Sensibilidade e especificidade do exame eletrocardiográfico na detecção de sobrecargas atriais e/ou ventriculares em gatos da raça Persa com cardiomiopatia hipertrófica

Resumo: A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é a principal cardiopatia dos felinos e é caracterizada por hipertrofia miocárdica concêntrica, sem dilatação ventricular. O ecocardiograma é o melhor meio diagnóstico não invasivo para a diferenciação das cardiomiopatias e é considerado padrão ouro para a detecção de hipertrofia ventricular presente na CMH. Alterações eletrocardiográficas também são comuns em animais com CMH e o eletrocardiograma (ECG) é um teste de triagem para detecção de hipertrofia ventricular em humanos, sendo um exame rápido e facilmente disponível. Em gatos, poucos estudos foram realizados quanto à sensibilidade e especificidade do ECG na detecção de hipertrofia ventricular. Com a intenção de avaliar o uso do ECG como ferramenta de triagem para diagnóstico de CMH em felinos, gatos da raça Persa (n=82) foram avaliados por meio de exames ecocardiográfico e eletrocardiográfico. Animais com bloqueios e/ou distúrbios de condução foram excluídos da análise estatística (n=22). Posteriormente, os animais incluídos foram classificados em: normais (n=38), suspeitos (n=6) e acometidos pela CMH (n=16). Observaram-se diferenças estatísticas na amplitude da onda P em DII e na amplitude de onda R em DII, CV6LL e CV6LU, com valores maiores nos animais com CMH; e nos valores ecocardiográficos de velocidade e gradiente de pressão do fluxo aórtico, diâmetro do átrio esquerdo (AE) e relação AE/Ao, com valores maiores nos gatos com CMH. Dentre os animais com alterações eletrocardiográficas sugestivas de sobrecarga atrial esquerda (n=7), apenas dois realmente apresentavam aumento do AE no ecocardiograma; e dentre os animais com aumento atrial esquerdo ao ecocardiograma (n=7), apenas dois apresentavam alterações eletrocardiográficas sugestivas de sobrecarga do AE (sensibilidade de 40,40% e especificidade de 90,90%). Dentre os gatos com alterações eletrocardiográficas sugestivas de sobrecarga ventricular esquerda (n=6), cinco realmente apresentavam hipertrofia ventricular ao ecocardiograma; e dentre os animais com CMH ao ecocardiograma (n=16), apenas cinco apresentaram alterações eletrocardiográficas sugestivas de sobrecarga do VE (sensibilidade de 31,25% e especificidade de 97,72%). Observou-se correlação positiva entre espessura diastólica do septo interventricular e/ou da parede livre do ventrículo esquerdo e a amplitude da onda R em derivações DII e CV6LU. O eletrocardiograma é um exame rápido e de fácil execução, apresenta boa especificidade na detecção de hipertrofia ventricular em felinos, porém, possui baixa sensibilidade, com grande número de falsos negativos. Desta forma, o ECG auxilia no diagnóstico, mas não substitui o ecocardiograma na confirmação da hipertrofia ventricular.

Diagnóstico da resistência aos herbicidas em plantas daninhas

A resistência de plantas daninhas aos herbicidas caracteriza-se como um fenômeno evolutivo, decorrente da seleção imposta por estes. Esse é um problema grave que vem aumentando nos últimos anos nas áreas agrícolas em todo o mundo. A prevenção por meio de métodos alternativos de manejo atrasa o aparecimento de plantas resistentes, porém o monitoramento periódico das lavouras é a melhor forma de evitar a disseminação quando do surgimento da resistência. Métodos diagnósticos rápidos, eficazes e precisos são úteis na confirmação dos casos de resistência, evitando a disseminação de sementes na área. Diversos métodos têm sido desenvolvidos nos últimos anos, buscando agilizar o diagnóstico da resistência. Recentemente, métodos desenvolvidos através do uso da biotecnologia têm sido aprimorados e mostram uma tendência para o futuro na detecção da resistência aos herbicidas pelas plantas daninhas. No presente trabalho, objetivou-se discutir os métodos para diagnóstico da resistência em plantas daninhas aos herbicidas relatados pela literatura, apresentando suas vantagens e desvantagens, bem como abordando suas possibilidades de aplicação.

