I. The structure and properties of closed circular duplex DNA. II. Chemically interacting systems at equilibrium in a buoyant density gradient

I. The binding of the intercalating dye ethidium bromide to closed circular SV 40 DNA causes an unwinding of the duplex structure and a simultaneous and quantitatively equivalent unwinding of the superhelices. The buoyant densities and sedimentation velocities of both intact (I) and singly nicked (II) SV 40 DNAs were measured as a function of free dye concentration. The buoyant density data were used to determine the binding isotherms over a dye concentration range extending from 0 to 600 µg/m1 in 5.8 M CsCl. At high dye concentrations all of the binding sites in II, but not in I, are saturated. At free dye concentrations less than 5.4 µg/ml, I has a greater affinity for dye than II. At a critical amount of dye bound I and II have equal affinities, and at higher dye concentration I has a lower affinity than II. The number of superhelical turns, τ, present in I is calculated at each dye concentration using Fuller and Waring's (1964) estimate of the angle of duplex unwinding per intercalation. The results reveal that SV 40 DNA I contains about -13 superhelical turns in concentrated salt solutions.

The free energy of superhelix formation is calculated as a function of τ from a consideration of the effect of the superhelical turns upon the binding isotherm of ethidium bromide to SV 40 DNA I. The value of the free energy is about 100 kcal/mole DNA in the native molecule. The free energy estimates are used to calculate the pitch and radius of the superhelix as a function of the number of superhelical turns. The pitch and radius of the native I superhelix are 430 Å and 135 Å, respectively.

A buoyant density method for the isolation and detection of closed circular DNA is described. The method is based upon the reduced binding of the intercalating dye, ethidium bromide, by closed circular DNA. In an application of this method it is found that HeLa cells contain in addition to closed circular mitochondrial DNA of mean length 4.81 microns, a heterogeneous group of smaller DNA molecules which vary in size from 0.2 to 3.5 microns and a paucidisperse group of multiples of the mitochondrial length.

II. The general theory is presented for the sedimentation equilibrium of a macromolecule in a concentrated binary solvent in the presence of an additional reacting small molecule. Equations are derived for the calculation of the buoyant density of the complex and for the determination of the binding isotherm of the reagent to the macrospecies. The standard buoyant density, a thermodynamic function, is defined and the density gradients which characterize the four component system are derived. The theory is applied to the specific cases of the binding of ethidium bromide to SV 40 DNA and of the binding of mercury and silver to DNA.

Production of positive controls for calcivirus-specific PCR using recombinant baculiovirus technology

Recent advances in our knowledge of the genetic structure of human caliciviruses (HuCVs) and small round-structured viruses (SRSVs) have led to the development of polymerase chain reaction (PCR)-based molecular tests specific for these viruses. These methods have been developed to detect a number of human pathogenic viruses in environmental samples including water, sewage and shellfish. HuCVs and SRSVs are not culturable, and no animal model is currently available. Therefore there is no convenient method of preparing viruses for study or for reagent production. One problem facing those attempting to use PCR-based methods for the detection of HuCVs and SRSVs is the lack of a suitable positive control substrate. This is particularly important when screening complex samples in which the levels of inhibitors present may significantly interfere with amplificiation. Regions within the RNA polymerase regions of two genetically distinct human caliciviruses have been amplified and used to produce recombinant baculoviruses which express RNA corresponding to the calicivirus polymerase. This RNA is being investigated as a positive control substrate for PCR testing, using current diagnostic primer sets. Recombinant baculovirus technology will enable efficient and cost-effective production of large quantities of positive control RNA with a specific known genotype. We consider the development of these systems as essential for successful screening and monitoring applications.

