Identification of the divergent calmodulin binding motif in yeast Ssb1/Hsp75 protein and in other HSP70 family members

Yeast soluble proteins were fractionated by calmodulin-agarose affinity chromatography and the Ca2+/calmodulin-binding proteins were analyzed by SDS-PAGE. One prominent protein of 66 kDa was excised from the gel, digested with trypsin and the masses of the resultant fragments were determined by MALDI/MS. Twenty-one of 38 monoisotopic peptide masses obtained after tryptic digestion were matched to the heat shock protein Ssb1/Hsp75, covering 37% of its sequence. Computational analysis of the primary structure of Ssb1/Hsp75 identified a unique potential amphipathic alpha-helix in its N-terminal ATPase domain with features of target regions for Ca2+/calmodulin binding. This region, which shares 89% similarity to the experimentally determined calmodulin-binding domain from mouse, Hsc70, is conserved in near half of the 113 members of the HSP70 family investigated, from yeast to plant and animals. Based on the sequence of this region, phylogenetic analysis grouped the HSP70s in three distinct branches. Two of them comprise the non-calmodulin binding Hsp70s BIP/GR78, a subfamily of eukaryotic HSP70 localized in the endoplasmic reticulum, and DnaK, a subfamily of prokaryotic HSP70. A third heterogeneous group is formed by eukaryotic cytosolic HSP70s containing the new calmodulin-binding motif and other cytosolic HSP70s whose sequences do not conform to those conserved motif, indicating that not all eukaryotic cytosolic Hsp70s are target for calmodulin regulation. Furthermore, the calmodulin-binding domain found in eukaryotic HSP70s is also the target for binding of Bag-1 - an enhancer of ADP/ATP exchange activity of Hsp70s. A model in which calmodulin displaces Bag-1 and modulates Ssb1/Hsp75 chaperone activity is discussed.

The role of autolysis loop in determining the specificity of coagulation proteases

We recently demonstrated that the substitution of the autolysis loop (residues 143 to 154 in the chymotrypsin numbering system) of activated protein C (APC) with the corresponding loop of factor Xa (fXa) renders the APC mutant (APC/fX143-154) susceptible to inhibition by antithrombin (AT) in the presence of pentasaccharide. Our recent results further indicated, that in addition to an improvement in the reactivity of APC/fX143-154 with AT, both the amidolytic and anti-factor Va activities of the mutant APC have also been significantly increased. Since the autolysis loop of APC is five residues longer than the autolysis loop of fXa, it could not be ascertained whether this loop in the mutant APC specifically interacts with the activated conformation of AT or if a shorter autolysis loop is responsible for a global improvement in the catalytic activity of the mutant protease. To answer this question, we prepared another APC mutant in which the autolysis loop of the protease was replaced with the corresponding loop of trypsin (APC/Tryp143-154). Unlike an ~500-fold improvement in the reactivity of APC/fX143-154 with AT in the presence of pentasaccharide, the reactivity of APC/Tryp143-154 with the serpin was improved ~10-fold. These results suggest that both the length and structure of residues of the autolysis loop are critical for the specificity of the coagulation protease interaction with AT. Further factor Va inactivation studies with the APC mutants revealed a similar role for the autolysis loop of APC in the interaction with its natural substrate.

Transduction motif analysis of gastric cancer based on a human signaling network

To investigate signal regulation models of gastric cancer, databases and literature were used to construct the signaling network in humans. Topological characteristics of the network were analyzed by CytoScape. After marking gastric cancer-related genes extracted from the CancerResource, GeneRIF, and COSMIC databases, the FANMOD software was used for the mining of gastric cancer-related motifs in a network with three vertices. The significant motif difference method was adopted to identify significantly different motifs in the normal and cancer states. Finally, we conducted a series of analyses of the significantly different motifs, including gene ontology, function annotation of genes, and model classification. A human signaling network was constructed, with 1643 nodes and 5089 regulating interactions. The network was configured to have the characteristics of other biological networks. There were 57,942 motifs marked with gastric cancer-related genes out of a total of 69,492 motifs, and 264 motifs were selected as significantly different motifs by calculating the significant motif difference (SMD) scores. Genes in significantly different motifs were mainly enriched in functions associated with cancer genesis, such as regulation of cell death, amino acid phosphorylation of proteins, and intracellular signaling cascades. The top five significantly different motifs were mainly cascade and positive feedback types. Almost all genes in the five motifs were cancer related, including EPOR,MAPK14, BCL2L1, KRT18,PTPN6, CASP3, TGFBR2,AR, and CASP7. The development of cancer might be curbed by inhibiting signal transductions upstream and downstream of the selected motifs.