Detecção rápida de Salmonella Enteritidis em alimentos por ensaio imunoenzimático ELISA

O método convencional de detecção de Salmonella spp., além de trabalhoso, consome longo tempo, necessitando-se normalmente de 4 a 5 dias para a confirmação da presença dessa bactéria no alimento. Portanto, o emprego de métodos rápidos e simples é importante para o diagnóstico laboratorial de toxinfecção alimentar e para o controle de qualidade. O objetivo principal deste trabalho foi a padronização de ensaio imunoenzimático-ELISA para detecção de Salmonella Enteritidis em alimentos. O ensaio utilizou anticorpos policlonais para flagelina produzidos em coelho. O anti-soro apresentou pouca reação cruzada com os sorotipos de Salmonella e as diferentes espécies de enterobactérias testadas. A sensibilidade do ensaio foi de 10(4) células/mL, quando testado em cultivo puro. O conjugado peroxidase manteve-se estável durante dois meses a 4ºC e o seu uso deve ser exclusivamente durante este tempo. O ensaio padronizado apresentou simplicidade e rapidez, com sensibilidade de 1 célula/25g de maionese de batata e cenoura, após enriquecimento em água peptonada tamponada durante 24 horas a 37°C, sem necessidade de enriquecimento seletivo.

Detecção de disfunção renal através da dosagem de creatinina em amostra de gota de sangue seca no papel filtro

Resumo Introdução: A identificação precoce da doença renal crônica (DRC) por meio de amostras de sangue e urina é preconizada em populações de risco devido à elevada morbimortalidade. Objetivo: Apresentamos um teste simples e inovador para dosar a creatinina coletada em gota de sangue seca em papel filtro (PF). Métodos: Cento e seis pessoas em risco de DRC foram rastreadas com avaliação de dados clínicos, exame físico e coleta de sangue de forma convencional e em PF. Com os dados obtidos, foi estimada a taxa de filtração glomerular (e-TFG). Foi considerado diagnóstico de DRC a e-TFG < 60 ml/min. Resultados: A idade dos participantes foi de 57 ± 12 anos, 78 (73,5%) eram mulheres, 43 brancos (40,5%), 36 pardos (34%) e 27 negros (25,5%). O índice de massa corpórea foi de 29,5 ± 6,9 kg/m2, a pressão arterial sistólica foi de 125 mmHg (120-140 mmHg) e a pressão arterial diastólica de 80 mmHg (70-80 mmHg). A sensibilidade pela equação CKD-EPI foi de 94%, a especificidade 55%, o valor preditivo positivo foi de 94%, o valor preditivo negativo de 55% e a acurácia de 90%. A estatística de Bland-Altman mostrou que as diferenças entre os valores de creatinina dos dois testes estão numa faixa relativamente estreita (+ 0,68 mg/dL e -0,55mg/dL) para um desvio padrão de ± 1,96 mg/dL. Conclusão: A dosagem da creatinina coletada em gota de sangue em PF é um teste diagnóstico simples de ser realizado, pouco invasivo e que apresentou uma ótima acurácia, podendo ser útil para rastrear DRC.

O potencial da PCR em tempo real no diagnóstico da infecção por helicobacter pylori

H. pylori é um microrganismo responsável por gastrites e implicado, em associação com outros factores, na úlcera gastroduodenal e no cancro gástrico. O diagnóstico da infecção por microrganismo pode realizar-se recorrendo a métodos invasivos através da obtenção de uma biópsia gástrica obtida por endoscopia digestiva alta e a métodos não invasivos. Nenhum dos métodos, desenvolvido até hoje, constitui o método ideal. Todos eles possuem as suas vantagens e desvantagens consoante a situação em que são aplicados. A reacção de polimerização em cadeia (PCR) conduziu a uma modificação fundamental no campo da biologia molecular, abrindo novos horizontes nas ciências médicas e biológicas. Apesar da cultura de H. pylori a partir de biópsia gástrica continuar a ser o método de referência para o diagnóstico da infecção por esta bactéria, ela apresenta inconvenientes que podem ser ultrapassados pela utilização da PCR, como sejam o longo período para a obtenção de resultados e o respeito de condições estritas de transporte da biópsia gástrica. Recentemente foi desenvolvido um protocolo baseado no principio da PCR em tempo real, utilizando o aparelho LightCycler Roche Diagnostics. Este protocolo permite a obtenção de um resultado de detecção da presença de H. pylori na biópsia gástrica assim como do seu perfil de susceptibilidade aos macrólidos. A PCR em tempo real é dotada de uma grande sensibilidade e especificidade, rapidez de obtenção de resultados o que aliado à sua capacidade de detecção de mutações responsáveis pela resistência dos microrganismos aos antibióticos faz com que esta técnica seja a metodologia do futuro no diagnóstico das doenças infecciosas.

