e para 35 destas foi amplificado por RT-nested PCR um produto de 565 pb. A análise filogenética revelou a seguinte distribuição de genótipos: 23 B (incluindo, provavelmente, 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G e 1 F1. Após tradução, e por comparação com a sequência consenso B, verificou-se uma elevada frequência de polimorfismos genéticos, sendo encontradas algumas “assinaturas de aminoácidos” relativas aos subtipos não-B. Realizou-se ainda uma pesquisa de locais de N-glicosilação e a previsão da utilização de co-receptores (abordagem genotípica), com recurso às regras 11/25 e da carga líquida da ansa V3 e aos programas PSSM e geno2pheno[coreceptor]. Observou-se uma conservação genérica do número de locais de N-glicosilação e foram identificadas 5 sequências com tropismo X4 ou duplo. Por fim, com base na literatura, realizou-se uma pesquisa de polimorfismos genéticos associados a resistência ao MVC presentes na ansa V3. Foi observado um número elevado destas mutações. A presença dos padrões 11S+26V e 20F+25D+26V, num total de 3 sequências, é relevante, visto estes estarem inequivocamente associados à resistência in vivo ao MVC. Apesar de não estar ainda definido um perfil de resistência para o MVC, a presença das mutações encontradas, em indivíduos sem contacto prévio com o fármaco, trará implicações relevantes na sua gestão clínica, considerando a introdução do MVC na terapia de recurso.---------- ABSTRACT: Maraviroc (MVC) is the only CCR5 inhibitor licensed today. This drug interacts with the transmembrane helices of CCR5 co-receptor, inducing a conformation change of its extracellular loops and preventing the interaction with gp120. MVC is only active against R5 strains of HIV-1 and is currently used in salvage therapy. The genetic diversity of the env C2V3C3 region of HIV-1 strains from injecting drug users in the Greater Lisbon was studied, along with the presence of natural genetic polymorphisms. 52 plasma samples were used and the amplification by RT-nested PCR of a 565 bp-product was possible in 35 of them. The phylogenetic analysis revealed 23 sequences classified as subtype B (probably including 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G and 1 F1. After translation, the presence of natural genetic polymorphisms was studied by comparison to a subtype B consensus. A high frequency of genetic polymorphisms was observed and significant “amino acid signatures” were found in association with non-B subtypes. A full characterization of the N-glycosylation sites was also performed and a coreceptor prediction (genotypic approach) was accomplished using the 11/25 and the V3 net charge rules and the programs PSSM and geno2pheno[coreceptor]. The number of N-glycosylation sites was generically preserved. Five sequences were defined as X4 or dual-tropic. Based on published data, a search for genetic polymorphisms, present in V3loop, associated to MVC resistance was finally undertaken. Several of such mutations were observed, being particularly interesting the presence of the patterns 11S+26V and 20F+25D+26V, in a total of 3 sequences, since these patterns have unequivocally been associated with MVC resistance in vivo. Although a resistance profile for MVC is not yet defined, the presence of these mutations in MVC-naïve populations may have significant impact in their clinical management in the future, especially considering the introduction of this drug in salvage therapy.

Avaliação da lesão genética induzida por exposição a radiação ionizante na população Portuguesa

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Análise genética de Salmonella typhimurium ferment adoras de lactose isoladas no Rio de Janeiro

Salmonella typhimurium fermentadoras de lactose são comuns em São Paulo, porém, raras no Rio de Janeiro, onde descrevemos dois isolamentos. Um plasmídeo de 7,4 megadáltons, não auto-transferível, termorresistente e não eliminável pelo alaranjado de acridinafoi identificado em cada uma das duas linhagens isoladas no Rio de Janeiro. O fato de uma dessas linhagens ser derivada de um plasmídeo que originalmente não expressa o caráter fermentação de lactose, permite-nos especular acerca da origem deste caráter nas Salmonellas brasileiras.

Diversidade genética e resistência aos anti-retrovirais inibidores enzimáticos de vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) de uma população de toxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa

