Identification and characterization of pptA: a gene involved in the phase-variable expression of phosphorylcholine on pili of Neisseria meningitidis

Pili of pathogenic Neisseria are major virulence factors associated with adhesion, cytotoxicity, twitching motility, autoaggregation, and DNA transformation. Pili are modified posttranslationally by the addition of phosphorylcholine. However, no genes involved in either the biosynthesis or the transfer of phosphorylcholine in Neisseria meningitidis have been identified. In this study, we identified five candidate open reading frames (ORFs) potentially involved in the biosynthesis or transfer of phosphorylcholine to pilin in N. meningitidis. Insertional mutants were constructed for each ORF in N. meningitidis strain C311#3 to determine their effect on phosphorylcholine expression. The effect of the mutant ORFs on the modification by phosphorylcholine was analyzed by Western analysis with phosphorylcholine-specific monoclonal antibody TEPC-15. Analysis of the mutants showed that ORF NMB0415, now defined as pptA (pilin phosphorylcholine transferase A), is involved in the addition of phosphorylcholine to pilin in N. meningitidis. Additionally, the phase variation (high frequency on-off switching of expression) of phosphorylcholine on pilin is due to changes in a homopolymeric guanosine tract in pptA.

Polimorfismos GSTT1 e GSTM1 em indivíduos tabagistas com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço

A variabilidade em genes relacionados aos processos de ativação e detoxificação de carcinógenos pode interferir na suscetibilidade ao câncer. OBJETIVO: Investigar a relação entre os polimorfismos GSTT1 e GSTM1 nulos e o risco para o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço em indivíduos tabagistas. MATERIAL E MÉTODO: Este estudo caso-controle foi realizado na Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, Brasil. Foram avaliadas as freqüências dos genótipos nulos GSTT1 e GSTM1 por PCR multiplex em 60 pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço e 60 indivíduos sem a doença. RESULTADOS: A cavidade oral foi o sítio de tumor mais freqüente. O genótipo GSTT1 nulo foi encontrado em 33,3% dos pacientes e em 23,3% dos indivíduos controles (p=0,311). Os grupos caso e controle apresentaram freqüências do genótipo GSTM1 nulo de 35% e 48,3%, respectivamente (p=0,582). Não foram encontradas associações entre o hábito etilista e genótipos nulos GSTT1 e GSTM1 em ambos os grupos (valores de p>0,05). O gênero masculino e o hábito etilista foram prevalentes em ambos os grupos. CONCLUSÃO: Neste estudo não foi possível estabelecer uma correlação entre os genótipos nulos GSTT1 e GSTM1 e o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço em indivíduos tabagistas.

Rastreio neonatal da homocistinúria clássica revela uma elevada frequência da deficiência em MAT I/III na Península Ibérica

A homocistinúria devida à deficiência da enzima cistationina -sintetase ou “homocistinúria clássica” é uma doença metabólica rara (1/344 000 RN), de transmissão autossómica recessiva e caracterizada por elevada heterogeneidade clínica, que frequentemente contribui para o diagnóstico tardio. Existe tratamento efetivo, se instituído antes de se instalarem sintomas irreversíveis, pelo que tem sido incluída num número considerável de programas de rastreio neonatal. O rastreio baseia-se na determinação dos níveis plasmáticos de metionina, por espectrometria de massa em tandem (ms/ms), mas conduz à identificação de muitos casos falsos-positivos, portadores de uma condição com significado clínico não completamente esclarecido, a deficiência em metionina adenosiltransferase (MAT I/III). Ambas as condições são rastreadas na Galiza e em Portugal desde 2000 e 2004, respetivamente. Desde então, foram identificados três doentes com homocistinúria clássica e 44 doentes com deficiência em MAT I/III. Uma forma dominante, e aparentemente benigna, desta última condição, associada à mutação p.R264H, parece ser muito frequente na Península Ibérica. A implementação de um teste de segunda linha, consistindo na determinação da homocisteína total, permitiria reduzir consideravelmente o número de RN identificados com deficiência em MAT I/III e melhorar a especificidade e valor positivo preditivo do rastreio da homocistinúria clássica.

Substrate interaction with recombinant amidase from Pseudomonas aeruginosa during biocatalysis

The interaction of a variety of substrates with Pseudomonas aeruginosa native amidase (E.C. 3.5.1.4), overproduced in an Escherichia coli strain, was investigated using difference FTIR spectroscopy. The amides used as substrates showed an increase in hydrogen bonding upon association in multimers, which was not seen with esters. Evidence for an overall reduction or weakening of hydrogen bonding while amide and ester substrates are interacting with the enzyme is presented. The results describe a spectroscopic approach for analysis of substrate-amidase interaction and in situ monitoring of the hydrolysis and transferase reaction when amides or esters are used as substrates.