A atividade da pterocarpanoquinona LQB 118 in vitro e in vivo em Leishmania braziliensis

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Portanto tornam-se importantes estudos que conduzam ao desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade da pterocarpanoquinona denominada LQB118 sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos. Para avaliar o modo ação in vitro foi investigada a indução de apoptose usando marcação por TUNEL e Anexina V-FITC. O efeito sobre a modulação da ativação de macrófagos murinos foi analisada pela dosagem de óxido nítrico (reagente de Griess) e de citocinas IL-12, TNF-alfa e IL-10 (por ELISA) nos sobrenadantes de macrófagos. In vivo a atividade terapêutica da LQB 118 foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com a LQB118 pelas vias intralesional (100M/3x/semana) ou oral (0,5mg/5x/semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas. A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A ação da LQB118 in vitro foi dose-dependente tanto na forma promastigota inibindo 45%, 64,7% e 99,95%, quanto nas amastigotas intracelulares 22%, 72% e 81% nas concentrações de 5M, 10M e 20M, respectivamente para ambas as formas evolutivas. A LQB118 foi capaz de induzir a externalização de fosfatidilserina em promastigotas (18,57% das células incubadas por 24 h e em 25,79% de células tratadas por 48h) e também promoveu aumento da fluorescência nas duas formas evolutivas da Leishmania quando comparadas aos controles, demonstrando a indução de fragmentação do DNA do parasito. Esta substância também foi capaz de modular a resposta dos macrófagos infectados por 24 horas aumentando de forma dose-dependente a IL-12 e NO, mantendo constante TNF-α. In vivo, na sétima semana de tratamento, observamos uma redução significativa do tamanho das lesões nos animais tratados com LQB 118 intralesional (p<0, 001) e no grupo tratado pela via oral (p<0,05) quando comparado com o controle. Estes resultados demonstram que a atividade anti-Leishmania da LQB118 é direta sobre o parasito pela indução de morte por apoptose, apresentando também uma ação moduladora da resposta dos macrófagos contribuindo para ação leishmanicida, sem alterar a morfologia da célula hospedeira e que a LQB 118 apresenta uma atividade terapêutica no modelo hamster e pode ser uma importante molécula para o desenvolvimento de um novo fármaco.

Biomolecule storage on non-modified thermoplastic microfluidic chip by ink-jet printing of ionogels

[EN] This paper reports an innovative technique for reagents storage in microfluidic devices by means of a one-step UV-photoprintable ionogel-based microarray on non-modified polymeric substrates. Although the ionogel and the ink-jet printing technology are well published, this is the first study where both are used for long-term reagent storage in lab-on-a-chip devices. This technology for reagent storage is perfectly compatible with mass production fabrication processes since pre-treatment of the device substrate is not necessary and inkjet printing allows for an efficient reagent deposition process. The functionality of this microarray is demonstrated by testing the release of biotin-647 after being stored for 1 month at room temperature. Analysis of the fluorescence of the ionogel-based microarray that contains biotin-647 demonstrated that 90% of the biotin-647 present was released from the ionogel-based microarray after pumping PBS 0.1% Tween at 37 °C. Moreover, the activity of biotin-647 after being released from the ionogel-based microarray was investigated trough the binding capability of this biotin to a microcontact printed chip surface with avidin. These findings pave the way for a novel, one-step, cheap and mass production on-chip reagents storage method applicable to other reagents such as antibodies and proteins and enzymes.

Remediação de solos e lençóis freáticos em postos de gasolina via processo de fenton: estudo de caso