Neste estudo procedeu-se à caracterização da diversidade genética das regiões codificantes da protease (PR), transcritase reversa (RT) e integrase (IN) do gene pol do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), bem como à pesquisa de polimorfismos genéticos associados à diminuição da susceptibilidade aos anti-retrovirais inibidores enzimáticos, circulante numa população de 51 indivíduos utilizadores de drogas por via endovenosa (IDUs) da Grande Lisboa. Em termos globais, a análise filogenética realizada com base em 38 sequências nucleotídicas concatenadas revelou que 12 (31,6%), 13 (34,2%) e 13 (34,2%) das sequências analisadas eram dos subtipos B, G/CRF14_BG e de formas genéticas não-B/não-G (1 F1, 4 CRF02_AG e 8 formas recombinantes únicas), respectivamente. Relativamente à pesquisa de mutações associadas a resistência (perfil genotípico), foram encontradas 15, presentes em 50,0% (22/44) dos indivíduos, com uma distribuição de 1-3/indivíduo (4, todas acessórias, na PR; 6 na RT; 5 na IN, uma principal e 4 acessórias). Todavia, apenas 26,7% (4/15) dessas mutações conferiam uma expressão fenotípica de resistência a uma das classes de inibidores (da RT ou IN), em 9,1% (4/44) dos indivíduos. Foi ainda observada uma elevada frequência de outros polimorfismos genéticos, mais frequentes em subtipos não-B, alguns dos quais considerados assinaturas de subtipo. A homologia genética total ou parcial com os subtipos B e G, reconhecida neste estudo, reflectirá a sua predominância na população de IDUs. Este resultado sugere também que a epidemia de HIV-1 em Portugal poderá estar a evoluir para um padrão epidemiológico singular, no qual os subtipos B, G e suas formas recombinantes predominam. A proporção observada de indivíduos portadores de vírus com mutações associadas a resistência, mesmo em indivíduos naive relativamente à terapêutica, indica que a sua transmissão se encontra em curso entre a população de IDUs, tendo, certamente, um impacto relevante ao nível da abordagem terapêutica e monitorização da infecção.

Estimativa de parâmetros genéticos, correlações fenotípicas e ambientais no girassol do cerrado do Distrito Federal.

RESUMO: O propósito deste trabalho foi avaliar a estima - tiva de parâmetros genéticos, correlações fe - notipicas e ambientais no girassol do Cerrado do Distrito Federal. Os caracteres analisados foram: rendimento de grãos, tamanho do ca - pítulo, peso de mil aquênios, altura de plantas e dias para floração inicial. Foram constatadas diferenças altamente significativas entre os ge - nótipos para todas as características morfoa - gronômicas avaliadas. Para o coeficiente CVr a maioria dos valores foram superior a 1 nos dois anos considerados, indicando que para a maioria dos caracteres aferidos há a possibi - lidade de êxito na seleção fenotípica uma vez que a variância genética superou a ambiental. Na herdabilidade, a maior estimativa verifica - da foi para o caráter PMA (98,76%) em 2013 e para DFI (99,68%) em 2014. Foram cons - tatadas diferenças altamente significativas en - tre os genótipos para todas as características morfoagronômicas avaliadas. O alto coeficiente de variação genético destaca a possibilidade de obter ganhos genéticos para todas as caracte - rísticas analisadas salvo em tamanho de capi - tulo. Materiais genéticos com potencial para as características agronômicas pesquisadas foram identificados no trabalho, podem ser indicadas ao sistema de produção irrigado no Cerrado. abstract: The purpose of this study was to estimate ge - netic parameters, phenotypic and environmen - tal correlations in sunflower of Brazilian savan - nah. The characters analyzed were: grain yield, chapter length, weight of a thousand achenes, plant height and days to start flowering. Hi - ghly significant differences were observed among genotypes for all morphoagronomic cha - racteristics evaluated. For the most CVr coe - fficient values were higher than 1 in the two years under consideration, indicating that for the majority of measured characters there is the possibility of successful phenotypic selection once the genetic variance exceeded the envi - ronmental. The heritability estimate was the hi - ghest for the PMA character (98,76%) in 2013 and DFI (99,68%) in 2014. Highly significant differences were observed among genotypes for all morphoagronomic characteristics evalu - ated. The high coefficient of genetic variation show the possibility of obtaining genetic gain for all examined characteristics except in chap - ter length. Genetic material with potential for the researched agronomic characteristics were identified in the work, can be indicated to the irrigated production system in the Brazilian sa - vannah.

Avaliação do ciclo de vida do sistema de produção soja-girassol no cerrado Brasileiro.