Patterns in space : a regional study of motif in Minoan wall painting

This thesis consists of a quantitative analysis of the regional prevalence of certain artistic motifs as they appear in Minoan wall painting of the Neopalatial period. This will help to establish the relative degree of artistic autonomy exercised by each of the sites included in this study. The results show that the argument for itinerant artists during this time period is a strong one, but the assumption that these travelling artists were being controlled by any one palace-centre is erroneous. Rather, the similarities and differences seen suggest that the choices were predicated either by the specific patrons, or by the function of the associated building or room. Thus, the motifs found within this study should be understood as constituting a cultural identity, with greater or lesser degrees of regional homogeneity, which act as one facet of a number of cultural indicators that can be used to better understand the role of artists and regional dynamics on the island during the Bronze Age.

A Multi-Objective Genetic Algorithm with Side Effect Machines for Motif Discovery

Understanding the machinery of gene regulation to control gene expression has been one of the main focuses of bioinformaticians for years. We use a multi-objective genetic algorithm to evolve a specialized version of side effect machines for degenerate motif discovery. We compare some suggested objectives for the motifs they find, test different multi-objective scoring schemes and probabilistic models for the background sequence models and report our results on a synthetic dataset and some biological benchmarking suites. We conclude with a comparison of our algorithm with some widely used motif discovery algorithms in the literature and suggest future directions for research in this area.

L'âge, un motif autorisé de discrimination? : étude critique des effets conjugués des articles 10 de la Charte des droits et libertés de la personne et 15 de la Charte canadienne des droits et libertés comme obstacles à la protection contre la discrimination fondée sur l'âge

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Maître en droit (LL.M.)"

« Accommodements raisonnables » pour motif religieux : étude d’un débat public

Ce mémoire porte sur la polémique qui a eu lieu au Québec entre mars 2006 et décembre 2007 autour des pratiques d’« accommodements raisonnables » pour motif religieux. À partir d’une approche compréhensive et d’un cadre théorique propre à la sociologie des relations ethniques, il propose une analyse qualitative de lettres d’opinion publiées dans des quotidiens québécois. Une première analyse, thématique, a permis de constituer des registres argumentaires dans lesquels ont puisé les participants au débat public sur les « accommodements raisonnables » par le biais de lettres d’opinion. Une seconde analyse, comparative, a permis de construire des figures d’intervenants du débat public qui témoignent non seulement des forces idéologiques qui se sont affrontées dans le débat public, mais également de leur positionnement au croisement des axes saillants de la différenciation sociale dans cette polémique Les résultats de ces analyses suggèrent d’abord que la polémique résulte d’un conflit entre marqueurs identitaires devant servir au positionnement des frontières ethniques, et ensuite que la polémique des « accommodements raisonnables » a donné lieu à une reconfiguration des rapports ethniques au Québec, attribuable à la dissociation entre le conflit entre deux nations et celui sur les critères d’inclusion à la nation.

Le motif d’empaquetage le long du sillon: une nouvelle entité structurale récurrente dans les ARN ribosomiques