Tecnologia de iplex massarray aplicado ao diagnóstico de miocardiopatia hipertrófica

A miocardiopatia hipertrófica (MH) é a doença cardíaca genética mais comum, afectando 1:500 indivíduos, apresentando um padrão de transmissão autossómico dominante, com mutações associadas a genes sarcoméricos e não sarcoméricos. A MH apresenta uma variedade de manifestações clínicas, desde indivíduosassintomáticos a indivíduos que manifestam uma progressão da severidade dos sintomas, podendo nalguns casos ocorrer morte súbita. O diagnóstico clínico é realizado por Electrocardiograma e Ecocardiograma. O diagnóstico genético baseia-se na Sequenciação Automática (SA) dos 5 principais genes sarcoméricos MYBPC3, MYH7, TNNT2, TNNI3 e MYL2, sendo considerada uma metodologia bastante dispendiosa e demorada e que não permite a identificação de mutações em cerca de 1/3 dos individuos. A Genotipagem por iPLEX MassARRAY revela-se uma boa alternativa à SA no diagnóstico genético de MH, uma vez que permite a análise de várias amostras em simultâneo, para um elevado número de mutações, num único ensaio, com uma maior rentabilidade de tempo e recursos. Este trabalho teve como objectivo a optimização e a validação desta metodologia, na detecção de 541 mutações em 33 genes, tendo-se verificado que 29 % das reacções multiplex necessitam de ser revistas, quer pelo desenho de novos conjuntos de primers, quer pela sua relocalização no chip.

Diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana utilizando a saliva coletada com swab

As leishmanioses caracterizam-se por um espectro de doenças distribuídas endemicamente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. A obtenção de material biológico para análise diagnóstica apresenta cuidados cruciais ao paciente, por se tratar de um processo invasivo, passível de inflamação, e podendo haver reativação da doença, em alguns casos. Diante do avanço das técnicas moleculares e da utilização de alguns fluidos biológicos para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), cogitou-se a possibilidade da identificação de DNA de Leishmania spp. em saliva através do método de coleta de swab, sendo contribuinte para o avanço no diagnóstico laboratorial. Assim, o propósito do estudo foi a identificação de DNA de Leishmania spp. a partir do diagnóstico molecular. Foram incluídos no estudo os pacientes que apresentaram lesões ativas, diagnósticos clínicos para LTA, antecedentes epidemiológicos compatíveis e não possuíam lesões cutâneo mucosas. O diagnóstico laboratorial envolveu a abordagem parasitológica através da pesquisa direta do parasito em amostras escarificadas de lesões, enquanto que o molecular compreendeu a extração do DNA das amostras de biópsia e swab salivar, seguidas da reação de PCR convencional (cPCR) e PCR em tempo real (qPCR). Foram investigados 40 pacientes com LTA havendo ocorrência de DNA do parasito em 10 amostras de saliva com cPCR, e 36 amostras utilizando qPCR. Em 28 amostras de biópsias também foi possível a detecção do DNA de Leishmania spp. e em 35 amostras de escarificado de lesão foram encontradas formas amastigotas do parasito, através de pesquisa direta. Na comparação entre os métodos propostos, a biópsia apresentou uma média de 50 por cento de compatibilidade em relação a cPCR e 67,5 por cento para a qPCR. A análise comparativa observou entre o diagnóstico parasitológico e os diagnósticos moleculares uma concordância de 32,5 por cento (14/40) em relação a cPCR, enquanto que a qPCR obteve 75,5 por cento (31/40) de concordância. Considerando a sensibilidade das técnicas de PCR utilizadas e o procedimento de coleta, através de swab advindo de fluidos salivares, os resultados demonstram a viabilidade do método de coleta de Leishmania spp. como uma nova abordagem diagnóstica auxiliar para a LTA, com benefícios à saúde do paciente

Otimização da RT-PCR Multiplex para detecção de vírus dengue em amostras de Aedes aegypti infectados artificialmente