RESUMO: O girassol é uma importante cultura na região de Parecis, no Cerrado brasileiro. Em 2014, a região respondeu pela produção de 232.700 t de grãos, 45% da produção nacional. A produção de girassol provém principalmente de um sistema que tem a soja como cultura principal. A associação entre soja e girassol pode reduzir impactos ambientais devido ao uso compartilhado de recursos. Este estudo desenvolveu uma Avaliação de Ciclo de Vida (ACV) ?do berço ao túmulo? do sistema de produção soja-girassol usado na região de Parecis e comparou seu perfil ambiental ao das monoculturas de soja e girassol. Impactos relacionados ao uso do solo (emissões da mudança de uso da terra e calagem) por cada cultura foram alocados em função do tempo de ocupação do solo. O sistema soja-girassol teve impactos ambientais menores em todas as categorias de impacto quando comparado à monocultura de soja e girassol, com o mesmo rendimento. Reduções importantes foram observadas em ?Mudança do Clima?, ?Acidificação Terrestre? e ?Formação de Material Particulado?. ABSTRACT: Sunflower is an important crop in Parecis region of the Brazilian Cerrado. In 2014 the region accounted for the production of 232,700 tons of sunflower grain, 45% of national production. Sunflower production comes mostly from a system that has soybean as the main crop. The association of soybean and sunflower can reduce environmental impacts due to shared use of resources. This study performed a ?cradle to gate? Life Cycle Assessment (LCA) of the soybean-sunflower production system used in Parecis region and compared its environmental profile to that of the monoculture of these two crops. Impacts related to the use of soil (land use change emissions and liming) by each crop were evaluated according to time of soil occupation criterion. Soybean-sunflower system had lower environmental impacts on every impact category comparing to soybean and sunflower monoculture with the same yield. Important reduction were observed on ?Climate change?, ?Terrestrial acidification? and ?Particulate matter formation? categories.

O impacto do El Niño em alguns aspectos da cultura da soja: ferrugem-asiática [e] manejo de plantas daninhas.

2016

Efeito da adição de metabólitos secundários em componentes de produção de soja, inoculada com Bradyrhizobium e coinoculada com Azospirillum.

A eficiência da fixação biológica de nitrogênio (FBN) em soja (Glycine max) tem possibilitado altos rendimentos de grãos à cultura, sem a necessidade de aplicação do fertilizante nitrogenado. Devido à importância desse processo biológico para a cultura da soja, o emprego de técnicas que possam garantir os benefícios da FBN torna-se necessário. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência de metabólitos secundários (Fatores Nod, oligossacarídeos lipoquitínicos) nos componentes de produção em soja inoculada com Bradyrhizobium e coinoculada com Azospirillum. Foi conduzido um experimento a campo na Embrapa Soja, Londrina, PR (23°12' S e 51°11' W, altitude de 585 m e clima Cfa, segundo Köppen), durante a safra 2013/2014. O delineamento foi em blocos casualizados, com seis repetições. Os tratamentos foram: T1 ? Controle (sem inoculação - SI e sem N); T2 ? Controle nitrogenado (SI e com N: 100 kg ha-1 na semeadura e 100 kg ha-1 no florescimento); T3 ? Inoculado com Bradyrhizobium; T4 ? Coinoculação (Bradyrhizobium + Azospirillum); T5 ? Coinoculação + Fatores Nod; T6 ? Inoculado com Bradyrhizobium + Fatores Nod. Ao final do ciclo da cultura, avaliou-se a altura de plantas (AP), o número de vagens por planta (NVP), o número de grãos por planta (NGP) e o peso de 100 grãos (PCG). Todas as variáveis analisadas apresentaram diferenças significativas pelo teste de Tukey (p < 0,05). O T2 apresentou maior AP (média de 90 cm), apenas em relação ao T4 (média de 74 cm), sem diferir estatisticamente dos demais tratamentos. Os maiores valores médios de NVP foram encontrados no T3 (102 cm) e no T6 (95 cm), diferindo apenas do T2. O T4 e o T6 apresentaram as maiores médias de NGP, sendo 10% maior que no T3, mas diferindo apenas do T1. A maior média de PCG foi observada no T2 (13,6 g), que não diferiu estatisticamente dos T5 (com 13,3 g) e T6 (com 13,2 g). A adição dos metabólitos secundários aumentou o NGP e PCG, em relação ao T3. Além disso, a coinoculação com Azospirillum promoveu aumento do NGP. Dessa forma, a utilização dessas estratégias pode ser benéfica para FBN e, por consequência, elevar a produtividade.

Inibição da nodulação por N-mineral em soja.