In vivo and in vitro effects of RAD001 on bladder cancer

Objective: To evaluate the influence of Everolimus (RAD001) on chemically induced urothelial lesions in mice and its influence on in vitro human bladder cancer cell lines. Methods: ICR male mice were given N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine in drinking water for a period of 12 weeks. Subsequently, RAD001 was administered via oral gavage, for 6 weeks. At the end of the experiment, all the animals were sacrificed and tumor development was determined by means of histopathologic evaluation; mammalian target of rapamycin (mTOR) expressivity was evaluated by immunohistochemistry. Three human bladder cancer cell lines (T24, HT1376, and 5637) were treated using a range of RAD001 concentrations. MTT assay, terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL), and flow cytometry were used to assess cell proliferation, apoptosis index, and cell cycle analysis, respectively. Immunoblotting analysis of 3 cell line extracts using mTOR and Akt antibodies was performed in order to study the expression of Akt and mTOR proteins and their phosphorylated forms. Results: The incidence of urothelial lesions in animals treated with RAD001 was similar to those animals not treated. RAD001 did not block T24 and HT1376 cell proliferation or induce apoptosis. A reduction in cell proliferation rate and therefore G0/G1 phase arrest, as well as a statistically significant induction of apoptosis (P 0.001), was only observed in the 5637 cell line. Conclusion: RAD001 seems not to have a significant effect on chemically induced murine bladder tumors. The effect of RAD001 on tumor proliferation and apoptosis was achieved only in superficial derived bladder cancer cell line, no effect was observed in invasive cell lines.

Alteração de enzimas hepáticas em trabalhadores de refinaria de petróleo

OBJETIVO: A exposição ocupacional típica de uma refinaria de petróleo pode alterar a função hepática de seus trabalhadores. Assim, o objetivo do estudo foi identificar fatores de risco de alterações em enzimas hepáticas em trabalhadores de uma refinaria de petróleo. MÉTODOS: Os trabalhadores de uma refinaria de petróleo, localizada em São Francisco do Conde, Estado da Bahia, eram submetidos a exames periódicos anuais de 1982 a1998. O estudo caso-controle investigou todos os 150 casos de indivíduos com alteração simultânea de gama-glutamil transferase e de alanino amino transferase, de pelo menos 10% acima do valor de referência. Como controles, foram selecionados 150 indivíduos sem quaisquer alterações de enzimas hepáticas ou de bilirrubinas, desde a sua admissão. Foram calculadas as razões de chance e respectivos intervalos de confiança de 95% a partir de modelos de regressão logística. RESULTADOS: Em todos os setores de produção, o risco de alteração de enzimas hepáticas foi significantemente mais elevado do que no setor administrativo (RC=5,7; IC 95%: 1,7-18,4), estando controlados os efeitos do álcool, obesidade e antecedentes médicos de hepatite. No período 1992-1994 foram registrados 89 casos, 88 deles provieram dos diversos setores da produção. CONCLUSÕES: A exposição ocupacional desempenha papel importante na determinação de alterações de enzimas hepáticas em trabalhadores do refino de petróleo, além dos fatores de risco eminentemente biológicos e/ou comportamentais como obesidade e o consumo de álcool.

Custo-efetividade dos análogos de nucleosídeos/nucleotídeos para hepatite crônica B

OBJETIVO: Conduzir uma análise de custo-efetividade das alternativas medicamentosas com terapia de resgate na recaída por resistência viral para tratamento de pacientes com hepatite crônica B (HCB). MÉTODOS: Coorte hipotética de pacientes com HCB, HBeAg negativo, sem evidência clínica ou histológica de cirrose, DNA do VHB detectável, diagnóstico histológico da doença, HBsAg positivo no soro por mais de seis meses, elevados níveis de alanina transferase (ALT) (duas vezes maior que o limite superior da normalidade [LSN]) e média de idade de 40 anos. Modelo de Markov foi desenvolvido para a hepatite crônica B (antígeno HBeAg negativo) com horizonte temporal de 40 anos. Custos e benefícios foram descontados em 5%. As taxas anuais de progressão, custos devido a complicações e a eficácia dos medicamentos foram obtidos da literatura. As incertezas foram avaliadas por análises de sensibilidade unidirecional e probabilística. RESULTADOS: Iniciar o tratamento com entecavir resultou em 0,35 ano de vida ganho em relação à lamivudina. A razão de custo-efetividade incremental foi de R$ 16.416,08 por anos de vida ganhos. Na análise de sensibilidade a razão de custo-efetividade incremental foi mais sensível à variação na probabilidade de transição de hepatite crônica B para cirrose compensada, taxa de desconto e preço dos medicamentos (± 10%). Na análise de sensibilidade probabilística, a curva de aceitabilidade mostrou que iniciar com entecavir foi a alternativa mais custo-efetiva na comparação ao uso de lamivudina. CONCLUSÕES: A disponibilidade do entecavir é economicamente atrativa como parte do tratamento precoce para pacientes com hepatite crônica B sem coinfecção com o HIV.