A dengue é a mais importante doença viral transmitida por mosquitos, no que diz respeito à morbidade e mortalidade, que afeta os seres humanos. Este vírus é transmitido pelos vetores Aedes albopictus e Aedes aegypti, este último é o principal vetor nas Américas. O controle da doença se baseia na vigilância laboratorial e vigilância entomológica. A vigilância laboratorial visa aprimorar a capacidade do diagnóstico, detectando precocemente a circulação viral e monitorando os sorotipos circulantes. Dentro deste tipo de vigilância, a RT-PCR é um método bastante usado no diagnóstico da doença em humanos e mosquitos, porém, a má conservação do material pode comprometer a integridade do RNA e trazer resultados falso-negativos. O desenvolvimento de melhores métodos de vigilância do vírus dengue (DENV) em mosquitos é de grande valor para os programas de controle. Desta maneira, o presente projeto visou otimizar a técnica de RT-PCR Multiplex para detecção de DENV em amostras de Ae. aegypti infectadas artificialmente pelo vírus. Primers que amplificam uma região de 80 pb do gene rpL8 de mosquito foram desenhados no site Primer3 e avaliados na ferramenta online Multiple Primer Analyzer, junto com primers que amplificam os sorotipos DENV. Não houve competição de primers e foi observado bandas distintas no gel de agarose. Foi avaliado o efeito de diferentes formas de preservação do material genético das amostras (RNAlater®, freezer -80°C e nitrogênio líquido) por 7 dias, onde não houve diferenças significativas em relação à integridade do RNA. O efeito de diferentes formas de extração de RNA (Kit da QIAGEN® , TRIzol® e Chomczymski-Sacchi) também foi avaliado e o método ChomczymskiSacchi obteve o melhor desempenho. A otimização desta técnica permitirá uma maior confiabilidade nos resultados, já que além da detecção dos sorotipos, haverá uma confirmação da qualidade do RNA, aprimorando a capacidade do diagnóstico e auxiliando a prevenção e controle da transmissão da dengue.

Estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na leishmaniose visceral

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. O trabalho teve como objetivo avaliar estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na LV, que compreenderam a avaliação da eficiência de diferentes métodos de extração de DNA em amostras de urina; a análise do uso da Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para a detecção do DNA de Leishmania infantum na referida amostra; e a padronização de uma reação duplex qPCR para a detecção simultânea do DNA de L. infantum e do gene G3PD (controle endógeno). Depois da escolha do protocolo de extração de DNA mais apropriado, e após a otimização e a análise de reprodutibilidade, uma qPCR em urina foi padronizada. Em paralelo, após o desenho e a síntese de sondas TaqMan® compatíveis com os sistemas LINF 1B e G3PD1, após otimização e análise de reprodutibilidade, uma duplex qPCR em sangue também foi padronizada. Para avaliação dos protocolos desenvolvidos foram utilizadas técnicas de estatística descritiva. Para análise comparativa com técnicas clássicas de diagnóstico da LV utilizou-se Teste Qui Quadrado de independência ou Teste Exato de Fisher (p<0,05 e p<0,01, respectivamente). Como resultados, após otimização, o limite de detecção alcançado pela qPCR em urina utilizando o protocolo de extração selecionado (kit comercial) foi de 5 fg/microlitros de amostra 0,034 parasitos) A duplex qPCR em sangue alcançou um limite de detecção de 2x102 fg/microlitros de amostra 1,4 (ou ~ 1,4 parasito), após a otimização. A partir dos dados estatísticos obtidos, pôde-se analisar alta concordância percentual entre a qPCR e urina e o conjunto de critérios diagnósticos (sorologia rK39 + qPCR em sangue), bem como entre a duplex qPCR em sangue e a qPCR em sangue, para os Grupos 01 (pacientes com suspeita de LV) e 02 (pacientes HIV positivos co-infectados ou não). Como um conjunto de critérios, os dois novos ensaios obtiveram excelentes concordâncias com o conjunto de técnicas clássicas: 88,89 por cento e 94,74 por cento para os Grupos 01 e 02, respectivamente. Não houve diferenças estatísticas significativas entre os testes. Pôde-se concluir que ambos os ensaios mostraram bom potencial para a incorporação, após validação, ao diagnóstico da LV; em conjunto ou individualmente (quando necessário), trazendo mais conforto, praticidade, confiabilidade e rapidez ao diagnóstico definitivo da patologia