Apesar da indicação da pesquisa de que a inoculação adequada com bactérias do gênero Bradyrhizobium é suficiente para suprir a demanda de N pela cultura da soja pela fixação biológica de nitrogênio (FBN), alguns agricultores ainda têm feito o uso de N mineral. Entretanto, a adubação nitrogenada aumenta os custos de produção, apresenta riscos de danos ambientais, e pode reduzir a nodulação e a eficiência da FBN. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de doses crescentes de N mineral na nodulação da soja. Utilizaram-se duas cultivares de soja: BMX Potência e BRS 360, inoculadas com Bradyrhizobium no momento da semeadura. Os tratamentos compreenderam 0, 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100 e 125 mg de N vaso-1, em seis repetições. Para cada cultivar, um experimento foi conduzido simultaneamente, em delineamento inteiramente casualizado, em vasos de Leonard contendo solução nutritiva de Hoagland desprovida de N, fazendo-se a sua complementação, sem troca, sempre que necessário. As doses de N foram aplicadas a cada seis dias na solução nutritiva, totalizando 5 aplicações até 30 dias. Aos 35 dias após a emergência (DAE), no florescimento das plantas, foi realizada a desinstalação do experimento, com a contagem dos nódulos (NN) e obtenção da massa de nódulos secos (MNS) da região da coroa e das raízes secundárias, separadamente. Para a cultivar BMX Potência, o NN se manteve estável, tanto na região da coroa quanto nas raízes secundárias, até a dose 50 mg de N vaso-1, mas houve decréscimo acentuado com o aumento das doses, chegando à inibição quase total em 125 mg de N vaso-1. No entanto, a MNS apresentou redução linear com o aumento das doses de N. Para a cultivar BRS 360, o aumento da dose de N reduziu o NN e a MNS, tanto na região da coroa quanto nas raízes secundárias. A adubação nitrogenada reduz a contagem de nódulos, mas o efeito mais evidente se dá na massa de nódulos da região da coroa e da nodulação secundária. Sugere-se a massa de nódulos seja empregada como característica mais sensível à avaliação de efeitos negativos à nodulação, como o emprego de fertilizante nitrogenado, do que o número de nódulos.

Densidades e cultivares de soja RR em dois anos de plantio para o Sul de Minas Gerais.

Objetivou-se identificar as melhores populações de plantas de soja de três principais cultivares recém-lançadas para fins de recomendação aos produtores do sul de Minas Gerais. Por dois anos avaliou-se as cultivares BRSMG 760SRR, BRSMG 780RR e BRSMG 820RR, submetidas às populações 100.000, 200.000, 300.000 e 400.000 plantas por hectare, utilizando-se blocos casualizados com três repetições. Determinou-se altura de plantas e de inserção de 1° legume, índice de acamamento, n° de legumes por planta, n° de grãos por legume, peso de 100 grãos e rendimento de grãos. A cultivar BRSMG 760SRR mostrou-se superior apresentando o máximo rendimento de grãos (4.973kg ha-1) com 269.000 plantas ha-1. As demais cultivares não sofreram influência da variação populacional, podendo ser cultivadas com 200.000 plantas ha.

Densidades de plantio e cultivares de soja convencionais para a região Sul de MG, safra 2013/14.

Objetivou-se identificar a melhor população de plantas (100.000 a 400.000 plantas ha-1) para 3 cultivares de soja convencional (BRSMG 752S; BRSMG 772S; BRSMG 810C), visando semeadura para região Sul de Minas Gerais. A cv BRSMG 772S apresentou máxima produtividade quando conduzida com 284.000 plantas ha-1, podendo ser cultivada entre 200.000 a 400.000 plantas ha-1. A variação na população de plantas não alterou o rendimento e a maioria dos caracteres agronômicos para as cultivares BRSMG 752S e BRSMG 810C, podendo as mesmas serem utilizadas com ampla faixa de população.

Caracterização de duas cultivares de soja RR para cultivo no Sul de Minas Gerais.

Avaliou-se duas cultivares de soja transgênicas RR (BRSMG 780RR e BRSMG 820RR) oriundas do Programa de Melhoramento Genético de Soja para o estado de Minas Gerais, convênio Embrapa/Epamig/Fundação Triângulo, submetidas à quatro populações de plantas (100.000, 200.000, 300.000 e 400.000 plantas ha-1). Utilizou se o delineamento de blocos casualizados com três repetições, determinando-se altura de plantas e de inserção de 1° legume, índice de acamamento, n° de legumes por planta, n° de grãos por legume, peso de 100 grãos e rendimento de grãos. As cultivares BRSMG 780RR e BRSMG 820RR mostraram alta plasticidade à medida que a variação na população de plantas alterou somente os índices de acamamento de plantas. No entanto, recomenda-se estudos por mais de um ano agrícola.

Caracterização de cultivares de soja em diversas densidades de plantio para o Estado de Minas Gerais.

Objetivou-se identificar as melhores populações de plantas de soja de cultivares recém lançadas, para fins de recomendação aos produtores do sul de Minas Gerais. Selecionou-se 3 cultivares convencionais e 3 transgênicas RR, semeadas em 4 populações de plantas. As cultivares transgênicas se mostraram altamente produtivas, não tendo a população de plantas alterado o rendimento de grãos. Para ambos os ensaios as maiores alturas de inserção do 1° legume foram obtidas com as maiores populações de plantas.