Light controlled synthesis of nucleic acids

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor em Bioquímica - especialidade Biotecnologia, pela Universidade Nova de Lisboa,Faculdade de Ciências e Tecnologia

Early physiological and biochemical responses of rice seedlings to low concentration of microcystin-LR

Microcystin-leucine and arginine (microcystin- LR) is a cyanotoxin produced by cyanobacteria like Microcystis aeruginosa, and it’s considered a threat to water quality, agriculture, and human health. Rice (Oryzasativa) is a plant of great importance in human food consumption and economy, with extensive use around the world. It is therefore important to assess the possible effects of using water contaminated with microcystin-LR to irrigate rice crops, in order to ensure a safe, high quality product to consumers. In this study, 12 and 20-day-old plants were exposed during 2 or 7 days to a M. aeruginosa extract containing environmentally relevant microcystin-LR concentrations, 0.26–78 lg/L. Fresh and dry weight of roots and leaves, chlorophyll fluorescence, glutathione S-transferase and glutathione peroxidase activities, and protein identification by mass spectrometry through two-dimensional gel electrophoresis from root and leaf tissues, were evaluated in order to gauge the plant’s physiological condition and biochemical response after toxin exposure. Results obtained from plant biomass, chlorophyll fluorescence, and enzyme activity assays showed no significant differences between control and treatment groups. How- ever, proteomics data indicates that plants respond to M. aeruginosa extract containing environmentally relevant microcystin-LR concentrations by changing their metabolism, responding differently to different toxin concentrations. Biological processes most affected were related to protein folding and stress response, protein biosynthesis, cell signalling and gene expression regulation, and energy and carbohydrate metabolism which may denote a toxic effect induced by M. aeruginosa extract and microcystin- LR. Theimplications of the metabolic alterations in plant physiology and growth require further elucidation.

Characterization of a clone from an adult worm cDNA library selected with anti-Schistosoma mansoni human antibodies dissociated from immune complexes: a preliminary report

Considering the scarcity of defined antigens, actually useful and reliable for use in the field studies, we propose an alternative method for selection of cDNA clones with potential use in the diagnosis of schistosomiasis. Human antibodies specific to a protein fraction of 31/32 kDa (Sm31/32), dissociated from immune complexes, are used for screening of clones from an adult worm cDNA library. Partial sequencing of five clones, selected through this strategy, showed to be related to Schistosoma mansoni: two were identified as homologous to heat shock protein 70, one to glutathione S-transferase, one to homeodomain protein, and one to a previously described EST (expressed sequence tag) of S. mansoni. This last clone was the most consistently reactive during the screening process with the anti-Sm31/32 antibodies dissociated from the immune complexes. The complete sequence of this clone was obtained and the translation data yielded only one ORF (open reading frame) that code for a protein with 57 amino acids. Based on this amino acid sequence two peptides were chemically synthesized and evaluated separately against a pool of serum samples from schistosomiasis patients and non-schistosomiasis individuals. Both peptides showed strong reactivity only against the positive pool, suggesting that these peptides may be useful as antigens for the diagnosis of schistosomiasis mansoni.