Alguns cientistas ambientais prevêem que a poluição dos solos será um dos maiores legados com grandes impactos para as gerações futuras, pois atualmente ainda existe desconhecimento das fontes poluidoras e da sua extensão. O Brasil, devido a sua extensão territorial, suas bacias hidrográficas, número de postos de abastecimentos e controles ambientais ainda ineficazes, está muito exposto a esse tipo de poluição. Atualmente, há no Brasil mais de 34.300 postos de combustíveis, com volume de 65.000.000 m3 de gasolina e diesel consumidos anualmente, conforme dados da Agência Nacional do Petróleo Gás Natural e Biocombustíveis , ANP, em 2008. Sendo assim, a exposição e contaminação dos solos e dos lençóis freáticos com constituintes aromáticos do diesel e gasolina torna-se um sério problema ambiental. Dentro deste grupo, encontram-se o benzeno, tolueno, xileno, conhecido como BTEX e os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, conhecido como PAH. Este trabalho tem como objetivo estudar a remediação in-situ de um posto de combustíveis na região do ABC Paulista, no Estado de São Paulo. Aplicando-se a técnica de Processo Oxidativo Avançado via reagente de Fenton (H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + OH . ), o radical hidroxila gerado mineraliza compostos aromáticos, decompondo-os definitivamente. Amostras de água do posto em estudo apresentavam elevados teores de BTEX e PAH, 2,58 mg.L-1 e 0,298 mg.L-1 respectivamente, estando em níveis não tolerados pelo órgão ambiental paulista CETESB sendo necessária a intervenção para tratamento da área. Com os níveis de poluentes e o perfil hidrogeológico identificados, a remediação foi iniciada com injeções no solo de peróxido de hidrogênio a 8%v.v, FeSO4 a 0,40 mg.L-1 e solução à base de NPK (nitrogênio, fósforo e nitrogênio) a 100 mg.L-1 como nutrientes para os microorganismos do solo. Estes valores são provenientes de experimentos anteriores e tratamentos já realizados. Foram conduzidas campanhas de injeção trimestrais com 100 litros desta solução completa como reagente , e medições trimestrais de BTEX, PAH e outros parâmetros de controle, que foram indicando o sucesso do tratamento. Após 18 meses o local foi considerado tratado pelo órgão ambiental, onde monitoramentos semestrais estão em continuidade para garantir o resultado do tratamento e das ações corretivas. Assim, o estudo real da remediação de solos contaminados com os poluentes orgânicos via processo de Fenton, com concentração de H2O2 a 8%v/v, e FeSO4 a 0,40 mg.L-1 demonstrou-se uma técnica de sucesso. O entendimento dos resultados da remediação, mesmo sujeitos aos fenômenos naturais, como intempéries e chuvas, é uma experiência grande, pois por mais reais que simulações em laboratório possam ser, é muito difícil incluir nestes sistemas, as variações que um tratamento real está exposto

掺铒磷酸盐玻璃反应气氛法除水的研究

制备了不同含水量的掺铒磷酸盐玻璃，研究了各种工艺参数对反应气氛法除水效果的影响。结果表明由鼓泡气体带入的除水剂是玻璃除水的主要动力；在通气最初阶段的除水速率最快，并且提高除水温度、增大通气流量均有助于提高除水效率；结合实验从反应热力学角度讨论了除水机理，并指出在玻璃熔体中除水反应受熔体“笼效应”影响，反应速率大小取决于OH与CCl4形成偶遇对概率的大小。

Investigations on bismuth and aluminum co-doped germanium oxide glasses for ultra-broadband optical amplification

The broadband luminescence covering 1.2-1.6 mu m was observed from bismuth and aluminum co-doped germanium oxide glasses pumped by 808 nm laser at room temperature. The spectroscopic properties of GeO2:Bi,Al glasses strongly depend on the glass compositions and the pumping sources. To a certain extent, the Al3+ ions play as dispersing reagent for the infrared-emission centers in the GeO2:Bi,Al glasses. The broad infrared luminescence with a full width at half maximum larger than 200 nm and a lifetime longer than 200 mu s possesses these glasses with the potential applications in broadly tunable laser sources and ultra-broadband fiber amplifiers in optical communication field. (c) 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

Avaliação da trealose como crioprotetor natural de células-tronco hematopoiéticas de sangue de cordão umbilical e placentário