Avaliação de duas técnicas de reação em cadeia da polimerase na detecção do Mycobacterium tuberculosis em diferentes amostras biológicas

A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis e que permanece como um importante problema de saúde pública mundial, sendo a TB pulmonar a forma mais comum de apresentação da doença. O diagnóstico precoce e tratamento adequado são essenciais para a eficácia dos programas públicos de controle da TB. Novos metodologias mais rápidas, sensíveis e específicas, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), vem sendo propostas no diagnóstico da doença. O objetivo desse estudo foi avaliar o desempenho de duas PCR, a PCR em tempo real (qPCR) e a Nested PCR em único tubo (STNPCR), em diferentes amostras biológicas, no diagnóstico da tuberculose pulmonar, além de compará-las com as metodologias convencionais (baciloscopia e cultura) e entre si. Para isso foram analisados 125 pacientes que tiveram amostras de sangue (125 amostras de plasma e 116 amostras de PBMC), urina (n=125) e escarro (n=125) coletadas, totalizando a análise de 491 amostras biológicas. Amostras de escarro e urina foram descontaminadas pelo método de Petroff NAOH 4 por cento modificado e semeadas em meio de cultura Lõwenstein-Jensen (LJ), enquanto as amostras de sangue eram separadas em plasma e PBMC. Após processamento, deu-se a extração de DNA através do kit comercial da Qiagen seguida de amplificação pelas duas metodologias de PCR. Para análise estatística calculou-se a sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo e índice kappa das técnicas. A STNPCR apresentou, em amostras de sangue, sensibilidade de 26,3 por cento e especificidade de 97,7 por cento. Em amostras de urina observou-se uma S = 7,9 por cento e E = 98,9 por cento e em escarro S = 21,1 por cento e E = 98,9 por cento. Quando analisadas as asmotras em paralelo, a sensibilidade da STNPCR foi igual a 44,7 por cento enquanto sua especificidade foi 97,7 por cento. Já a qPCR, em amostras de sangue, obteve sensibilidade igual a 26,3 por cento e especificidade de 95,4 por cento. Em amostras de urina a sensibilidade obtida foi 47,4 por cento e a especificidade 79,3 por cento e, em escarro, S = 36,8 por cento e E = 95,4 por cento. Quando analisada em paralelo, a sensibilidade da qPCR foi 65,8 por cento e a especificidade foi 79,3 por cento. A baciloscopia de escarro apresentou sensibilidade de 41,7 por cento e especificidade de 100 por cento, enquanto as culturas em urina e escarro apresentaram sensibilidade e especificidade, respectivamente, de 10,5 por cento e 100 por cento e 60,5 por cento e 96,6 por cento. Pode-se concluir que a qPCR apresentou melhor desempenho quando comparada à STNPCR e também bom desempenho quando comparada às metodologias convencionais, e que quando analisa-se mais de um tipo de amostras biológica, a eficácia das técnicas é aumentada. Espera-se que com a utilização dessa técnica molecular, seja possível a melhor elucidação dos casos de TB pulmonar, promovendo maior taxa de tratamento dos pacientes e menor risco de transmissão da doença

Reprodutibilidade e validade In Vivo e In Vitro da inspeção visual associada ao exame radiográfico interproximal para a detecção de lesões de cárie na superfície oclusal de molares decíduos

O objetivo do presente estudo foi comparar os diagnósticos de lesões de cárie oclusal de molares decíduos obtidos in vivo e in vitro, a partir da inspeção visual associada à radiografia interproximal e avaliar in vivo e in vitro a efetividade destes exames para a detecção de lesões de cárie na superfície oclusal de molares decíduos. A amostra foi constituída de 52 molares decíduos superiores e inferiores. Os pacientes foram radiografados com posicionadores que possuíam os registros das mordidas em acrílico dos dentes posteriores aos dentes que seriam examinados. Moldagens dos hemiarcos foram obtidas com silicona de adição. O exame visual associado ao radiográfico da superfície oclusal dos molares decíduos foi realizado. Os dentes foram extraídos e posicionados nas moldagens para obtenção de modelos de gesso simulando as condições in vivo. Os posicionadores com as mordidas em acrílico foram novamente utilizados para as radiografias in vitro. O exame clínico associado ao radiográfico foi repetido in vitro pelo mesmo examinador, depois de em média 120 dias. Os dentes foram avaliados no estereomicroscópio para a obtenção dos diagnósticos definitivos. Através do teste de Wilcoxon, não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os exames in vivo e in vitro (p = 0,356). Nas análises de todas as lesões, a sensibilidade foi de 0,95 in vivo e in vitro e a especificidade foi de 0,75 in vivo e 1 in vitro. Quando apenas as lesões em dentina foram validadas, a sensibilidade foi de 0,80 in vivo e in vitro e a especificidade foi de 0,77 in vivo e 0,83 in vitro. Assim, os resultados confirmam que os estudos de diagnóstico de cárie em condições laboratoriais são viáveis e possuem aplicabilidade clínica. Os exames associados foram considerados efetivos na detecção de lesões de cárie na superfície oclusal de molares decíduos in vivo e in vitro.

