Free field and parafermionic realizations of twisted su(3)(k)((2)) current algebra

Free field and twisted parafermionic representations of twisted su(3)(k)((2)) current algebra are obtained. The corresponding twisted Sugawara energy-momentum tensor is given in terms of three (beta, gamma) pairs and two scalar fields and also in terms of twisted parafermionic currents and one scalar field. Two screening currents of the first kind are presented in terms of the free fields.

Ion transport induced by proteinase-activated receptors (PAR2) in colon and airways

Protease-activated receptors type 2 (PAR2) are activated by serine proteases like trypsin and mast cell tryptase. The function and physiological significance of PAR2 receptors is poorly understood, but recent studies suggest a role during inflammatory processes in both airways and intestine. PAR2 receptors are also likely to participate in the control of ion transport in these tissues. We demonstrate that stimulation of PAR2 in airways and intestine significantly enhanced ion transport. Trypsin induced CI- secretion in both airways and intestine when added to the basolateral but not to the luminal side of these tissues. In both airways and intestine, stimulation of ion transport was largely dependent on the increase in intracellular Ca2+. Effects of trypsin were largely reduced by basolateral bumetanide and barium and by trypsin inhibitor. Thrombin, an activator of proteinase-activated receptors types 1, 3, and 4 had no effects on equivalent short-circuit current in either airways or intestine. Expression of PAR2 in colon and airways was further confirmed by reverse transcription-polymerase chain reaction. We postulate that these receptors play a significant role in the regulation of electrolyte transport, which might be important during inflammatory diseases of airways and intestine.

Activation of ion secretion via proteinase-activated receptor-2 in human colon

Proteinase-activated receptor (PAR) type 2 (PAR-2) has been shown to mediate ion secretion in cultured epithelial cells and rat jejunum. With the use of a microUssing chamber, we demonstrate the role of PAR-2 for ion transport in native human colonic mucosa obtained from 30 normal individuals and 11 cystic fibrosis (CF) patients. Trypsin induced Cl- secretion when added to the basolateral but not luminal side of normal epithelia. Activation of Cl- secretion by trypsin was inhibited by indomethacin and was further increased by cAMP in normal tissues but was not present in CF colon, indicating the requirement of luminal CF transmembrane conductance regulator. Effects of trypsin were largely reduced by low Cl-,by basolateral bumetanide, and in the presence of barium or clotrimazole, but not by tetrodotoxin. Furthermore, trypsin-induced secretion was inhibited by the Ca2+-ATPase inhibitor cyclopiazonic acid and in low-Ca2+ buffer. The effects of trypsin were almost abolished by trypsin inhibitor. Thrombin, an activator of PAR types 1, 3, and 4, had no effects on equivalent short-circuit currents. The presence of PAR-2 in human colon epithelium was confirmed by RT-PCR and additional experiments with PAR-2-activating peptide. PAR-2-mediated intestinal electrolyte secretion by release of mast cell tryptase and potentiation of PAR-2 expression by tumor necrosis factor-alpha may contribute to the hypersecretion observed in inflammatory processes such as chronic inflammatory bowel disease.

Current classification and family-group names in Staphyliniformia (Coleoptera) / Alfred F. Newton, Jr., Margaret K. Thayer.

n.s. no.67(1992)

T-type Ca2+ channels, SK2 channels and SERCAs gate sleep-related oscillations in thalamic dendrites.

T-type Ca2+ channels (T channels) underlie rhythmic burst discharges during neuronal oscillations that are typical during sleep. However, the Ca2+-dependent effectors that are selectively regulated by T currents remain unknown. We found that, in dendrites of nucleus reticularis thalami (nRt), intracellular Ca2+ concentration increases were dominated by Ca2+ influx through T channels and shaped rhythmic bursting via competition between Ca2+-dependent small-conductance (SK)-type K+ channels and Ca2+ uptake pumps. Oscillatory bursting was initiated via selective activation of dendritically located SK2 channels, whereas Ca2+ sequestration by sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases (SERCAs) and cumulative T channel inactivation dampened oscillations. Sk2-/- (also known as Kcnn2) mice lacked cellular oscillations, showed a greater than threefold reduction in low-frequency rhythms in the electroencephalogram of non-rapid-eye-movement sleep and had disrupted sleep. Thus, the interplay of T channels, SK2 channels and SERCAs in nRt dendrites comprises a specialized Ca2+ signaling triad to regulate oscillatory dynamics related to sleep.