O sangue do cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido usado como fonte de células-tronco hematopoiéticas (CTH) para reconstituir a função medular (hematopoiese). A maioria das vezes, esta modalidade de transplante requer a criopreservação das CTH, que permanecem congeladas até uma possível utilização futura. Na criopreservação de CTH, o reagente químico dimetilsulfóxido (DMSO) tem sido utilizado como um crioprotetor. No entanto, tem sido provado que DMSO tem efeitos tóxicos para o corpo humano. Muitos organismos na natureza possuem uma capacidade de sobreviver ao congelamento e à desidratação acumulando dissacarídeos, como a trealose e sacarose, por isso a trealose, tem sido investigada como um crioprotetor alternativo para diversos tipos celulares. Outro dano muito comum durante o congelamento é a formação de espécie reativas de oxigênio (ERO) que diminui a viabilidade celular, por isso a adição de bioantioxidantes na solução de criopreservação das células é passo muito importante. Este estudo foi dividido em duas fases na primeira foram avaliados os resultados obtidos com a adição de antioxidantes na solução de criopreservação das células de SCUP e na segunda fase avaliou-se a hipótese que a solução de criopreservação contendo trealose intracelular e extracelular melhora a recuperação e a viabilidade das células-tronco do SCUP, após a criopreservação. SCUP foi processado e submetido à criopreservação em soluções contendo na primeira fase: soluções com diferentes concentrações de DMSO (10%, 5% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (5%, 2,5%) com um dos dissacarídeos (60mmol/L) e ácido ascórbico e/ou catalase (10mg/mL); e na segunda fase: soluções contendo diferentes concentrações de DMSO (10% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (2,5%) com trealose intra (a trealose foi introduzida na célula por meio de lipossomas) e extracelular e soluções contendo trealose intra e extracelular sem DMSO, armazenados por duas semanas em N2L, e descongeladas. As células descongeladas foram avaliadas por citometria de fluxo, pelo ensaio metabólico pelo MTT e de unidades formadoras de colônias (UFC). Na primeira fase do estudo, a catalase, melhorou a preservação das células CD34+ e CD123+, a UFC e a viabilidade celular, em comparação com a solução padrão de criopreservação. Já na segunda fase do estudo, após as análises de todos os testes vimos que a solução que continha trealose intra/extracelular e DMSO mostrou uma capacidade de manutenção da viabilidade/integridade celular superior a todas as outras testadas. A solução que continha trealose intra e extracelular sem DMSO, obteve um resultado comparável com seu controle (2,5%DMSO), porém quando avaliamos a solução que continha apenas trealose intracelular não obtivemos resultados satisfatórios. A catalase pode atuar sobre a redução dos níveis ERO na solução de criopreservação das CTH de SCUP, diminuindo os danos por ele causados e a trealose deve estar presente em ambos os lados das células durante o processo de congelamento. Portanto, em testes clínicos futuros, ela poderá ser um potencial crioprotetor das células-tronco de SCUP, podendo substituir totalmente o DMSO da solução de criopreservação, minimizando com os efeitos colaterais provenientes da infusão de produtos criopreservados nos pacientes.

DLK1 and DLK2 characterization in mouse salivary gland development

103 p.; 102 p.

Atividade do flavonóide quercetina em Leishmania braziliensis usando hamster como modelo de infecção

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Estudos prévios mostraram que o flavonóide quercetina tem ação terapêutica pela via oral em camundongos infectados com L. amazonensis. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade do flavonóide quercetina sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário da quercetina foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos e hamsters. O efeito da quercetina sobre macrófagos foi avaliado pela dosagem de óxido nítrico pelo método de Griess nos sobrenadantes das culturas e espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular através do H2DCFDA. In vivo a atividade terapêutica da quercetina foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com quercetina pela via oral (2mg/ 5X / semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas.A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A quercetina não apresentou atividade sobre o crescimento de promastigotas em cultura em nenhuma das concentrações testadas. Em amastigotas intracelulares quercetina apresentou ação dose dependente em macrófagos de camundongos e hamsters inibindo 45% e 54% e 25% e 48 %, respectivamente nas concentrações de 50 e 100g/ml após 48h de tratamento. O pré - tratamento dos macrófagos de camundongos e hamsters com quercetina foi capaz de inibir o crescimento de amastigotas intracelulares em 57, 58 e 74% e 49, 50, e 58% respectivamente, nas concentrações de 25, 50 e 100 g/ml, apresentado ação inibitória significativa em todas as concentrações testadas. Não houve alteração na produção de NO pelos macrófagos, entretanto macrófagos pré tratados com a quercetina por 24 horas antes da infecção apresentaram um aumento significativo na produção de EROs, quando comparados aos controles. Macrófagos tratados antes e depois da infecção, apresentaram diminuição da produção de EROs. In vivo, a quercetina foi capaz de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado ( P< 0,05). Os animais tratados com quercetina apresentaram maior resposta intradérmica aos antígenos de L. braziliensis. Esses dados mostram que a quercetina tem atividade sobre L. braziliensis, inibindo amastigotas intracelulares in vitro e sendo capaz de controlar o tamanho das lesões em hamsters infectados quando administrada pela via oral.