La plupart des molécules d’ARN doivent se replier en structure tertiaire complexe afin d’accomplir leurs fonctions biologiques. Cependant, les déterminants d’une chaîne de polynucléotides qui sont nécessaires à son repliement et à ses interactions avec d’autres éléments sont essentiellement inconnus. L’établissement des relations structure-fonction dans les grandes molécules d’ARN passe inévitablement par l’analyse de chaque élément de leur structure de façon individuelle et en contexte avec d’autres éléments. À l’image d’une construction d’immeuble, une structure d’ARN est composée d’unités répétitives assemblées de façon spécifique. Les motifs récurrents d’ARN sont des arrangements de nucléotides retrouvés à différents endroits d’une structure tertiaire et possèdent des conformations identiques ou très similaires. Ainsi, une des étapes nécessaires à la compréhension de la structure et de la fonction des molécules d’ARN consiste à identifier de façon systématique les motifs récurrents et d’en effectuer une analyse comparative afin d’établir la séquence consensus. L’analyse de tous les cas d’empaquetage de doubles hélices dans la structure du ribosome a permis l’identification d’un nouvel arrangement nommé motif d’empaquetage le long du sillon (AGPM) (along-groove packing motif). Ce motif est retrouvé à 14 endroits dans la structure du ribosome de même qu’entre l’ARN ribosomique 23S et les molécules d’ARN de transfert liées aux sites ribosomaux P et E. Le motif se forme par l’empaquetage de deux doubles hélices via leur sillon mineur. Le squelette sucre-phosphate d’une hélice voyage le long du sillon mineur de l’autre hélice et vice versa. Dans chacune des hélices, la région de contact comprend quatre paires de bases. L’empaquetage le plus serré est retrouvé au centre de l’arrangement où l’on retrouve souvent une paire de bases GU dans une hélice interagissant avec une paire de bases Watson-Crick (WC) dans l’autre hélice. Même si la présence des paires de bases centrales GU versus WC au centre du motif augmente sa stabilité, d’autres alternatives existent pour différents représentants du motif. L’analyse comparative de trois librairies combinatoires de gènes d’AGPM, où les paires de bases centrales ont été variées de manière complètement aléatoire, a montré que le contexte structural influence l’étendue de la variabilité des séquences de nucléotides formant les paires de bases centrales. Le fait que l’identité des paires de bases centrales puisse varier suggérait la présence d’autres déterminants responsables au maintien de l’intégrité du motif. L’analyse de tous les contacts entre les hélices a révélé qu’en dehors du centre du motif, les interactions entre les squelettes sucre-phosphate s’effectuent via trois contacts ribose-ribose. Pour chacun de ces contacts, les riboses des nucléotides qui interagissent ensemble doivent adopter des positions particulières afin d’éviter qu’ils entrent en collision. Nous montrons que la position de ces riboses est modulée par des conformations spécifiques des paires de bases auxquelles ils appartiennent. Finalement, un autre motif récurrent identifié à l’intérieur même de la structure de trois cas d’AGPM a été nommé « adenosine-wedge ». Son analyse a révélé que ce dernier est lui-même composé d’un autre arrangement, nommé motif triangle-NAG (NAG-triangle). Nous montrons que le motif « adenosine-wedge » représente un arrangement complexe d’ARN composé de quatre éléments répétitifs, c’est-à-dire des motifs AGPM, « hook-turn », « A-minor » et triangle-NAG. Ceci illustre clairement l’arrangement hiérarchique des structures d’ARN qui peut aussi être observé pour d’autres motifs d’ARN. D’un point de vue plus global, mes résultats enrichissent notre compréhension générale du rôle des différents types d’interactions tertiaires dans la formation des molécules d’ARN complexes.

Autocrine loop in the purinergic control of airway surface liquid volume : monitoring with a novel side-view imaging technique

La Fibrose Kystique (FK) est une maladie dégénérative qui entraine une dégénération des poumons dû au problème de clairance mucociliaire (CMC). Le volume de surface liquide (SL) couvrant les cellules pulmonaires est essentiel à la clairance de mucus et au combat contre les infections. Les nucléotides extracellulaires jouent un rôle important dans la CMC des voies aériennes, en modifiant le volume de la SL pulmonaire. Cependant, les mécanismes du relâchement de l’ATP et de leurs déplacements à travers la SL, restent inconnus. Des études ultérieures démontrent que l’exocytose d’ATP mécano-sensible et Ca2+-dépendant, dans les cellules A549, est amplifié par les actions synergétiques autocrine/paracrine des cellules avoisinantes. Nous avions comme but de confirmer la présence de la boucle purinergique dans plusieurs modèles de cellules épithéliales et de développer un système nous permettant d’observer directement la SL. Nous avons démontrés que la boucle purinergique est fonctionnelle dans les modèles de cellules épithéliales examinés, mis appart les cellules Calu-3. L’utilisation de modulateur de la signalisation purinergique nous a permis d’observer que le relâchement d’ATP ainsi que l’augmentation du [Ca2+]i suivant un stress hypotonique, sont modulés par le biais de cette boucle purinergique et des récepteurs P2Y. De plus, nous avons développé un système de microscopie qui permet d’observer les changements de volume de SL en temps réel. Notre système permet de contrôler la température et l’humidité de l’environnement où se trouvent les cellules, reproduisant l’environnement pulmonaire humain. Nous avons démontré que notre système peut identifier même les petits changements de volume de SL.