Molecular basis of interaction between Na,K-ATPase and FXYD proteins.

Résumé au large public Notre corps est constitué de différents types de cellules. La condition minimale ou primordiale pour la survie des cellules est d'avoir de l'énergie. Cette tâche est assumée en partie par une protéine qui se situe dans la membrane de chaque cellule. Nommé Na, K¬ATPase ou pompe à sodium, c'est une protéine pressente dans toutes les cellules chez les mammifères est composée de deux sous-unités, α et β. En transportant 3 ions de sodium hors de la cellule et 2 ions de potassium à l'intérieur de la cellule, elle transforme l'énergie chimique sous forme de l'ATP en énergie motrice, qui permet aux cellules par la suite d'échanger des matériaux entre l'espace intracellulaire et extracellulaire ainsi que d'ingérer des nutriments provenant de son environnement. Le manque de cette protéine chez la souris entraîne la mort de l'embryon. Des défauts fonctionnels de cette protéine sont responsables de plusieurs maladies humaines comme par exemple, un type de migraine. En dehors de sa fonction vitale, cette protéine est également engagée dans diverses activités physiologiques comme la contractilité musculaire, l'activité nerveuse et la régulation du volume sanguin. Vue l'importance de cette protéine, sa découverte par Jens C. Skou en 1957 a été honorée d'un Prix Noble de chimie quarante ans plus tard. Depuis lors, nous connaissons de mieux en mieux les mécanismes de fonctionnement de la Na, K-ATPase. Entre autre, sa régulation par une famille de protéines appelées protéines FXYD. Cette famille contient 7 membres (FXYD 1-7). L'un d'entre eux nommé FXYD 2 est lié à une maladie héréditaire connue sous le nom de hypomagnesemia. Nous disposons actuellement d'informations concernant les conséquences de la régulation par les protéines FXYD sur activité de la Na, K-ATPase, mais nous savons très peu sur le mode d'interaction entre les protéines FXYD et la Na, K-ATPase. Dans ce travail de thèse, nous avons réussi à localiser des zones d'interaction dans la sous- unité a de la Na, K-ATPase et dans FXYD 7. En même temps, nous avons déterminé un 3ème site de liaison spécifique au sodium de la Na, K-ATPase. Une partie de ce site se situe à l'intérieur d'un domaine protéique qui interagit avec les protéines FXYD. De plus, ce site a été démontré comme responsable d'un mécanisme de transport de la Na, K-ATPase caractérisé par un influx ionique. En conclusion, les résultats de ce travail de thèse fournissent de nouvelles preuves sur les régions d'interaction entre la Na, K-ATPase et les protéines FXYD. La détermination d'un 3ème site spécifique au sodium et sa relation avec un influx ionique offrent la possibilité 1) d'explorer les mécanismes avec lesquels les protéines FXYD régulent l'activité de la Na, ATPase et 2) de localiser un site à sodium qui est essentielle pour mieux comprendre l'organisation et le fonctionnement de la Na, K-ATPase. Résumé Les gradients de concentration de Na+ et de K+ à travers la membrane plasmatique des cellules animales sont cruciaux pour la survie et l'homéostasie de cellules. De plus, des fonctions cellulaires spécifiques telles que la reabsorption de Na dans le rein et le côlon, la contraction musculaire et l'excitabilité nerveuse dépendent de ces gradients. La Na, K¬ATPase ou pompe à sodium est une protéine membranaire ubiquitaire. Elle crée et maintient ces gradients en utilisant l'énergie obtenu par l'hydrolyse de l'adénosine triphosphate. L'unité fonctionnelle minimale de cette protéine se compose d'une sous-unité catalytique α et d'une sous-unité régulatrice β. Récemment, il a été montré que des membres de la famille FXYD, sont des régulateurs tissu-spécifiques de la Na, K-ATPase qui influencent ses propriétés de transport. Cependant, on connaît peu de chose au sujet de la nature moléculaire de l'interaction entre les protéines FXYD et la Na, K-ATPase. Dans cette étude, nous fournissons, pour la première fois, l'évidence directe que des résidus du domaine transmembranaire (TM) 9 de la sous-unité α de la Na, K-ATPase sont impliqués dans l'interaction fonctionnelle et structurale avec les protéines FXYD. De plus nous avons identifié des régions dans le domaine transmembranaire de FXYD 7 qui sont importantes pour l'association stable avec la Na, K-ATPase et une série de résidus responsables des régulations fonctionnelles. Nous avons aussi montré les contributions fonctionnelles du TM 9 de la Na, K-ATPase à la translocation de Na + en déterminant un 3ème site spécifique au Na+. Ce site se situe probablement dans un espace entre TM 9, TM 6 et TM 5 de la sous-unité α de la pompe à sodium. De plus, nous avons constaté que le 3ème site de Na + est fonctionnellement lié à un courant entrant de la pompe sensible à l'ouabaïne et activé par le pH acide. En conclusion, ce travail donne de nouvelles perspectives de l'interaction structurale et fonctionnelle entre les protéines FXYD et la Na, K-ATPase. En outre, les contributions fonctionnelles de TM 9 offrent de nouvelles possibilités pour explorer le mécanisme par lequel les protéines FXYD régulent les propriétés fonctionnelles de la Na, K-ATPase. La détermination du 3ème site au Na + fournit une compréhension avancée du site spécifique au Na + de la Na, K-ATPase et du mécanisme de transport de la Na, K-ATPase. Summary The Na+ and K+ gradients across the plasma membrane of animal cells are crucial for cell survival and homeostasis. Moreover, specific tissue functions such as Na+ reabsorption in kidney and colon, muscle contraction and nerve excitability depend on the maintenance of these gradients. Na, K-ATPase or sodium pump, an ubiquitous membrane protein, creates and maintains these gradients by using the energy from the hydrolysis of ATP. The minimal functional unit of this protein is composed of a catalytic α subunit and a regulatory β subunit. Recently, members of the FXYD family, have been reported to be tissue-specific regulators of Na, K-ATPase by influencing its transport properties. However, little is known about the molecular nature of the interaction between FXYD proteins and Na, K-ATPase. In this study, we provide, for the first time, direct evidence that residues from the transmembrane (TM) domain 9 of the α subunit of Na, K-ATPase are implicated in the functional and structural interaction with FXYD proteins. Moreover, we have identified regions in the TM domain of FXYD 7 important for the stable association with Na, K-ATPase and a stretch of residues responsible for the functional regulations. We have further revealed the functional contributions of TM 9 of the Na, K-ATPase α subunit to the Na+ translocation by determining a 3rd Na+-specific cation binding site. This site is likely in a space between TM 9, TM 6 and TM 5 of the a subunit of the sodium pump. Moreover, we have found that the 3rd Na+ binding site is functionally linked to an acidic pH- activated ouabain-sensitive inward pump current. In conclusion, this work gives new insights into the structural and functional interaction between FXYD proteins and Na, K-ATPase. Functional contributions of TM 9 offer new possibilities to explore the mechanism by which FXYD proteins regulate functional properties of Na, K-ATPase. The determination of the 3rd Na+ binding site provides an advanced understanding concerning the Na+ -specific binding site of Na, K-ATPase and the 3rd Na+ site related transport mechanism.