Investigação da atividade toxicológica de análogos de estatinas em modelos experimentais in vitro

As estatinas são fármacos inibidores competitivos da enzima hidroxi-3-metil-glutaril Coenzima A (HMGCoA) redutase, amplamente utilizados para o controle da hipercolesterolemia total e, em especial, para a redução dos níveis séricos de LDLc (Low Density Lipoprotein cholesterol). Além do efeito primário, esses fármacos apresentam vários efeitos secundários, chamados de efeitos pleiotrópicos, envolvendo atividade anti-inflamatória, antitumoral e antiparasitária. Para o desenvolvimento de inovações na área de química medicinal é imprescindível avaliar o risco de efeitos adversos para saúde ou, em outras palavras, a segurança terapêutica do novo produto nas condições propostas de uso. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi investigar a genotoxicidade de quatro análogos inibidores da biossíntese de lipídios, da classe das estatinas, em modelos experimentais in vitro, testados previamente contra o clone W2 de Plasmodium falciparum a fim de se obter o IC50 dessas moléculas frente ao patógeno. Foram desenvolvidas quatro novas moléculas (PCSR02.001, PCSR09.001, PCSR08.002 e PCSR10.002). Para a avaliação da toxicidade, foram realizados o teste de mutagenicidade bacteriana (teste de Ames), o ensaio de viabilidade celular utilizando o reagente WST-1 e o ensaio de indução de micronúcleos, ambos utilizando uma linhagem ovariana (CHO-K1) e uma linhagem hepática (HepG2). Levando em conta o fato de nenhuma das amostras ter induzido efeitos mutagênicos nas linhagens de S. enterica sorovar Typhimurium, e PCSR10.002 ter apresentado citotoxicidade sugere-se então que este composto seja o mais tóxico. Comparativamente, PCSR10.002 foi mais genotóxico e citotóxico para a linhagem CHO-K1 do que para a linhagem HepG2. PCSR02.001 apresentou elevado potencial genotóxico para células ovarianas, mas não foi capaz de induzir a formação de micronúcleos em células hepáticas, apresentando, portanto um perfil similar ao observado em PCSR10.002. Assim como a atorvastatina, PCSR09.001 apresentou elevado potencial pró-apoptótico para a linhagem de hepatócitos. Já PCSR08.002, apresentou aumento na apoptose de CHO-K1. A indução de apoptose não é necessariamente um evento negativo, já que é pouco lesiva e responsável pela eliminação de células danificadas. Porém, as respostas de apoptose induzidas por esse composto foram muito inferiores àquelas induzidas pela atorvastatina (cerca de 4 vezes menor que a atorvastatina). PCSR08.002 foi aquele se mostrou menos tóxico e essa amostra foi a que teve menor risco relativo, em uma análise global das respostas de citotoxicidade e não demonstrou ter potencial genotóxico para as linhagens utilizadas nesse estudo. Conclui-se, portanto, que a análise da atividade toxicológica utilizando modelos experimentais in vitro dessas estatinas constitui um importante passo para o estabelecimento de novos candidatos à fármacos com maior segurança.