Conception de miARN artificiels basée sur la caractérisation de la boucle de régulation miR-20/E2F

La biologie moléculaire et, plus spécifiquement, la régulation de l’expression génique ont été révolutionnées par la découverte des microARN (miARN). Ces petits ARN d’une vingtaine de nucléotides sont impliqués dans la majorité des processus cellulaires et leur expression est dérégulée dans plusieurs maladies, comme le cancer. Un miARN reconnaît ses cibles principalement par son noyau, ce qui lui permet de réguler simultanément la traduction de centaines d’ARN messagers. Nos travaux ont montré l’existence d’une boucle de rétro-activation négative, entre deux miARN du polycistron miR-17-92 et trois facteurs de transcription de la famille E2F. E2F1, 2 et 3 induisent la transcription de miR-20 et miR-17 qui par la suite inhibent leur traduction. Nos résultats suggèrent l’implication de cette boucle dans la résistance à l’apoptose induite par E2F1 dans les cellules du cancer de la prostate, ce qui expliquerait en partie le potentiel oncogénique du polycistron miR-17-92. L’étude de ce motif de régulation nous a donc permis de réaliser le potentiel incroyable qu’ont les miARN à inhiber la traduction de plusieurs gènes. Basé sur les règles de reconnaissance des miARN, nous avons développé et validé MultiTar. Cet outil bioinformatique permet de trouver la séquence d’un miARN artificiel ayant le potentiel d’inhiber la traduction de gènes d’intérêts choisis par l’utilisateur. Afin de valider MultiTar, nous avons généré des multitargets pouvant inhiber l’expression des trois E2F, ce qui nous a permis de comparer leur efficacité à celle de miR-20. Nos miARN artificiels ont la capacité d’inhiber la traduction des E2F et de neutraliser leur fonction redondante de la progression du cycle cellulaire de façon similaire ou supérieur à miR-20. La fonctionnalité de notre programme, ouvre la voie à une stratégie flexible pouvant cibler le caractère multigénique de différents processus cellulaires ou maladies complexes, tel que le cancer. L’utilisation de miARN artificiels pourrait donc représenter une alternative intéressante aux stratégies déjà existantes, qui sont limitées à inhiber des cibles uniques. En plus d’élucider un réseau de régulation complexe impliquant les miARN, nous avons pu tirer profit de leur potentiel d’inhibition par la conception de miARN artificiels.

Caractérisation de la MAP kinase atypique Erk4 : activation et fonction physiologique