Cinética de absorção e eficiência nutricional de K+, Ca2+ e Mg2+ em plantas jovens de quatro clones de eucalipto

Modelos mecanísticos baseados em princípios de transporte de solutos pode ser de grande utilidade para prever os impactos do cultivo de florestas plantadas, por exemplo, com eucalipto sobre o capital e fluxo de nutrientes no solo. Dentre as variáveis de entrada demandadas por tais modelos, tem-se os valores das constantes Vmax, Km e Cmin da cinética de absorção iônica. Assim, os objetivos do presente trabalho foram determinar os valores de Vmax, Km e Cmin para K, Ca e Mg, bem como avaliar as respectivas eficiências nutricionais de clones de eucalipto. O estudo consistiu de três ensaios em solução nutritiva (um para cada cátion), sendo utilizadas mudas propagadas vegetativamente de um híbrido de E. grandis x E. urophylla (clone 1213) e de três híbridos de E. grandis (clones 7074, 57 e 129). Com base nos teores de cada um desses nutrientes nas soluções de depleção, em cada tempo de amostragem, no volume inicial e final de solução nos vasos e no peso de matéria fresca de raízes, foram obtidos os valores das constantes cinéticas. Para K, o clone 7074 apresentou o menor valor de Vmax em relação aos demais clones, os quais não diferiram entre si, e em relação ao Km e Cmin, os clones não diferiram estatisticamente. Para Ca, os clones estudados diferiram quanto ao valor de Vmax e Km, não diferindo, entretanto, para o Cmin. Os menores valores de Km para Mg foram verificados para os clones 57 e 7074, ou seja, as proteínas transportadoras de Mg na membrana plasmática das células radiculares apresentaram maior afinidade para esse nutriente. Contudo, os valores de Vmax e Cmin não diferiram entre os clones estudados. Diferenças na eficiência nutricional dos clones estudados quanto a K e a Ca foram devidas às diferenças na eficiência de absorção, e para Mg às diferenças na eficiência de absorção e de utilização.