Estudo da formação de sub-produtos da degradação de clorobenzeno e 1,2-dicloroetano a partir da reação com reagente de Fenton em solução aquosa utilizando diferentes fontes de ferro

Poluições da água e do solo são duas das cinco categorias básicas de poluição ambiental. As outras três são do ar, ruído e luz. Poluição ocorre quando um material/produto químico é adicionado ao meio ambiente afetando-o adversamente. Uma vez que a poluição existe, retornar a matriz impactada para o seu estado anteriormente não poluído torna-se muito difícil ou até mesmo impossível em alguns casos. Os compostos organoclorados (OC) representam um importante grupo de poluentes orgânicos persistentes (POP), devido à sua toxicidade e elevada persistência no ambiente. Diferentes técnicas de remediação de solo e água subterrânea têm sido desenvolvidas com o objetivo de reparar as áreas contaminadas em menor tempo e custo possíveis e, assim, a oxidação química in situ tem se mostrado uma técnica cada vez mais atraente devido sua simplicidade e baixo custo. A degradação de dois compostos organoclorados via oxidação química por reagente de Fenton em solução aquosa é o objeto do presente trabalho. Para tanto, foram selecionados dois compostos, sendo um alifático e outro aromático. Assim, foram avaliadas as condições de degradação dos compostos organoclorados em relação às concentrações do oxidante em diferentes tempos reacionais, diferentes fontes de catalisador e, de forma qualitativa, quais foram os principais subprodutos formados. Os ensaios oxidativos foram realizados em meio aquoso com temperatura controlada a 25 C e em 3 configurações de [Fe2+] e [H2O2]. A extração dos compostos de interesse para a fase orgânica também foi estudada. A análise dos extratos revelou que o acetato de etila foi o solvente que melhor extraiu os compostos de interesse da fase aquosa. Além destes ensaios, foram avaliadas outras duas fontes de Fe(II), sendo 11 óxidos de manganês dopados com ferro e a classe de solo predominante no território nacional, que é caracterizada pela sua alta concentração de ferro endógeno (latossolo). O ensaio entre as fontes de ferro revelou que tanto o óxido de Mn quanto o latossolo produziram menos subprodutos em relação à reação com a solução de sulfato Fe(II). Entretanto, em termos quantitativos, a redução na concentração de clorobenzeno foi mais efetiva na reação com a solução de Fe(II) (cerca de 63%). A identificação dos sobprodutos foi realizada a partir da análise em cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas e em análise comparativa dos espectros com a biblioteca NIST. Os ensaios oxidativos revelaram que em baixas concentrações de oxidante, há a possibilidade de geração de subprodutos mais tóxicos que os reagentes, sendo produzido bifenilas policloradas e hexaclorociclohexano nas reações com clorobenzeno e 1,2-dicloroetano, respectivamente

Saline-saturated DMSO-EDTA as a storage medium for microbial DNA analysis from coral mucus swab samples

The mucus surface layer of corals plays a number of integral roles in their overall health and fitness. This mucopolysaccharide coating serves as vehicle to capture food, a protective barrier against physical invasions and trauma, and serves as a medium to host a community of microorganisms distinct from the surrounding seawater. In healthy corals the associated microbial communities are known to provide antibiotics that contribute to the coral’s innate immunity and function metabolic activities such as biogeochemical cycling. Culture-dependent (Ducklow and Mitchell, 1979; Ritchie, 2006) and culture-independent methods (Rohwer, et al., 2001; Rohwer et al., 2002; Sekar et al., 2006; Hansson et al., 2009; Kellogg et al., 2009) have shown that coral mucus-associated microbial communities can change with changes in the environment and health condition of the coral. These changes may suggest that changes in the microbial associates not only reflect health status but also may assist corals in acclimating to changing environmental conditions. With the increasing availability of molecular biology tools, culture-independent methods are being used more frequently for evaluating the health of the animal host. Although culture-independent methods are able to provide more in-depth insights into the constituents of the coral surface mucus layer’s microbial community, their reliability and reproducibility rely on the initial sample collection maintaining sample integrity. In general, a sample of mucus is collected from a coral colony, either by sterile syringe or swab method (Woodley, et al., 2008), and immediately placed in a cryovial. In the case of a syringe sample, the mucus is decanted into the cryovial and the sealed tube is immediately flash-frozen in a liquid nitrogen vapor shipper (a.k.a., dry shipper). Swabs with mucus are placed in a cryovial, and the end of the swab is broken off before sealing and placing the vial in the dry shipper. The samples are then sent to a laboratory for analysis. After the initial collection and preservation of the sample, the duration of the sample voyage to a recipient laboratory is often another critical part of the sampling process, as unanticipated delays may exceed the length of time a dry shipper can remain cold, or mishandling of the shipper can cause it to exhaust prematurely. In remote areas, service by international shipping companies may be non-existent, which requires the use of an alternative preservation medium. Other methods for preserving environmental samples for microbial DNA analysis include drying on various matrices (DNA cards, swabs), or placing samples in liquid preservatives (e.g., chloroform/phenol/isoamyl alcohol, TRIzol reagent, ethanol). These methodologies eliminate the need for cold storage, however, they add expense and permitting requirements for hazardous liquid components, and the retrieval of intact microbial DNA often can be inconsistent (Dawson, et al., 1998; Rissanen et al., 2010). A method to preserve coral mucus samples without cold storage or use of hazardous solvents, while maintaining microbial DNA integrity, would be an invaluable tool for coral biologists, especially those in remote areas. Saline-saturated dimethylsulfoxide-ethylenediaminetetraacetic acid (20% DMSO-0.25M EDTA, pH 8.0), or SSDE, is a solution that has been reported to be a means of storing tissue of marine invertebrates at ambient temperatures without significant loss of nucleic acid integrity (Dawson et al., 1998, Concepcion et al., 2007). While this methodology would be a facile and inexpensive way to transport coral tissue samples, it is unclear whether the coral microbiota DNA would be adversely affected by this storage medium either by degradation of the DNA, or a bias in the DNA recovered during the extraction process created by variations in extraction efficiencies among the various community members. Tests to determine the efficacy of SSDE as an ambient temperature storage medium for coral mucus samples are presented here.