Les MAP kinases sont des enzymes essentielles impliquées dans 7 voies de signalisation distinctes qui permettent à la cellule de répondre de manière adéquate aux stimuli extra-cellulaires. Chez les mammifères, les MAP kinases les mieux caractérisées sont Erk1/2, Jnk, p38 et Erk5. Ces enzymes jouent un rôle important dans l’embryogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire ainsi que dans la réponse au stress. Erk4 est un membre atypique de la famille MAP kinase. D’une part, la boucle d’activation de Erk4 possède un motif SEG au lieu du motif TXY, très conservé chez les MAP kinases. D’autre part, Erk4 possède une extension en C-terminal du domaine kinase qui n’est pas présente chez les MAP kinases classiques. Jusqu’à présent aucune fonction n’a été attribuée à Erk4. De plus, la voie de signalisation ainsi que le mode de régulation conduisant à l’activation de Erk4 ne sont pas connus. Le seul substrat de Erk4 identifié jusqu’à maintenant est la MAPKAP kinase MK5. L’impact fonctionnel de cette interaction n’est également pas connu. Afin d’en apprendre davantage sur la MAP kinase atypique Erk4, nous avons étudié le mécanisme d’activation de cette kinase ainsi que sa fonction physiologique par une approche de délétion génique chez la souris. En ce qui concerne l’activation de Erk4, nous avons montré que la boucle d’activation de Erk4 (S186EG) est constitutivement phosphorylée in vivo et que cette phosphorylation n’est pas modulée par les stimuli classiques des MAP kinases dont le sérum et le sorbitol. Cependant, nous avons observé que la phosphorylation de la S186 augmente en présence de MK5 et que cette augmentation est indépendante de l’activité kinase de l’une ou l’autre de ces kinases. De plus, nous avons établi que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 est requise pour l’interaction stable entre Erk4 et MK5 ainsi que pour l’activation, et la relocalisation cytoplasmique de MK5. Ainsi, notre étude a permis de révéler que Erk4 est régulée de manière différente des MAP kinases classiques et que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité de MK5. Parallèlement, nos résultats mettent en évidence l’existence d’une “Erk4 kinase”, dont le recrutement et/ou l’activation semble être facilité par MK5. Afin identifier la fonction physiologique de Erk4, nous avons généré des souris Erk4-déficientes. L’inactivation génique de Erk4 est viable et les souris ne présentent aucune anomalie apparente. Dans le but d’expliquer l’absence de phénotype, nous avons regardé si l’expression de Erk3, le paralogue de Erk4, pouvait compenser la perte de Erk4. Notre analyse a révélé que l’expression de Erk3 dans les souris Erk4-/- n’augmente pas au cours du développement embryonnaire ou dans les tissus adultes afin de compenser pour la perte de Erk4. Par la suite, nous avons adressé la question de redondance entre Erk4 et Erk3. Dans notre laboratoire, les souris Erk3-déficientes ont également été générées et le phénotype de ces souris a récemment été analysé. Cette étude a révélé que l’inactivation génique de Erk3 entraîne un retard de croissance intra-utérin, un défaut de maturation pulmonaire et la mort néo-natale des souriceaux. Nous avons donc regardé la contribution de Erk4 dans ces phénotypes. L’analyse des souris Erk4-/- a révélé que l’inactivation de Erk4 n’entraîne pas de retard de croissance ou de maturation du poumon. De plus, nous avons montré que l’inactivation additionnelle de Erk4 dans les souris Erk3-/- n’accentue pas le phénotype des souris Erk3-déficientes. Ainsi, notre étude a révélé que contrairement à Erk3, Erk4 n’est pas essentielle au développement murin dans des conditions physiologiques. Parallèlement, nous avons montré que Erk4 et Erk3 possèdent des fonctions non-redondantes in vivo.

Mortuaires suivi de La mort-vivance comme motif d'écriture dans Aurélia de Gérard de Nerval

Dans Mortuaires, une pièce de théâtre en fragments, deux soeurs se rencontrent dans une chambre d'hôtel; Jiji, la plus vieille, vient de retrouver les cendres de leur mère, morte dix ans auparavant; elle voudrait enterrer l'urne définitivement, alors que la plus jeune, Ge, tient à la garder près d'elle. Ce sera l'occasion pour les soeurs de faire valoir leur propre désir et de célébrer la morte, de reprendre contact avec ce qui reste d'elle dans leur mémoire. Le texte se présente sous forme de mini-scènes sans continuité, bien qu’étant toutes reliées, comme un dialogue interrompu, une cérémonie rejouant la mise en pièces du corps. La fragmentation de la mémoire constitue le projet esthétique de la pièce, dont le ressort dramatique tourne autour du souvenir endeuillé et du corps mort. La mort-vivance comme motif d'écriture dans « Aurélia » de Gérard de Nerval est un essai portant sur le rapport qu'entretient Nerval avec les morts dans le récit, ceux-ci constituant son moteur d'écriture. Au moyen de théories telles que la psychanalyse (Freud, Jackson), la sociologie (Muray) et la théorie de la lecture (Picard), il sera démontré que Nerval, dans Aurélia, se fait spirite en faisant revenir les morts au moyen du rêve. L'écriture se pose comme un lieu de rencontre entre les vivants et les morts, un espace dans lequel chacun doit se faire mort-vivant pour aller retrouver l'autre. Les frontières se brouillent et il devient difficile pour Nerval, ainsi que pour le lecteur, de distinguer le rêve de la réalité.