Probabilidade de resposta da cana-de-açúcar à adubação potássica em razão da relação K+ (Ca2++Mg2+ )-0,5 do solo

O objetivo deste trabalho foi avaliar a probabilidade de resposta da produção de cana-de-açúcar à adubação potássica, em razão da relação K+ (Ca2++Mg2+ )-0,5 no solo. Foram compilados dados de 106 experimentos de adubação potássica na cana-de-açúcar. Em cada experimento foi registrado o ciclo de cultivo (cana-planta ou cana-soca), os teores de K, Ca e Mg do solo antes da adubação potássica, a relação K+ (Ca2++Mg2+ )-0,5, e se houve, ou não, resposta estatisticamente significativa da produção à adubação potássica. Foi utilizado o método estatístico de regressão logística, efetuado pelo procedimento CATMOD do Statistical Analysis System. A característica ciclo de cultivo foi eliminada do modelo, pois esta se apresentou como não-significativa no ajuste estatístico. A relação K+ (Ca2++Mg2+ )-0,5 do solo influenciou a probabilidade de resposta da produção de cana-de-açúcar à adubação potássica. À medida que a relação K+ (Ca2++Mg2+ )-0,5 aumentou, a probabilidade de resposta da produção de cana-de-açúcar à adubação potássica diminuiu. A relação K+ (Ca2++Mg2+ )-0,5 no solo foi classificada em baixa (<0,2547), média (0,2547 a 0,3349) e alta (>0,3349). A relação K+ (Ca2++Mg2+ )-0,5 no solo deve ser usada como mais um critério para orientar a adubação potássica na cultura da cana-de-açúcar.

Mitochondrial K+ transport and cardiac protection during ischemia/reperfusion

Mitochondrial ion transport, oxidative phosphorylation, redox balance, and physical integrity are key factors in tissue survival following potentially damaging conditions such as ischemia/reperfusion. Recent research has demonstrated that pharmacologically activated inner mitochondrial membrane ATP-sensitive K+ channels (mitoK ATP) are strongly cardioprotective under these conditions. Furthermore, mitoK ATP are physiologically activated during ischemic preconditioning, a procedure which protects against ischemic damage. In this review, we discuss mechanisms by which mitoK ATP may be activated during preconditioning and the mitochondrial and cellular consequences of this activation, focusing on end-effects which may promote ischemic protection. These effects include decreased loss of tissue ATP through reverse activity of ATP synthase due to increased mitochondrial matrix volumes and lower transport of adenine nucleotides into the matrix. MitoK ATP also decreases the release of mitochondrial reactive oxygen species by promoting mild uncoupling in concert with K+/H+ exchange. Finally, mitoK ATP activity may inhibit mitochondrial Ca2+ uptake during ischemia, which, together with decreased reactive oxygen release, can prevent mitochondrial permeability transition, loss of organelle function, and loss of physical integrity. We discuss how mitochondrial redox status, K+ transport, Ca2+ transport, and permeability transitions are interrelated during ischemia/reperfusion and are determinant factors regarding the extent of tissue damage.

Transient outward potassium current and Ca2+ homeostasis in the heart: beyond the action potential

Normal central nervous system development relies on accurate intrinsic cellular programs as well as on extrinsic informative cues provided by extracellular molecules. Migration of neuronal progenitors from defined proliferative zones to their final location is a key event during embryonic and postnatal development. Extracellular matrix components play important roles in these processes, and interactions between neurons and extracellular matrix are fundamental for the normal development of the central nervous system. Guidance cues are provided by extracellular factors that orient neuronal migration. During cerebellar development, the extracellular matrix molecules laminin and fibronectin give support to neuronal precursor migration, while other molecules such as reelin, tenascin, and netrin orient their migration. Reelin and tenascin are extracellular matrix components that attract or repel neuronal precursors and axons during development through interaction with membrane receptors, and netrin associates with laminin and heparan sulfate proteoglycans, and binds to the extracellular matrix receptor integrins present on the neuronal surface. Altogether, the dynamic changes in the composition and distribution of extracellular matrix components provide external cues that direct neurons leaving their birthplaces to reach their correct final location. Understanding the molecular mechanisms that orient neurons to reach precisely their final location during development is fundamental to understand how neuronal misplacement leads to neurological diseases and eventually to find ways to treat them.