Marine bacteria as indicators of upwelling in the Sea

The “oxidase reaction” (using p-amino-dimethyl-aniline oxalate as the reagent) has been used to distinguish oxidase-negative from oxidase-positive bacteria from the sea, when grown on membrane filters. By this means, it has been shown (a) that under conditions of stable stratification of the sea as in the tropics, a relationship exists between the percentage incidence of oxidase negative bacteria in the flora and the depth of the water; (b) that the maximum value for this percentage incidence (100) is reached at or immediately below the upper limit of the oxygen minimum layer; (c) that this percentage value (expressed as Oxⁿvalues) may be used to demonstrate the movements of water masses during upwelling. Such upwelling as indicated by theoretical findings and by temperature determinations along two transects off the west coast of Ceylon during the north east monsoon, has been confirmed by the distribution of Oxⁿvalues at these transects.

A mitogenomic perspective on the ancient, rapid radiation in the Galliformes with an emphasis on the Phasianidae

Background: The Galliformes is a well-known and widely distributed Order in Aves. The phylogenetic relationships of galliform birds, especially the turkeys, grouse, chickens, quails, and pheasants, have been studied intensively, likely because of their close association with humans. Despite extensive studies, convergent morphological evolution and rapid radiation have resulted in conflicting hypotheses of phylogenetic relationships. Many internal nodes have remained ambiguous. Results: We analyzed the complete mitochondrial (mt) genomes from 34 galliform species, including 14 new mt genomes and 20 published mt genomes, and obtained a single, robust tree. Most of the internal branches were relatively short and the terminal branches long suggesting an ancient, rapid radiation. The Megapodiidae formed the sister group to all other galliforms, followed in sequence by the Cracidae, Odontophoridae and Numididae. The remaining clade included the Phasianidae, Tetraonidae and Meleagrididae. The genus Arborophila was the sister group of the remaining taxa followed by Polyplectron. This was followed by two major clades: ((((Gallus, Bambusicola) Francolinus) (Coturnix, Alectoris)) Pavo) and (((((((Chrysolophus, Phasianus) Lophura) Syrmaticus) Perdix) Pucrasia) (Meleagris, Bonasa)) ((Lophophorus, Tetraophasis) Tragopan))). Conclusions: The traditional hypothesis of monophyletic lineages of pheasants, partridges, peafowls and tragopans was not supported in this study. Mitogenomic analyses recovered robust phylogenetic relationships and suggested that the Galliformes formed a model group for the study of morphological and behavioral evolution.