Comparação entre os métodos de coloração panótico rápido e giemsa para o diagnóstico de protozoários do gênero Babesia (Starcovici, 1893) e de riquétsias do gênero Ehrlichia (Ehrlich, 1888) em cães (Canis familiaris) no município de Porto Alegre, RS, Brasil.

O trabalho realizado determinou a freqüência dos gêneros Babesia e Ehrlichia, em 250 caninos com suspeita clínica de hemoparasitose, atendidos no Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (HCV–UFRGS), clínicas e hospitais veterinários particulares. Foi analisada a influência da faixa etária e do gênero dos animais na positividade, assim como comparadas as colorações de Giemsa e Panótico Rápido. A pesquisa dos parasitas no sangue de caninos foi realizada através de esfregaços sangüíneos corados pelos métodos Giemsa e Panóptico Rápido. Das 250 amostras analisadas, 45 (18%) foram positivas para hemoparasitas, sendo que 7 (3%) eram animais com idade igual ou inferior a 1 ano (grupo I) e 38 (15%) animais a partir de 1 ano de idade (grupo II). O Teste Exato de Fisher aplicado aos dados revelou não haver diferença significativa entre os resultados encontrados nos animais do grupo I e do grupo II. A Odds ratio calculada para os dois grupos foi igual a 2,142. Os resultados obtidos através da metodologia proposta em função do gênero dos 250 animais pesquisados, envolveram 144 fêmeas, sendo 29 positivas e 106 machos, sendo 16 positivos. O Teste Exato de Fisher aplicado aos dados revelou também não haver diferença significativa entre os resultados encontrados entre machos e fêmeas de todas as idades. A Odds ratio calculada a partir dos dados encontrados foi igual a 0,7050. Em relação aos resultados obtidos com as colorações utilizadas, das 250 amostras analisadas, 26 amostras foram positivas com o kit Panótico Rápido, sendo 19 (7,6%) positivas para Ehrlichia spp e 7 (2,8%) para Babesia spp. Com a coloração de Giemsa, obteve-se 22 amostras positivas: 21 (8,4%) para Babesia spp e 1 (0,4%) para Ehrlichia spp. Apenas 3 amostras (1,2%) apresentaram-se positivas para Babesia spp nas duas colorações e nenhuma amostra foi positiva para Ehrlichia spp com as duas colorações. O teste de Mc Nemar aplicado a estes dados revelou que houve diferença significativa em relação às amostras positivas para Babesia spp pela coloração de Giemsa e pelo Panótico Rápido. A porcentagem de co-positividade e co-negatividade para as duas colorações foi de 14,3% e 98,2%, respectivamente, perfazendo uma porcentagem de concordância total de 91,2%, enquanto o valor Kappa calculado foi de 0,18. O teste de Mc Nemar apresentou uma diferença extremamente significativa nos esfregaços de animais positivos para Ehrlichia spp com as duas colorações utilizadas. A porcentagem de co-positividade e co-negatividade para as duas colorações foi de 0% e 92,3%, respectivamente, perfazendo uma porcentagem de concordância total de 92%, enquanto o valor Kappa calculado foi de 0 (zero). Com base nesses resultados, pode-se concluir que 18% dos animais analisados foram positivos para os hemoparasitos Babesia ou Ehrlichia e que tanto a variável gênero quanto a idade não apresentaram associação com a positividade. Além disso, o corante de Giemsa mostrou-se mais eficiente para o diagnóstico de babesiose canina, enquanto o kit Panótico Rápido foi mais eficiente para a detecção de erliquiose canina.