Étude moléculaire des mécanismes d’action de potentiateurs du canal CFTR sur le canal KCa3.1

Les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires sécrètent du Cl- via le canal CFTR. La fibrose kystique est une maladie génétique fatale causée par des mutations de ce canal. La mutation la plus fréquente en Amérique du Nord, ∆F508, met en péril la maturation de la protéine et affecte les mécanismes d’activation du canal. Au cours des dernières années, plusieurs molécules ont été identifiées par criblage à haut débit qui peuvent rétablir l’activation de protéines CFTR mutées. Ces molécules sont nommées potentiateurs. Les canaux K+ basolatéraux, dont KCa3.1, jouent un rôle bien documenté dans l’établissement d’une force électromotrice favorable à la sécrétion de Cl- par CFTR dans les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires. Il a par exemple été démontré que l’application de 1-EBIO, un activateur de KCa3.1, sur des monocouches T84 résulte en une augmentation soutenue de la sécrétion de Cl- et que cette augmentation était réversible suite à l’application de CTX, un inhibiteur de KCa3.1(Devor et al., 1996). Dans le cadre d’une recherche de potentiateurs efficaces en conditions physiologiques et dans un contexte global de transport trans-cellulaire, il devient essentiel de considérer les effets des potentiateurs de CFTR sur KCa3.1. Une caractérisation électrophysiologique par la méthode du patch clamp et structurelle via l’utilisation de canaux modifiés par mutagenèse dirigée de différents potentiateurs de CFTR sur KCa3.1 fut donc entreprise afin de déterminer l’action de ces molécules sur l’activité de KCa3.1 et d’en établir les mécanismes. Nous présentons ici des résultats portant sur les effets sur KCa3.1 de quelques potentiateurs de CFTR possédant différentes structures. Un criblage des effets de ces molécules sur KCa3.1 a révélé que la genisteine, le SF-03, la curcumine et le VRT-532 ont des effets inhibiteurs sur KCa3.1. Nos résultats suggèrent que le SF-03 pourrait agir sur une protéine accessoire et avoir un effet indirect sur KCa3.1. La curcumine aurait aussi une action inhibitrice indirecte, probablement via la membrane cellulaire. Nos recherches sur les effets du VRT-532 ont montré que l’accessibilité au site d’action de cette v molécule est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1. L’absence d’effets inhibiteurs de VRT-532 sur le mutant constitutivement actif V282G indique que cette molécule pourrait agir via l’interaction CaM-KCa3.1 et nécessiter la présence de Ca2+ pour agir. Par ailleurs, un autre potentiateur de CFTR, le CBIQ, a des effets potentiateurs sur KCa3.1. Nos résultats en canal unitaire indiquent qu’il déstabilise un état fermé du canal. Nos travaux montrent aussi que CBIQ augmente la probabilité d’ouverture de KCa3.1 en conditions sursaturantes de Ca2+, ainsi que son affinité apparente pour le Ca2+. Des expériences où CBIQ est appliqué en présence ou en absence de Ca2+ ont indiqué que l’accessibilité à son site d’action est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1, mais que la présence de Ca2+ est nécessaire à son action. Ces résultats sont compatibles avec une action de CBIQ déstabilisant un état fermé du canal. Finalement, des expériences en Ba2+ nous ont permis d’investiguer la région du filtre de sélectivité de KCa3.1 lors de l’action de CBIQ et nos résultats pointent vers une action de CBIQ dans cette région. Sur la base de nos résultats nous concluons que CBIQ, un potentiateur de CFTR, aurait un effet activateur sur KCa3.1 via la déstabilisation d’un état fermé du canal à travers une action sur sa ‘gate’ au niveau du filtre de sélectivité. De plus, les potentiateurs de CFTR ayant montré des effets inhibiteurs sur KCa3.1 pourraient agir via la membrane ou via une protéine accessoire du canal ou sur l’interaction CaM-KCa3.1. Dans l’optique de traitements potentiels de la fibrose kystique, nos résultats indiquent que le CBIQ pourrait être un potentiateur efficace pusiqu’il est capable de trimuler à la fois KCa3.1 et CFTR. Par contre, dans les cas du VRT-532 et du SF-03, une inhibition de KCa3.1 pourraient en faire des potentiateurs moins efficaces.