Modulatory activity of antioxidants against the toxicity of Rifampicin in vivo

The World Health Organization (WHO) has shown concern about the burden of tuberculosis in the developing countries. Even though rifampicin is an effective drug in the management of tuberculosis, it has been documented to have some toxic effects in humans. Therefore, this study intends to investigate the modulatory effect of vitamins C and E on the hepatotoxicity, sperm quality and brain toxicity of Rifampicin. Forty Wistar albino rats were used, 10 animals per group. Group 1 animals received 0.3 mL of distilled water, the Group 2 animals received the therapeutic dose of rifampicin, Group 3 animals received therapeutic doses of rifampicin plus vitamin E, while Group 4 received therapeutic doses of rifampicin and vitamin C. The administration was performed orally during three months; the animals were sacrificed by cervical dislocation at the end of that period. Blood samples were collected and liver function and lipid profile was analyzed using fully automated clinical chemistry device. The liver, brain and reproductive organs underwent histopathological examination. Sperm samples were collected from the epididymis to achieve count and motility and morphological analysis. Results showed rifampicin alone to raise (p < 0.05) liver function enzymes (Aspartate amino transferase [AST], Serum alanine amino transferase [ALT] and Total Bilirubin) when compared with controls. While the vitamin E treated group showed remarkable protection, the vitamin C treated group showed questionable protection against the rifampicin induced liver damage. Sperm count results showed an important (p < 0.05) increase in the sperm quality in vitamin E and C treated groups. However, the vitamin E plus Rifampicin treated group showed increased lipid peroxidation. The histopathological findings revealed structural damages by rifampicin in liver, brain and epididymis while some remarkable architectural integrity was observed in the antioxidant-treated groups. It can be concluded that vitamin E or C improved sperm quality and protected against the brain damage caused by rifampicin. Moreover, vitamin E demonstrated remarkable hepatoprotection against rifampicin induced damage while vitamin C shows a questionable hepatoprotection.

Importância do Diagnóstico Laboratorial no Síndrome de HELLP

O Síndrome de Hellp (S. Hellp) é uma situação clínica que surge aproximadamente em 10% dos casos de pré-eclâmpsia grave. É uma disfunção multiorgânica em que a tríade laboratorial que o caracteriza, H-hemólise, EL-elevated liver enzymes (enzimas hepáticos elevados) e LP-low platelets (trombocitopenia) permite efectuar e monitorizar correctamente o diagnóstico e tratamento aplicado. O S. Hellp pode surgir inicialmente numa fase mais lenta, em que se verificam níveis moderadamente elevados de desidrogenase láctica (LDH), trombocitopenia ligeira (100.000-150.000/ul) e diminuição da haptoglobina. Posteriormente, torna-se evidente a existência de disfunção hepática, pela elevação dos níveis séricos do aspartato amino transferase (AST) e alanina amino transferase (ALT), acompanhados de concentrações ainda mais elevadas de LDH e trombocitopenia grave (<50.000/ul). Surge a anemia hemolítica microangiopática e verificam-se igualmente alterações significativas da coagulação. Outras perturbações podem ocorrer, nomeadamente a nível renal, cardiovascular e respiratório.

The two-component system of a novel copper resistant operon of Marinobacter hydrocarbonoclasticus

Dissertation for the Master’s Degree in Structural and Functional Biochemistry

A clinico-pathological study of 163 untreated cases of chronic hepatitis C

We performed a clinico-pathological study of 163 untreated cases of chronic hepatitis C. Eighty five percent of the patients were clinically asymptomatic and their physical examinations sbowed unremarkable or minimal changes at the time of the liver biopsy Liver function tests tended to present slight abnormalities, involving mild elevations of the activity of the aminotransferases and gamma-glutamil transferase levels. In spite of these mild abnormalities advanced chronic liver disease ivas histologically detected in eighty nine percent of the patients, mainly showing chronic active hepatitis. The most characteristic histological finding ivas an interlobular bile duct damage which correlated with the presence of tymphoid aggregates in the portal tracts and with the development of fibrosis.

Alterações da função hepática de camundongos desnutridos e infectados pelo Schistosoma mansoni

Existem poucos estudos sobre as alterações da função hepática em camundongos com esquistossomose associada à desnutrição. Neste trabalho, os animais foram divididos em quatro grupos, de acordo com as dietas (normal ou hipoprotéica) e infectados ou não pelo Schistosoma mansoni. Todos os grupos desenvolveram-se menos que o grupo controle (p<0,0001). A mortalidade nos animais foi devida à infecção. Níveis altos de aminotransferases nos animais nutridos e infectados sugerem um processo inflamatório intenso (p<0,0001). Todos os grupos apresentaram elevação da fosfatase alcalina. Houve aumento da aspartato transferase e da fosfatase alcalina em animais nutridos infectados. As dietas modificaram os níveis de albumina (p>0,001), e das proteínas séricas. Os grupos, comparados ao controle, mostraram baixos níveis de glicose (p<0,001). Este estudo verificou que ambas, infecção e/ou desnutrição, interferiram nos níveis dos indicadores bioquímicos, mas as alterações mais importantes da função hepática ocorreram durante a inflamação intensa causada pela esquistossomose.