Detecção radiográfica de defeitos ósseos incipientes no periápice

Esta dissertação é apresentada sob a forma de quatro artigos. O artigo I avaliou a concordância e a acurácia no diagnóstico da situação do periápice de molares e prémolares inferiores portadores ou não de patologia periapical. Quarenta radiografias periapicais foram selecionadas, vinte de dentes com vitalidade pulpar e sem radiolucências periapicais e vinte de dentes com necrose pulpar. As radiografias foram digitalizadas em scanner no modo 8 bits, 300 dpi e armazenadas no formato JPEG 12. As imagens digitalizadas foram apresentadas no formato de slides com fundo preto no programa PowerPoint, sendo projetadas em equipamento multimídia para dois grupos de dez observadores, estudantes de pós-graduação de uma mesma instituição de ensino, simultaneamente, com repetição de 20% dos casos. Os observadores apresentaram ampla variação do percentual de concordância entre diagnósticos repetidos, contudo, quando agrupados por especialidade, endodontistas e radiologistas apresentaram percentuais de concordância de 62,50 e 66,25%, respectivamente. Na análise da concordância interobservadores, ambos os grupos apresentaram desempenho semelhante, sendo este superior entre os alunos de radiologia (Kendall´s W= 0,816 e 0,662 respectivamente). Em relação à especificidade, observou-se desempenho idêntico para os dois grupos (70 a 95%), contudo os alunos de radiologia apresentaram sensibilidade ligeiramente superior (70 a 95%). O artigo II verificou, in vitro, se é possível medir com confiabilidade, utilizando a tomografia computadorizada, a distância entre as corticais ósseas e os ápices dentários de molares e pré-molares em mandíbulas humanas secas, além de determinar a relação de proximidade, dos dois grupos, com as corticais. As imagens das peças ósseas foram obtidas por tomografia computadorizada. A partir delas mensurações foram realizadas, por quatro observadores, três não calibrados (A, B e C) e um calibrado (D). A concordância interexaminador, para os observadores A, B e C, assim como a intra para o observador D foram calculadas por meio do Teste de Concordância de Kendall. A partir das médias geradas (observador D) foi calculada a comparação entre os grupos de ápices e as medidas, utilizando os Testes Não-Paramétricos de Kruskal Wallis e Wilcoxon, ambos com a=5%. Uma boa concordância tanto inter quanto intra-examinador foi observada. A tomografia computadorizada mostrou-se reprodutível para a obtenção da distância entre os ápices dentários e as corticais ósseas, tanto na avaliação inter quanto intra-observador. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas quanto á posição dos ápices de raízes de pré-molares e de molares, contudo os prémolares apresentaram seus ápices significativamente mais próximos da cortical vestibular do que da lingual. O artigo III avaliou o desempenho diagnóstico de radiografias periapicais em diferentes estágios de perda óssea (leve, moderada e severa), digitalmente simulada na região apical. A partir de radiografias trinta ápices dentários de pré-molares e molares inferiores sem radiolucências foram selecionados. As radiografias foram digitalizadas em scanner no modo 8 bits, 300 dpi e armazenadas no formato JPEG 12. Na imagem inicial (original) os sítios apicais selecionados foram demarcados por um quadrado, as mesmas foram digitalmente reproduzidas seis vezes e numeradas em ordem crescente, formando sete conjuntos. A perda óssea foi digitalmente simulada com as ferramentas lápis (modelo mecânico) e spray (modelo químico), com tinta preta, em intensidade de 3%, 5% e 8%. Os pares de imagens (inicial e experimental) e subtrações foram avaliados por três observadores, com repetição de 20% dos casos. O Coeficiente de Correlação de Spearman e o Teste Não Paramétrico de Wilcoxon mostraram uma boa concordância entre a primeira e a segunda medida para os dois modelos, com exceção de um observador. Através da análise das curvas ROC (p> 0,05) observou-se diferença significativa entre os métodos para ambos os modelos nas intensidades de 3% e 5%. Não houve diferença significativa para a intensidade de 8%. A subtração digital qualitativa mostrou desempenho significativamente melhor do que a avaliação de pares de radiografias para ambos os modelos de reabsorção simulada nas intensidades leve e moderada. O artigo IV avaliou, in vitro, os diagnósticos obtidos de pares de radiografias, subtração radiográfica de imagens digitais diretas e digitalizadas em defeitos ósseos periapicais incipientes criados por aplicação de solução ácida. Em quarenta sítios apicais de mandíbulas humanas secas foram criados defeitos ósseos, por meio da aplicação de ácido perclórico 70%, nos tempos 6, 10, 24, 48 e 54 horas. As radiografias convencionais e as imagens digitais diretas foram obtidas duas vezes no tempo zero e, seqüencialmente, antes de cada nova aplicação de ácido. As incidências foram padronizadas fixando os elementos geométricos. As radiografias foram digitalizadas em scanner no modo 8 bits, 300 dpi e armazenadas, assim como as digitais diretas, no formato TIFF. O programa Imagelab foi utilizado para a subtração das imagens digitais indiretas e diretas. A subtração radiográfica das imagens digitalizadas e os pares de imagem digital foram avaliados por um observador experiente, sendo 20% repetidas durante o exame. A análise quantitativa da subtração radiográfica de imagens diretas foi realizada no programa ImageTool. Os resultados das análises qualitativa e quantitativa foram avaliados por meio da ANOVA, sendo a primeira complementada pelo Teste de Comparações Múltiplas Dunnett T3 e a segunda pelo Teste de Tukey, ambos com a=5%. O observador apresentou coeficiente de Kappa = 0,739 para subtração e 0,788 para os pares de imagem. No tempo 0 houve acerto de diagnóstico em 100 e 90% dos casos para subtração e pares de imagem, respectivamente. Nos tempo 6 e 10/24 foram identificadas, para subtração, alterações em 20 e 25% dos casos e para os pares de imagem em 2,5 e 10% dos casos. A proporção de acertos aumentou significativamente nos tempos 48 e 54 horas, tanto para subtração – 80 e 82,5% – quanto para os pares de imagem – 47,5 e 52,5%. A ANOVA evidenciou diferenças estatisticamente significativas entre as áreas controle nos tempos 0/6 e 48/54. Comparando áreas teste e controle, observou-se que aquela apresentou valores médios de densidade óptica significativamente menores nos tempos 24, 48 e 54. Conclui-se que tanto a avaliação qualitativa como a quantitativa de imagens de subtração apresentaram melhor desempenho que a avaliação dos pares de imagem na detecção de defeitos incipientes no periápice.