Calmodulin/KCa3.1 channel interactions as determinant to the KCa3.1 Ca2+ dependent gating : theoretical and experimental analyses

Differentes études ont montré que la sensibilité au Ca2+ du canal KCa3.1, un canal potassique indépendant du voltage, était conférée par la protéine calmoduline (CaM) liée de façon constitutive au canal. Cette liaison impliquerait la région C-lobe de la CaM et un domaine de $\ikca$ directement relié au segment transmembranaire S6 du canal. La CaM pourrait égalment se lier au canal de façon Ca2+ dépendante via une interaction entre un domaine de KCa3.1 du C-terminal (CaMBD2) et la région N-lobe de la CaM. Une étude fut entreprise afin de déterminer la nature des résidus responsables de la liaison entre le domaine CaMBD2 de KCa3.1 et la région N-lobe de la CaM et leur rôle dans le processus d'ouverture du canal par le Ca2+. Une structure 3D du complexe KCa3.1/CaM a d'abord été générée par modélisation par homologie avec le logiciel MODELLER en utilisant comme référence la structure cristalline du complexe SK2.2/CaM (PDB: 1G4Y). Le modèle ainsi obtenu de KCa3.1 plus CaM prévoit que le segment L361-S372 dans KCa3.1 devrait être responsable de la liaison dépendante du Ca2+ du canal avec la région N-lobe de la CaM via les résidus L361 et Q364 de KCa3.1 et E45, E47 et D50 de la CaM. Pour tester ce modèle, les résidus dans le segment L361-S372 ont été mutés en Cys et l'action du MTSET+ (chargé positivement) et MTSACE (neutre) a été mesurée sur l'activité du canal. Des enregistrements en patch clamp en configuration ``inside-out`` ont montré que la liaison du réactif chargé MTSET+ au le mutant Q364C entraîne une forte augmentation du courant, un effet non observé avec le MTSACE. De plus les mutations E45A et E47A dans la CaM, ont empêché l'augmentation du courant initié par MTSET+ sur le mutant Q364C. Une analyse en canal unitaire a confirmé que la liaison MTSET+ à Q364C cause une augmentation de la probabilité d'ouverture de KCa3.1 par une déstabilisation de l'état fermé du canal. Nous concluons que nos résultats sont compatibles avec la formation de liaisons ioniques entre les complexes chargés positivement Cys-MTSET+ à la position 364 de KCa3.1 et les résidus chargés négativement E45 et E47 dans la CaM. Ces données confirment qu'une stabilisation électrostatique des interactions CaM/KCa3.1 peut conduire à une augmentation de la probabilité d'ouverture du canal en conditions de concentrations saturantes de Ca2+.

Epidermal growth factor-stimulated extravillous cytotrophoblast motility is mediated by the activation of PI3-K, Akt and both p38 and p42/44 mitogen-activated protein kinases

BACKGROUND: Trophoblast invasion is a temporally and spatially regulated scheme of events that can dictate pregnancy outcome. Evidence suggests that the potent mitogen epidermal growth factor (EGF) regulates cytotrophoblast (CTB) differentiation and invasion during early pregnancy. METHODS AND RESULTS: In the present study, the first trimester extravillous CTB cell line SGHPL-4 was used to investigate the signalling pathways involved in the motile component of EGF-mediated CTB migration/invasion. EGF induced the phosphorylation of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K)-dependent proteins, Akt and GSK-3β as well as both p42/44 MAPK and p38 mitogen-activated protein kinases (MAPK). EGF-stimulated motility was significantly reduced following the inhibition of PI3-K (P < 0.001), Akt (P < 0.01) and both p42/44 MAPK (P < 0.001) and p38 MAPKs (P < 0.001) but not the inhibition of GSK-3β. Further analysis indicated that the p38 MAPK inhibitor SB 203580 inhibited EGF-stimulated phosphorylation of Akt on serine 473, which may be responsible for the effect SB 203580 has on CTB motility. Although Akt activation leads to GSK-3β phosphorylation and the subsequent expression of β-catenin, activation of this pathway by 1-azakenpaullone was insufficient to stimulate the motile phenotype. CONCLUSION: We demonstrate a role for PI3-K, p42/44 MAPK and p38 MAPK in the stimulation of CTB cell motility by EGF, however activation of β-catenin alone was insufficient to stimulate cell motility.

Protease-activated receptor 2 sensitizes TRPV1 by protein kinase Cepsilon- and A-dependent mechanisms in rats and mice

Proteases that are released during inflammation and injury cleave protease-activated receptor 2 (PAR2) on primary afferent neurons to cause neurogenic inflammation and hyperalgesia. PAR2-induced thermal hyperalgesia depends on sensitization of transient receptor potential vanilloid receptor 1 (TRPV1), which is gated by capsaicin, protons and noxious heat. However, the signalling mechanisms by which PAR2 sensitizes TRPV1 are not fully characterized. Using immunofluorescence and confocal microscopy, we observed that PAR2 was colocalized with protein kinase (PK) Cepsilon and PKA in a subset of dorsal root ganglia neurons in rats, and that PAR2 agonists promoted translocation of PKCepsilon and PKA catalytic subunits from the cytosol to the plasma membrane of cultured neurons and HEK 293 cells. Subcellular fractionation and Western blotting confirmed this redistribution of kinases, which is indicative of activation. Although PAR2 couples to phospholipase Cbeta, leading to stimulation of PKC, we also observed that PAR2 agonists increased cAMP generation in neurons and HEK 293 cells, which would activate PKA. PAR2 agonists enhanced capsaicin-stimulated increases in [Ca2+]i and whole-cell currents in HEK 293 cells, indicating TRPV1 sensitization. The combined intraplantar injection of non-algesic doses of PAR2 agonist and capsaicin decreased the latency of paw withdrawal to radiant heat in mice, indicative of thermal hyperalgesia. Antagonists of PKCepsilon and PKA prevented sensitization of TRPV1 Ca2+ signals and currents in HEK 293 cells, and suppressed thermal hyperalgesia in mice. Thus, PAR2 activates PKCepsilon and PKA in sensory neurons, and thereby sensitizes TRPV1 to cause thermal hyperalgesia. These mechanisms may underlie inflammatory pain, where multiple proteases are generated and released.

Mechanisms of protease-activated receptor 2-evoked hyperexcitability of nociceptive neurons innervating the mouse colon

Agonists of protease-activated receptor 2 (PAR(2)) evoke hyperexcitability of dorsal root ganglia (DRG) neurons by unknown mechanisms. We examined the cellular mechanisms underlying PAR(2)-evoked hyperexcitability of mouse colonic DRG neurons to determine their potential role in pain syndromes such as visceral hyperalgesia. Colonic DRG neurons were identified by injecting Fast Blue and DiI retrograde tracers into the mouse colon. Using immunofluorescence, we found that DiI-labelled neurons contained PAR(2) immunoreactivity, confirming the presence of receptors on colonic neurons. Whole-cell current-clamp recordings of acutely dissociated neurons demonstrated that PAR(2) activation with a brief application (3 min) of PAR(2) agonists, SLIGRL-NH(2) and trypsin, evoked sustained depolarizations (up to 60 min) which were associated with increased input resistance and a marked reduction in rheobase (50% at 30 min). In voltage clamp, SLIGRL-NH(2) markedly suppressed delayed rectifier I(K) currents (55% at 10 min), but had no effect on the transient I(A) current or TTX-resistant Na(+) currents. In whole-cell current-clamp recordings, the sustained excitability evoked by PAR(2) activation was blocked by the PKC inhibitor, calphostin, and the ERK(1/2) inhibitor PD98059. Studies of ERK(1/2) phosphorylation using confocal microscopy demonstrated that SLIGRL-NH(2) increased levels of immunoreactive pERK(1/2) in DRG neurons, particularly in proximity to the plasma membrane. Thus, activation of PAR(2) receptors on colonic nociceptive neurons causes sustained hyperexcitability that is related, at least in part, to suppression of delayed rectifier I(K) currents. Both PKC and ERK(1/2) mediate the PAR(2)-induced hyperexcitability. These studies describe a novel mechanism of sensitization of colonic nociceptive neurons that may be implicated in conditions of visceral hyperalgesia such as irritable bowel syndrome.