Caracterização parcial de um fragmento e detecção por RT-PCR de Rice Stripe Necrosis Virus

O enrolamento do arroz é uma doença viral emergente no Brasil causada pelo Rice stripe necrosis virus (RSNV) que é transmitido pelo protozoário Polymyxa graminis. RSNV é um membro do gênero Benyvirus com genoma dividido em 4 RNAs de fita simples no sentido positivo (ssRNA +). Em função da falta de conhecimento sobre a seqüência de nucleotídeos do seu genoma, a detecção de RSNV através de métodos moleculares não é utilizada. O objetivo deste trabalho foi identificar seqüências do genoma de RSNV que possibilitassem sua detecção em plantas de arroz através da técnica de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). As seqüências do genoma foram identificadas a partir de clones de uma biblioteca de cDNAs obtidos de uma amostra do vírus parcialmente purificado. Os clones que hibridizaram com sondas sintetizadas a partir de RNA de plantas infectadas com RSNV foram seqüenciados e comparados às seqüências do GenBank. Um fragmento de 957 nt da extremidade 3’ da fita de um dos 4 RNAs genômicos de RSNV foi obtido. A análise da seqüência nucleotídeos desse fragmento não revelou qualquer similaridade com seqüências conhecidas, tampouco indicou uma possível função. Um par de oligonucleotídeos iniciadores foi desenhado a partir de um clone que potencialmente contém uma seqüência de RSNV. A especificidade e a sensibilidade da RT-PCR utilizando esse par de oligonucleotídeos iniciadores, bem como sua eficiência na detecção do vírus em diferentes partes da planta de arroz, foram avaliadas. Os resultados indicam que a RT-PCR é específica para RSNV e pode detectar o vírus em tecido oriundo das raízes, do colo e de folhas com distorção. Comparada ao diagnóstico da doença através da observação de sintomas e de estruturas do vetor, a RT-PCR é uma ferramenta confiável para a diagnose do enrolamento do arroz.